噬菌體展示技術(shù)

1、噬菌體展示技術(shù),什么是噬菌體展示 是一項篩選技術(shù)，將外源多肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白展示在病毒顆粒的表面，而編碼該融合子的dna則位于病毒粒子內(nèi)。 表型基因型 展示肽編碼基因,使大量多肽與其dna編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，使各種靶分子（抗體、酶、細(xì)胞表面受體等）的多肽配體通過淘選得以快速鑒定,簡介,landmarks of phage display,1985 第一次發(fā)表噬菌體展示技術(shù)；展示多肽 smith gp. science.1985; 228:1315-7 1988 噬菌質(zhì)粒系統(tǒng) 1990 抗體片段的展示 1993 展示cdna文庫 1994/1995 研發(fā)了pha

2、ge two-hybrid技術(shù) 1996 首次體內(nèi)in vivo 淘選試驗 1998 噬菌體展示載體作為基因?qū)胼d體 1999 combination of phage display with high-density arrays 2001 automated phage display selection killing cancer cells by targeted drug-carrying phage nanomedicines published: 3 april 2008 bmc biotechnology 2008, 8:37 doi:10.1186/1472-6750-8

3、-37,展示系統(tǒng)display system,cell based 1、phage display 2、cell surface display cell free 1、ribosome display 2、mrna display,噬菌體展示系統(tǒng)的分類,根據(jù)噬菌體不同phage m13, f1, fdt7, t4, lamda 根據(jù)載體不同vector true phage phagemid 根據(jù)文庫不同library 隨機(jī)肽庫、cdna文庫、抗體文庫、蛋白質(zhì)文庫,m13噬菌體的組成和結(jié)構(gòu),絲狀噬菌體：m13、f1和fd。 單鏈dna病毒,6407 bp。 基因組編碼11種蛋白質(zhì)，其中5種為

4、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。與展示密切相關(guān)的有兩種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。 dna在細(xì)菌內(nèi)滾環(huán)復(fù)制，細(xì)菌不被裂解，但生長速度減慢，并且分泌大量噬菌體顆粒,life cycle of m13,piii蛋白結(jié)合于e.coli 的f纖毛; 病毒ssdna進(jìn)入細(xì)菌的胞漿合成dsdna； 以dsdna為模版合成所有的病毒蛋白，且通過滾環(huán)復(fù)制合成組裝病毒所需的ssdna。 第一代噬菌體在感染10分鐘后出現(xiàn)在培養(yǎng)液中（37）。 感染后1小時內(nèi)平均每個細(xì)胞分泌1000個噬菌體,次要衣殼蛋白piii,406 aa 組成，5個拷貝，位于噬菌體的尾部。 由三個功能區(qū)組成： n1 穿膜區(qū)：作用于e.coli細(xì)胞膜上的tola蛋白；與噬菌體的入侵

5、有關(guān)。 n2 受體結(jié)合區(qū)：負(fù)責(zé)結(jié)合f菌毛。 ct 疏水區(qū)：組裝前黏附在細(xì)菌內(nèi)膜上；與噬菌體組裝終止有關(guān)。 g1、g2:甘氨酸片段，在感染過程中，增加各個功能域之間的靈活性,主要衣殼蛋白pviii,每個病毒子含約2700個拷貝，約10%能有效地融合外源多肽或蛋白。以piii融合子方式表達(dá)的多肽是低價的，而以pviii融合子方式表達(dá)的多肽則是高價的（每個病毒子200個拷貝）。 這種高價pviii展示所增加的親和力有利于篩選到親和力非常低的配體，而低價piii展示則將篩選限制在具有較高親和力的配體上。 所有ph.d.文庫都是piii融合方式（每個病毒子展示5個拷貝的外源多肽,piii蛋白展示和pvi

6、ii蛋白展示有什么不同,pviii 展示的多肽比較小，如果太大會影響噬菌體殼蛋白的組裝。 piii只要不影響感染，可以展示300 aa的多肽。 噬菌質(zhì)粒能展示的蛋白已經(jīng)達(dá)到86 kda。 絲狀噬菌體展示系統(tǒng)一般是在包膜蛋白piii或pviii的n端融合外源多肽。 每個病毒子含個拷貝的piii蛋白，這五個蛋白都可以融合短肽而不影響噬菌體的感染力。 拷貝數(shù)不同,噬菌體質(zhì)粒方便克隆、增強(qiáng)遺傳穩(wěn)定性,噬菌體質(zhì)粒特征： 攜帶有欲在噬菌體上融合展示的蛋白基因，沒有其他噬菌體基因。 有質(zhì)粒復(fù)制起點(322 ori)和噬菌體復(fù)制起點(f1 ori用于合成ssdna)。 有包裝序列信號（packing sign

7、al）。 有供篩選的抗生素標(biāo)記基因。 helper phage：提供噬菌體質(zhì)粒復(fù)制、合成ssdna和病毒包裝所需要的所有蛋白和酶（f1 oridefect,噬菌體展示技術(shù)流程,淘選的方法親和淘選 直接包被法淘選法： 優(yōu)點：簡單直接。 缺點：偶爾會導(dǎo)致配體結(jié)合位點難以進(jìn)入 可能是由于分子的立體封阻 或者是靶分子表面的部分變性而引起 液相法：先將噬菌體庫在液相中與靶分子進(jìn)行預(yù)結(jié)合，然后將噬菌體-靶分子復(fù)合物親和捕獲于親和介質(zhì)上，如：鏈霉親和素包被的表面,建庫：例子 含編碼12肽dna序列為5cattctcactcggccgacggggc t(nnk)12ggggccgctggggcccaaactg

8、ttgaa 3，其中n代表a、t、c、g四種堿基，k代表g、t兩種堿基，(nnk)12為編碼隨機(jī)12肽部分，劃線部分含有bgl識別序列。 擴(kuò)增-嵌合-噬菌體擴(kuò)增,親和淘選,噬菌體肽庫與靶分子相互作用 洗滌去未結(jié)合的或非特異性結(jié)合的噬菌體 將特異性結(jié)合的噬菌體洗脫下來 三輪淘選后，克隆測序,噬菌體展示的應(yīng)用,抗原表位分析 制備特異性抗體 制備疫苗、多價疫苗 構(gòu)建新型的生物催化劑 如renet al (1997)將t4 dna連接酶展示于t4噬菌體，所表達(dá)的融合蛋白能夠高效連接黏性或者平末端。 有可能把催化某一代謝途徑的多種酶展示到噬菌體上，制造人工的多酶復(fù)合體?；蛘甙殉砂偕锨€酶分子的活性位點展

9、示到同一個噬菌體顆粒上，制造superenzyme。 篩選酶抑制劑是尋找抑制酶活性肽段的理想工具。dennis從肽庫中篩選到非競爭性地抑制f viia 活性的肽段,噬菌體展示的應(yīng)用,蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用 噬菌體cdna文庫與芯片相結(jié)合 (a)合成噬菌體cdna文庫。 (b)生物淘選。 (c)鋪板，挑克隆入微孔板，為制備芯片做準(zhǔn)備,噬菌體展示的應(yīng)用應(yīng)用舉例,用病人ige血清對6種不同的cdna文庫淘選，5輪后，挑出38,000個克隆，鑒別了233種蛋白，其中47種為已知，186種是新的過敏源。 煙曲霉(aspergillus fumigatus)已成為臨床上僅次于白色念珠菌的一種重要的條件致病真

10、菌。 草本枝孢(小麥黑霉病菌) cladosporium herbarum 雞腿蘑（coprinus comatus） 皮屑牙胞菌(malassezia furfur) 花生和人肺組織,crameri, r. et al. (2001) tapping allergen repertoires by advanced cloning technologies. int. arch. allergy immunol.124, 4347,噬菌體表面展示肽庫優(yōu)缺點,優(yōu)點： m13無需體外包裝 電轉(zhuǎn)化效率高, 庫容量大2.8 109 m13噬菌體純化步驟簡單，可加速淘選進(jìn)程 可避免細(xì)胞蛋白的污染 any