微生物工程實驗指導(dǎo)

1、微生物工程實驗指導(dǎo)河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程系2007年10月實驗一 細菌生長曲線的測定一、實驗?zāi)康?了解細菌生長曲線特點及測定原理；學(xué)習(xí)用比濁法測定細菌的生長曲線。二、原理 將少量細菌接種到一定體積的、適合的新鮮培養(yǎng)基中，在適宜的條件下進行培養(yǎng)，定時測定培養(yǎng)液中的菌量，以菌量的對數(shù)作縱坐標，生長時間作橫坐標，繪制的曲線叫生長曲線。它反映了單細胞微生物在一定環(huán)境條件下于液體培養(yǎng)時所表現(xiàn)出的群體生長規(guī)律。依據(jù)其生長速率的不同，一般可把生長曲線分為延緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。這四個時期的長短因菌種的遺傳性、接種量和培養(yǎng)條件的不同而有所改變。因此通過測定微生物的生長曲線，可了解各菌的生長規(guī)

2、律，對于科研和生產(chǎn)都具有重要的指導(dǎo)意義。 測定微生物的數(shù)量有多種不同的方法，可根據(jù)要求和實驗室條件選用。本實驗采用比濁法測定，由于細菌懸液的濃度與光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度計測定菌懸液的光密度來推知菌液的濃度，并將所測的OD值與其對應(yīng)的培養(yǎng)時間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線，此法快捷、簡便。三、實驗材料1. 菌種大腸桿菌（E.coli）2. 培養(yǎng)基肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，瓊脂 15-20g，水 1000mL，調(diào)pH 7.0-7.2。3. 儀器和器具721分光光度計，比色杯，恒溫搖床，無菌吸管，試管，三角瓶。四、流程種子液標記接種

3、培養(yǎng)測定五、實驗方法1. 種子液制備 取大腸桿菌斜面菌種1支，以無菌操作挑取1環(huán)菌苔，接入肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，靜止培養(yǎng)18h作種子培養(yǎng)液。2. 標記編號 取盛有50mL（5mL）無菌肉膏蛋白胨培養(yǎng)液的250mL三角瓶（18180試管）11個，分別編號為0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h。3. 接種培養(yǎng) 用2mL（1mL）無菌吸管分別準確吸取2mL（0.2mL）種子液加入已編號的11個三角瓶（試管）中（可早、晚各接種一次，則均在白天取樣，次日下午或晚上可測），于37下振蕩培養(yǎng)。然后分別按對應(yīng)時間將三角瓶（試管）取出，立即放冰箱中貯存，待培養(yǎng)結(jié)束時一同測定OD600值。4.

4、 生長量測定 將未接種的肉膏蛋白胨培養(yǎng)基傾倒入比色杯中，選用600nm波長分光光度計上調(diào)節(jié)零點，作為空白對照，并對不同時間培養(yǎng)液從0h起依次進行測定，對濃度大的菌懸液用未接種的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測定，使其OD值在0.10-0.65以內(nèi)，經(jīng)稀釋后測得的OD值要乘以稀釋倍數(shù)，才是培養(yǎng)液實際的OD值。六、結(jié)果 1. 將測定的OD值填入下表：時間(h)對照01.534681012141620OD60002. 以上述表格中的時間為橫坐標，OD600值為縱坐標，繪制大腸桿菌的生長曲線。實驗二 從土壤中分離產(chǎn)酸細菌一.實驗?zāi)康囊螅赫莆瘴⑸锓蛛x純化的方法，學(xué)習(xí)篩選培養(yǎng)基制備原理和方法。二.實

5、驗原理：從混雜的微生物群體中獲得某一種或某一株微生物的過程，稱微生物的分離與純化，本實驗采用稀釋涂布平板法分離產(chǎn)酸細菌，以碳酸鈣為底物，經(jīng)產(chǎn)酸菌酸化形成透明圈。2H+ + CO32-CO2+ H2O三.主要設(shè)備、器材：1.實驗器皿：250 mL三角瓶2只；試管7支（帶棉或硅膠塞）；9 cm培養(yǎng)皿6個；1 mL移液管7根；吸耳球1個；涂布棒3個；廢報紙、棉花、棉繩、玻璃珠若干。凈工作臺、接種環(huán)、酒精燈各一套 2.實驗試劑：瓊脂，蛋白胨，牛肉膏，CaCO3，0.5mol/L的HCl溶液，0.5mol/L的NaOH溶液，玻璃棒，pH試紙 四 實驗步驟：1. 分離用器皿的準備用報紙包扎6個培養(yǎng)皿，7根

6、1mL移液管，3個涂布棒，160 干熱滅菌60 min。（亦可121濕熱滅菌20 min）2. 無菌水的制備取1只250 mL三角瓶裝入90 mL自來水和15-20粒玻璃珠。121濕熱滅菌20 min。取6支試管各加自來水9 mL (6只一捆)。 121濕熱滅菌20 min。3. 培養(yǎng)基的制備及分離平板制作取1只250 mL三角瓶制作細菌固體培養(yǎng)基100 mL（配方：蛋白胨1.0%，牛肉膏0.3%，CaCO3 1%，瓊脂1.8-2.0%，pH 7.0），121 濕熱滅菌20 min，60恒溫箱保溫。倒平板，將培養(yǎng)基充分搖勻呈渾濁液，立即在超靜臺上將6個培養(yǎng)皿倒入細菌培養(yǎng)基（約15-16 mL）

7、。4. 土壤中產(chǎn)酸細菌的分離操作稱取校園土10 g，在超靜臺無菌操作倒入冷卻至室溫的無菌水中（90 mL蒸餾水/250mL三角瓶帶玻璃珠），搖勻5-10 min，制成菌液，用十倍稀釋法稀釋到10-6（5支無菌水試管）。分別取10-4，10-5，10-6稀釋度的稀釋液，每個稀釋度涂布兩個培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿0.1 mL（2-3滴）。35培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d，觀察單菌落周圍有無透明圈出現(xiàn)。如有透明圈說明該菌株可能產(chǎn)酸。（以下內(nèi)容選作）挑取具有透明圈的單菌落至牛肉膏蛋白胨斜面，進一步利用劃線分離法純化，做產(chǎn)酸能力實驗。從復(fù)篩培養(yǎng)基上挑取透明圈較大的單菌落接種至三角瓶液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)2天后，檢測產(chǎn)酸能力

8、（用pH試紙或酸堿滴定法）。五 根據(jù)實驗結(jié)果進行分析討論六 思考題:1. 根據(jù)實驗結(jié)果回答，如何區(qū)分平板中非產(chǎn)酸菌？2. 你覺得本實驗設(shè)計的篩選培養(yǎng)基該如何改進？實驗二 噴霧干燥酶粉中分離篩選1398中性蛋白酶生產(chǎn)菌株（選做）一、實驗?zāi)康囊笳莆瘴⑸锓蛛x純化的方法，學(xué)習(xí)篩選培養(yǎng)基的制備，滅菌等無菌操作技術(shù)。二、實驗原理中性蛋白酶是許多微生物分泌到胞外的能在pH值中性范圍內(nèi)水解蛋白質(zhì)的酶類，利用此機制以干酪素為底物，根據(jù)水解透明圈與菌落比值的大小來進行菌株的篩選。比值大的其產(chǎn)酶活力明顯增大。三、材料與方法1、試驗材料供試材料為噴霧干燥的中性蛋白酶樣品。購自市場。2、培養(yǎng)基（1）干酪素培養(yǎng)基：干

9、酪素2.0（用適量NaOH溶液加熱溶解），瓊脂1.5，pH7.0（或干酪素 4g，硫酸鎂 0.5g，氯化鉀 0.5g，硫酸鐵 0.01g，蔗糖 30g，瓊脂20g，1000mL）。（2）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏0.4，蛋白胨0.6，酵母浸出粉0.2，NaCl 0.5，瓊脂2.0，pH7.0（3）發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮4.0，蛋白胨0.1，Na2HPO412H2O 0.4，KH2PO4 0.03%，pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉1.0，蛋白胨0.5，Na2HPO412H2O 0.4%，KH2PO4 0.03%，CaCl2 0.1%，pH7.0。3、儀器與設(shè)備超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫振蕩培養(yǎng)箱

10、，恒溫水浴鍋，臺式低速離心機，721型分光光度計4、步驟（1）初篩利用樣品通過常規(guī)稀釋平板法：即取10 g樣品置于已加入90mL無菌水的三角瓶中，220 rmin旋轉(zhuǎn)搖床，20 min后取出，靜置30 s。此三角瓶中液體的濃度為10-1，再用7支分別裝有9 mL無菌水的試管進行稀釋，稀釋至10-8。將干酪素培養(yǎng)基分別倒入已滅菌的6個平皿中，每個平皿倒入10 mL左右，然后吸取0.1 mL的10-6，10-7，10-8稀釋液分別涂布于干酪素培養(yǎng)基表面，每個稀釋濃度涂布2個平皿。37 培養(yǎng)24 h。肉眼選出產(chǎn)生透明圈的菌株。將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分別倒入7個已滅菌的平皿（每個平皿倒10mL左右，置平

11、板）和7支試管（每支試管6mL左右，置斜面）內(nèi)。然后將選出來的若干株菌在平皿上劃線，每株劃一個平皿。37 培養(yǎng)24 h。取出，然后從平皿中選出其單菌落劃線至斜面試管（每個平皿對應(yīng)一支斜面試管）進行活化培養(yǎng)，37 培養(yǎng)24 h。（2）復(fù)篩面試管中分別接一環(huán)對應(yīng)于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中進行發(fā)酵培養(yǎng)。30 恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，3500rmin離心30 min，取上清液測蛋白酶活力。然后從中挑選出酶活力較高的1-3株。用發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，30 恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，3500 rmin離心30 min，取上清液測蛋白酶活力。然后從中挑選出酶活力最高的1株。5、蛋白酶活力的測定（1）原理 采用福

12、林-酚試劑法。福林酚試劑在堿性條件下可被酚類化合物還原呈藍色（鉬藍和鎢藍混合物），由于蛋白質(zhì)分子中有含酚基的氨基酸（如酪氨酸，色氨酸等），可使蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物呈上述反應(yīng)。因此可利用此原理測定蛋白酶活力。通常以酪蛋白為底物，在一定pH值和溫度條件下，同酶液反應(yīng)，經(jīng)一段時間后終止酶反應(yīng)，經(jīng)離心或過濾除去酪蛋白等沉淀物后取上清液，用Na2CO3堿化，再加入福林-酚試劑顯色，藍色的深淺與濾液中生成產(chǎn)物酪氨酸量成正比，酪氨酸含量用分光光度計在660 nm處測定，從而計算出蛋白酶活力。（2）試劑福林-酚試劑在2000mL磨口回流瓶中，加入100g鎢酸鈉（Na2WO42H2O），25g鉬酸鈉（Na2MoO

13、42H2O）及700mL蒸餾水，再加50mL85%磷酸，100mL濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時，回流結(jié)束時，加入50g 硫 酸 鋰（Li2SO4），50mL蒸餾水及數(shù)滴濃溴水（99），開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加濃溴水的步驟）。定容至1000mL，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。此溶液使用時加兩倍蒸餾水稀釋，即成已稀釋的福林試劑。0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液精確稱取TCA65.4g ，加去離子水定容至1000 mL。0.4mo1/L碳酸鈉溶液精確稱取無水碳酸鈉42.4 g，加去離于水溶解后，定容至1000 mL

14、。pH7.2磷酸鹽緩沖液稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO42H2O)31.2 g，定容至1000 mL，即成0.2 mol/L溶液(A液)。稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO412H2O)71.63 g，定容至1000 mL，即成0.2 mol/L溶液(B液)。取A 液28 mL 和B 液72 mL，再用蒸餾水稀釋1倍，即成0.1 mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液。2%酪蛋白溶液 準確稱取干酪素2 g，稱準至0.002 g，加入0.1 mol/L氫氧化鈉10 mL，在水浴中加熱使溶解(必要時用小火加熱煮沸)，然后用pH7.2磷酸鹽緩沖液定容至100 mL即成。配制后應(yīng)及時使用或放入冰箱內(nèi)保存，否則極

15、易繁殖細菌，引起變質(zhì)。100 g/mL酪氨酸溶液精確稱取在105 烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000 g，用1 molL鹽酸溶液60 mL溶解后，用蒸餾水定容至100 mL，即為1mg/mL酪氨酸標準溶液。吸取1 mgmL酪氨酸標準溶液10 mL，用0.1 molL鹽酸溶液定容至100 mL，即得到100g/mL的酪氨酸標準溶液。此溶液配成后也應(yīng)及時使用或放入冰箱內(nèi)保存，以免繁殖細菌而變質(zhì)。（3）酪氨酸標準曲線的繪制取18支試管分成6組(每組3支，平行樣)，編號，按下表分別加入標準酪氨酸、去離子水、0.4 moL/L的碳酸鈉和福林-酚試劑，混勻后，放入40水浴保溫20min，然后在721型分光

16、光度計上進行比色測定(波長660 nm)，以濃度為0 g/mL酪氨酸反位液做空白對照。管號標準酪氨酸(mL)去離子水(mL)Na2CO3(mL)福林一酚試劑(mL)酪氨酸含量(g/mL)101.051020.20.8512030.40.6514040.60.4516050.80.2518061.0051100（4）樣品酶活力的測定取4支試管編號(1號為空白對照)，分別加入酶液1mL，1號管立即加入0.4mol/LTCA溶液2mL，使酶失活，另3支樣品加入1 mLpH7.2、濃度為2%酪蛋白底物緩沖液(如測酸性蛋白酶活力加pH 3.6、2%酪蛋白底物緩沖液)，迅速混勻，并立即放入40 恒溫水浴準

17、確計時，保溫10 min后，立即加入0.4 moL/LTCA溶液2 mL，終止反應(yīng)，同時向1號空白管中加入1 mL 2%酪蛋白底物緩沖液，搖勻，繼續(xù)置于水浴中保溫20 min，取出離心或過濾除去剩余酪蛋白及酶蛋白沉淀物，然后取各試管濾液1 mL，分別移入另4支試管中，再加入0.4 mol/L碳酸鈉溶液5 mL和己稀釋的福林-酚試劑1 mL，搖勻，保溫顯色20 min后，進行比色測定(波長660 nm)。對照標準曲線，計算酪氨酸含量。（5）蛋白酶活力計算： 蛋白酶活力=A4N/10。 式中：A表示對照標準曲線得出的酪氨酸釋放量；4表示反應(yīng)液總體積；N表示酶液的稀釋倍數(shù)；10表示反應(yīng)時間10 mi

18、n；蛋白酶活性定義:在一定pH值(pH 7.0)和40 溫度條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 g酪氨酸定義為一個蛋白酶活力單位。思考題： 某菌株的透明圈的大小可以完全反映該菌株的蛋白酶活力大小嗎？說明理由。實驗三 黑曲霉三角瓶固態(tài)發(fā)酵實驗一、概述 固體發(fā)酵法作為一個古老的生物工藝早在幾千年前已在食品和調(diào)味品上得到應(yīng)用。與液體發(fā)酵相比，固態(tài)發(fā)酵操作簡易、工藝簡單、能耗低，無廢水廢渣產(chǎn)生，不造成對環(huán)境的二次污染。因此，固態(tài)發(fā)酵法目前在生產(chǎn)有機酸、發(fā)酵食品、酶制劑以及動植物廢棄物、垃圾的處理和利用等方面有著廣泛的應(yīng)用。利用曲霉屬菌種，通過固體或液體發(fā)酵法生產(chǎn)酸性蛋白酶，我國在七十年代末和八十年代初作過

19、一些研究，但此后有關(guān)這方面研究的報導(dǎo)極少見到。近年來，隨著酸性蛋白酶應(yīng)用范圍的擴大，尤其是作為一種新型的生物飼料添加劑，在飼料工業(yè)中表現(xiàn)出來的潛在功能，越來越引起人們對它的研究興趣。二、實驗?zāi)康呐c要求通過三角瓶固態(tài)培養(yǎng)黑曲霉，掌握固態(tài)培養(yǎng)微生物的原理和技術(shù)，并掌握蛋白酶的分析方法。 三、菌種和培養(yǎng)基 1、 菌種：黑曲霉（上海華東理工大學(xué)贈送） 2、培養(yǎng)基：（1）斜面培養(yǎng)基土豆培養(yǎng)基或察氏培養(yǎng)基。（土豆培養(yǎng)基：取去皮馬鈴薯200克，切成小塊，加水1000毫升煮沸30分鐘，濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1000毫升，加葡萄糖20克，瓊脂15克，溶化后分裝，15磅滅菌30分鐘。） （2）固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基

20、麩皮 8g，豆餅粉 2g，(NH4)2SO2 0.2g，水11mL，121滅菌45分鐘。四、儀器與設(shè)備 三角瓶100個、普通天平4個，分析天平1臺，滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺接種鏟8個，100mL量筒8個，10mL移液管8支，塑料盆8個五、實驗過程 原始斜面菌種斜面接種培養(yǎng)（28、7天）麩皮試管培養(yǎng)（28、7天）三角瓶培養(yǎng)(28、72h)測定酸性蛋白酶酶活力，觀察孢子形態(tài)。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后將培養(yǎng)基拍散，冷卻至室溫，接入麩皮試管種子，混勻，于恒溫培養(yǎng)箱中28-30靜置培養(yǎng)72小時，取樣測定酶活力。 實驗分四組：組：裝料量對酶活力的影響。取53（2）個250mL三角瓶，按以上固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基

21、，分別按下列裝料量（按干料計算）裝料：5g/瓶；10 g/瓶；15 g/瓶；20 g/瓶；25 g/瓶。接種培養(yǎng)72小時后，測定每一瓶的發(fā)酵酶活力，計算三瓶平均數(shù)。組：碳氮比對酶活力的影響。取53（2）個250mL三角瓶，麩皮和豆餅粉的比例按下列配比：6:4；7:3；8:2；9:1；10:0。接種培養(yǎng)72小時后，測定每一瓶的發(fā)酵酶活力，計算三瓶平均數(shù)。組：料水比對酶活力的影響。取53（2）個250mL三角瓶，麩皮和豆餅粉的比例按給出的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，但料水比按以下比例配制：10:8；10:9；10:10；10:11；10:12，接種培養(yǎng)72小時后，測定每一瓶的發(fā)酵酶活力，計算三瓶平均數(shù)。組：酶

22、活力的時間變化曲線。取53（2）個250mL三角瓶，麩皮和豆餅粉的比例按給出的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，接種培養(yǎng)，分別于接種后24、36、48、60、72小時取樣，測定每一瓶的發(fā)酵酶活力，計算三瓶平均數(shù)。實驗四 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵曲的酸性蛋白酶活力測定（承接試驗三）一、實驗?zāi)康呐c要求：1.學(xué)習(xí)固態(tài)發(fā)酵胞外產(chǎn)物（酶）的提取方法2.掌握福林-酚試劑法測定蛋白酶活力的步驟與方法二、蛋白酶活力的測定原理：采用福林-酚試劑法。福林-酚試劑在堿性條件下可被酚類化合物還原呈藍色(鉬藍和鎢藍混合物)，由于蛋白質(zhì)分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物呈上述反應(yīng)。因此可利用此原理測定蛋白酶活力。通

23、常以酪蛋白為底物，在一定pH值和溫度條件下，同酶液反應(yīng)，經(jīng)一段時間后終止酶促反應(yīng)，經(jīng)離心或過濾除去酪蛋白等沉淀物后取上清液，用Na2CO3堿化，再加入福林-酚試劑顯色，藍色的深淺與濾液中生成產(chǎn)物酪氨酸量成正比；酪氨酸含量用分光光度計在680nm波長處測定，從而計算出蛋白酶的活力。 三、儀器、設(shè)備、物品：分析天平，電爐，分光光度計，恒溫水浴鍋，恒溫箱，試管架試管（18180）200支，小燒杯100個，紗布1卷，玻璃棒8，記號筆8，四、試劑配制1、福林-酚試劑 （磷鎢酸與磷鉬酸的混合物）向2000mL的磨口回流瓶中加入100g鎢酸鈉(Na2WO42H2O)、25g鉬酸鈉及700mL的去離子水，再加

24、入50mL85%的磷酸及濃鹽酸l00mL，充分混合后，接上回流冷凝管，以文火回流10h，結(jié)束后再加入50g的硫酸鋰(LiSO4)、50mL去離子水及數(shù)滴濃溴水（99%），再繼續(xù)沸騰15min，以驅(qū)除過量的溴，冷卻后濾液呈黃綠色(如仍呈綠色，需再重復(fù)滴加溴水的步驟)，加去離子水定容至1000mL，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中，貯于冰箱中可長期保存?zhèn)溆?。此溶液使用時可按1:2比例用去離子水稀釋（一份福林試劑與兩份水混合）。 2、 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液 精確稱取TCA65.4g，加去離子水定容至1000mL。 3、0.4mo1/L碳酸鈉溶液 精確稱取無水碳酸鈉42.4g，加去離于水溶

25、解后，定容至1000mL。 4、乳酸緩沖液（pH=3.0）的制備甲液 稱取乳酸（8090%）10.6g，加水溶解并定容至1000mL。乙液 稱取乳酸鈉（70%）16g，加水溶解并定容至1000 mL。使用溶液 取甲液8mL，加乙液1mL，混勻，稀釋一倍，即成0.05mol/L乳酸緩沖液。5、2%酪素溶液取酪素2.000g，精確至0.001g，用濃乳酸2-3滴潤濕后，加入適量的乳酸緩沖液約80mL，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)入100mL的容量瓶中，用乳酸緩沖液稀釋至刻度，冰箱中貯存。有效期為三天。6、100g/mL標準酪氨酸溶液 精確稱取預(yù)先于105干燥23h的L-酪氨酸0

26、.1g，逐步加入6mL 1NHCl使之溶解，用0.2NHCl定容至100mL，即得1mg/mL的酪氨酸溶液，取此溶液10mL，用0.2NHCl定容至100mL即成100g/mL標準酪氨酸溶液五、標準曲線繪制為了確定酪氨酸濃度與OD值的對應(yīng)關(guān)系，須事先以不同濃度的標準酪氨酸與福林試劑反應(yīng)顯色，測定OD值并繪制標準曲線。1、不同濃度的標準酪氨酸按下表配制：試管號100g/mL標準酪氨酸溶液（mL）蒸餾水（mL）酪氨酸的濃度（g/mL）對照01001191022820337304464055550664602、標準曲線的繪制將上表配制的各種濃度酪氨酸溶液各取1mL（需做平行）分別加入0.4mol/L

27、Na2CO3溶液5mL，稀福林試劑1mL，置40水浴中顯色20min，以721分光光度計在波長680nm測定OD值，用0.2NHCl做對照，以O(shè)D值為縱坐標，酪氨酸的濃度為橫坐標，繪制標準曲線。此曲線應(yīng)是通過零點的直線，然后計算K值標準曲線中OD為1時的酪氨酸濃度（g/mL）。K值一般應(yīng)在95100范圍內(nèi)。六、黑曲霉曲中酸性蛋白酶活力的測定1、待測酶液的制備精確稱取曲塊5g，加水100mL，在40水浴中充分攪拌30min，充分溶出酶蛋白，然后過濾，濾液用緩沖液稀釋待測（稀釋倍數(shù)應(yīng)使水解底物后與福林試劑顯色的OD值在0.20.4范圍內(nèi)）。酶曲稀釋倍數(shù)可參考下表酶活力u/g總倍數(shù)第一次稀釋第二次稀

28、釋20002005g50mL(10倍)0.5mL10mL(20倍)30002502g50mL(25倍)1mL10mL(10倍)40004005g50mL(10倍)5mL200mL(40倍)50005002g50mL(25倍)0.5mL10mL(20倍)1000010002g50mL(25倍)5mL200mL(40倍)2、樣品酶活的測定（1）先將酪素溶液放入400.5的恒溫水浴中，預(yù)熱5min。（2）按下列程序操作：試管B（空白）加酶液1mL400.5,2min加酪素1.00mL（搖勻）400.5，10min加三氯醋酸2.00mL(搖勻)取出靜止10min，過濾取1.00mL濾液加碳酸鈉溶液5.

29、0mL加富林試劑使用液1.00mL400.5顯色20min于680nm波長，用10mm比色皿測吸光度試管A（酶試樣，需作平行）加酶液1mL加酪素1.00mL（搖勻）400.5，10分鐘加三氯醋酸2.00mL(搖勻)取出靜止10min，過濾取1.00mL濾液加富林試劑使用液1.00mL400.5,2min加碳酸鈉溶液5.0mL于680nm波長，用10mm比色皿測吸光度400.5顯色20min3、蛋白酶活力的計算蛋白酶活力X=(4/l0)KODN。 式中: 44mL反應(yīng)液取出1mL；10反應(yīng)時間10min；K標準曲線中OD為1時所相當(dāng)?shù)睦野彼釢舛龋╣/mL）N酶曲的稀釋倍數(shù)蛋白酶活性定義:在一定p

30、H值(pH3.0)和40溫度條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1g酪氨酸定義為一個蛋白酶活力單位。七、數(shù)據(jù)處理用表格來表示發(fā)酵過程中裝料量、碳氮比、料水比對酶活力的影響。用表格或曲線來表示酶活力隨時間的變化。八、思考題影響固體發(fā)酵的因素還有哪些？本次實驗做的為單因子試驗，能否用多因子實驗如正交試驗法？2008-2009第一學(xué)期開設(shè)本實驗課的班級及人數(shù)：實驗班級生物技術(shù)05級生物技術(shù)（現(xiàn)科）05級生物技術(shù)及應(yīng)用（專）06級人數(shù)35444個班課時數(shù)1616162009-2010第一學(xué)期開設(shè)本實驗課的班級及人數(shù)：實驗班級生物技術(shù)06級生物技術(shù)（現(xiàn)科）06級生物技術(shù)及應(yīng)用（專）07級人數(shù)521082個班課時

31、數(shù)1616162010-2011第一學(xué)期開設(shè)本實驗課的班級及人數(shù)：實驗班級生物技術(shù)07級生物技術(shù)（現(xiàn)科）07級人數(shù)2個班30人5個班119人課時數(shù)16162011-2012第一學(xué)期開設(shè)本實驗課的班級及人數(shù)：實驗班級生物技術(shù)08級生物技術(shù)（現(xiàn)科）08級人數(shù)2個班57人6個班158人課時數(shù)1616實驗五 土霉素搖瓶發(fā)酵實驗（設(shè)計型實驗）一、實驗?zāi)康模?、 熟悉放線菌的微生物學(xué)特性及培養(yǎng)方法2、 了解和掌握種子制備和搖瓶發(fā)酵技術(shù)和方法3、 了解抗生素發(fā)酵的一般規(guī)律和代謝調(diào)控理論4、 熟悉和掌握常用的比色分析方法的操作技術(shù)5、 掌握分光光度法測定發(fā)酵樣品土霉素效價的方法二、實驗原理土霉素是四環(huán)類抗生素

32、，其在結(jié)構(gòu)上含有四并苯的基本母核，隨環(huán)上取代基的不同或位置的不同而構(gòu)成不同種類的四環(huán)素類抗生素。其結(jié)構(gòu)和命名如圖。R1R2R3R4R5土霉素HOHCH3OHH四環(huán)素HOHCH3HH金霉素ClOHCH3HH去甲基金霉素ClOHHHH多西環(huán)素HHCH3OHH米諾環(huán)素N(CH3)2HHHH美他環(huán)素H=CH2-OHCH2(NH)CH(COOH)(CH2)4NH2土霉素具有廣譜抗菌性，能抑制多種細菌、較大的病毒及一部分原蟲。土霉素能抑制細菌的生長，在濃度高的時候也具有殺菌的作用。它的作用機制是干擾蛋白質(zhì)的合成。由于它的毒副作用小，所以其在醫(yī)療上用途廣泛，主要是應(yīng)用于呼吸道和腸道感染。土霉素是由龜裂鏈霉菌

33、產(chǎn)生的，屬于放線菌中的鏈霉菌屬，它們具有發(fā)育良好的菌絲體，菌絲體分支，無隔膜，直徑約0.41.0米，長短不一，多核。菌絲體有營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲和孢子絲之分，孢子絲再形成分生孢子。而龜裂鏈絲菌的菌落灰白色，后期生褶皺，成龜裂狀。菌絲成樹枝分支，白色，孢子灰白色，柱形。土霉素是典型的次級代謝產(chǎn)物，其發(fā)酵的特點之一就是分批過程分為菌體的生長期、產(chǎn)物期和菌體期三個階段。龜裂鏈絲菌的生長和土霉素的生物合成受到許多發(fā)酵條件的影響：溫度、發(fā)酵pH值、溶氧、接種量、泡沫等。同時還受到一些代謝調(diào)控機制的控制：磷酸鹽的調(diào)節(jié)作用、ATP的調(diào)節(jié)和產(chǎn)生菌生長速率的調(diào)節(jié)等。三、儀器與材料（一）培養(yǎng)基1、斜面高氏一號培養(yǎng)基

34、(100mL灌裝斜面若干支)可溶性淀粉2% 氯化鈉0.05%(配成1%溶液，使用時5mL/100mL) 硝酸鉀0.1% 三水磷酸氫二鉀0.05%(配成1%溶液，使用時5mL/100mL) 七水硫酸鎂0.05%(配成1%溶液，使用時5mL/100mL) 七水硫酸亞鐵0.001%(配成1%溶液，使用時0.1mL/100mL) 瓊脂1.5%-2.0% pH：7.4-7.62、母瓶培養(yǎng)基淀粉3%(1.5g/50mL) 黃豆餅粉0.3%(0.15g/50mL) 硫酸銨0.4%(0.2g/50mL) 碳酸鈣0.5%(0.25g/50mL) 玉米漿0.4%(0.2mL/50mL) 氯化鈉0.5%(0.2g/

35、50mL) 磷酸二氫鉀0.015%(配成1%溶液，使用時0.75mL/50mL) pH：7.0-7.23、發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉15%( 7.5g/50mL) 黃豆餅粉2%(1g/50mL) 硫酸銨1.4%(0.7g/50mL) 碳酸鈣1.4%(0.7g/50mL) 氯化鈉0.4%(0.2g/50mL) 玉米漿0.4%(0.2mL/50mL) 磷酸二氫鉀0.01% (配成1%溶液，使用時0.5mL/50mL) 氯化鈷10g/mL(配成1mg/mL溶液，使用時0.5mL/50mL) 消沫劑0.01% 淀粉酶0.1%-0.2%(0.1g/50mL) pH7.0-7.2（二）實驗菌種：龜裂鏈霉菌，本實驗室保

36、藏（三）儀器：玻璃試管（18180）、試管架8、吸管（1mL，2mL，10mL）、吸耳球、離心管（7 mL）、容量瓶、燒杯、三角瓶360個（250 mL）、量筒（250mL，500mL，1000mL）、玻璃棒、試紙、塑料漏斗、電爐、接種鏟（針）、恒溫搖床、恒溫箱、臺秤等四、實驗題目1、溶氧對土霉素發(fā)酵的影響：取43個250mL的三角瓶，培養(yǎng)基裝量： 30mL/250mL；40mL/250mL；50mL/250mL；60mL/250mL。接種后的發(fā)酵瓶于30恒溫室搖床上搖67天，轉(zhuǎn)速為230轉(zhuǎn)/分。測定發(fā)酵液的效價。2、培養(yǎng)基中磷量對土霉素發(fā)酵的影響：取53個250mL的三角瓶，培養(yǎng)基裝量50m

37、L/250mL，培養(yǎng)基中磷酸二氫鉀的含量分別為：0.005%、0.01%、0.02%、0.04%、0.1%。培養(yǎng)后測定發(fā)酵液的效價。取三個平行樣的平均數(shù)。3、接種量對土霉素發(fā)酵的影響。取53個250mL的三角瓶，培養(yǎng)基裝量50mL/250mL，接種量分別設(shè)計為：2%、5%、10%、15%、20%。培養(yǎng)后測定發(fā)酵液的效價。取三個平行樣的平均數(shù)。4、碳源、氮源濃度對土霉素發(fā)酵的影響：取63個250mL的三角瓶，培養(yǎng)基裝量50mL/250mL。淀粉10%、淀粉15%、淀粉20% ；黃豆餅粉1%、黃豆餅粉2%、黃豆餅粉3%。培養(yǎng)后測定發(fā)酵液的效價。取三個平行樣的平均數(shù)。五、實驗步驟1斜面孢子的制備無菌

38、條件下，從冷藏的產(chǎn)生菌的斜面孢子中，刮取適量孢子涂在高氏斜面上，然后置36.537的恒溫箱培養(yǎng)3天，再置30的恒溫室培養(yǎng)1天。2 種子的制備（1）搖瓶種子培養(yǎng)基的配制 按母瓶培養(yǎng)基成分配比，配制培養(yǎng)基，并加淀粉酶液化后，再加入CaCO3，冷卻后調(diào)pH值，分裝，包裝滅菌。（2）接種在超凈工作臺上，將長好的斜面孢子用無菌接種鏟挖塊約2cm2，接種于滅過菌的搖瓶種子培養(yǎng)基中。（3）培養(yǎng)將接種好的種子搖瓶于30恒溫室搖床上，轉(zhuǎn)速為230轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)28小時左右。3 發(fā)酵（1） 發(fā)酵瓶培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基配方以發(fā)酵培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)，依據(jù)實驗題目不同而設(shè)計。搖瓶裝量依據(jù)實驗題目而設(shè)計。制備方法同種子瓶。（2

39、） 接種在超凈工作臺上，將培養(yǎng)28小時的搖瓶種子接種于發(fā)酵瓶中，接種量一般為10%或依據(jù)實驗題目而設(shè)計。（3）培養(yǎng)將接種后的發(fā)酵瓶于30恒溫室搖床上搖67天，轉(zhuǎn)速為230轉(zhuǎn)/分。六、實驗報告寫出實驗方案、具體實驗方法和實驗過程。七、思考題1.為什么種子搖瓶培養(yǎng)28小時左右？2.分析發(fā)酵培養(yǎng)基成分，龜裂鏈霉菌發(fā)酵土霉素的碳源和氮源有哪些？3.培養(yǎng)基加淀粉酶的目的是什么？消沫劑的作用是什么？為什么搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基可以不加消沫劑？關(guān)于淀粉液化：1.酶法液化原理： 淀粉的酶法液化是以-淀粉酶為催化劑，該酶作用于淀粉的-1,4糖苷鍵，從內(nèi)部隨機地水解淀粉，從而迅速將淀粉水解為糊精及少量麥芽糖，所以也稱內(nèi)切

40、淀粉酶。淀粉受到-淀粉酶的作用后，其碘色反應(yīng)發(fā)生如下變化：藍紫紅淺紅不顯色(即碘原色)。2.淀粉液化方法：配制15-30的淀粉乳，調(diào)節(jié)pH值至6.5，加入氯化鈣(對固形物0.2)，加入液化酶(12-20U/g淀粉)，在劇烈攪拌下，先加熱至72，保溫15min，再加熱至80-90，并維持30-60min，以達到所需的液化程度。實驗六 土霉素搖瓶發(fā)酵的效價測定（設(shè)計型實驗）一、實驗原理關(guān)于四環(huán)素族類抗生素的測定，目前多用微生物測定法及高效液相色譜法。 可用的物理化學(xué)方法有： FeCl3 比色法、鹽酸比色法、紫外分光光度法、熒光法及近年內(nèi)文獻所報道的用流動注射分析法（ FIA ）。 土霉素化驗采用可

41、見光分光光度法測定。土霉素在酸性條件下，能與FeCl3作用生成橙褐色的物質(zhì)，根據(jù)有色物質(zhì)對光的吸收定律，在480 nm處測定樣品的吸光度，然后對照標準濃度-吸光度曲線，以計算土霉素的濃度。土霉素與金屬離子生成有色配位化合物Fe2+褐色橙褐色深褐色紅棕色鹽酸多西環(huán)素鹽酸土霉素鹽酸金霉素鹽酸四環(huán)素FeCl3二、實驗步驟（一）發(fā)酵液狀態(tài)觀察：粘度、顏色、氣味、菌絲形態(tài)（二）發(fā)酵樣品預(yù)處理：發(fā)酵瓶搖勻，將少量倒入小燒杯，測pH。用9mol/L的鹽酸溶液酸化pH至1.7-2.0攪拌10分鐘。取5mL酸化液至7mL離心管，6000轉(zhuǎn)離心4分鐘，取上清液，備測。（三）發(fā)酵樣品土霉素效價的測定：采用分光光度法

42、測定其效價。1.土霉素標準曲線的繪制：將土霉素標準樣用0.01mol/L的鹽酸配成1000u/mL的標準液。用2mL移液管分別取標準液0.4mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL于七支試管中，加0.01mol/L的鹽酸使全量均為10mL。再向每支試管中加0.05%（g/mL）的三氯化鐵溶液10mL，搖勻，靜置20分鐘。另取樣同上，加0.01mol/L的鹽酸使全量為20mL，搖勻，作為空白，在480nm的波長下測定吸光度值。以土霉素效價為縱坐標，以吸光度值為橫坐標繪制作標準曲線。2.發(fā)酵液效價的測定：用移液管吸取適宜稀釋倍數(shù)（使稀釋后效價在標準曲線范圍內(nèi)）的

43、濾液1mL稀釋液于試管中，準確加入0.01mol/L的鹽酸，使全量為10mL。再加入0.05%（g/mL）的三氯化鐵溶液10mL，使全量為20mL。另取一支試管，加入1mL稀釋液，再加入0.01mol/L的鹽酸19mL，使全量為20mL，搖勻，放置20分鐘，作為空白。在480nm的波長下測兩種液體的吸光度。三、實驗報告1.自己設(shè)計表格記錄實驗數(shù)據(jù)。2.用圖、表匯總實驗結(jié)果。3.對實驗結(jié)果作出分析和討論。四、思考題1、寫出土霉素發(fā)酵工藝流程圖。2、通過查閱資料，試述次級代謝產(chǎn)物的發(fā)酵規(guī)律和代謝調(diào)節(jié)機制。試劑配制如下表試劑名稱配置方法10%（g/mL）三氯化鐵溶液稱取三氯化鐵500g（FeCl3H

44、2O稱830克）用少量蒸餾水溶解過濾，加濃鹽酸30mL，加蒸餾水至4000毫升，根據(jù)初算結(jié)果用2mol/L的鹽酸和蒸餾水調(diào)節(jié)酸度至2mol/L和濃度為10%。0.05% (g/mL)三氯化鐵溶液量取10%三氯化鐵溶液5mL，2mol/L鹽酸5mL，加蒸餾水至1000mL，搖勻9mol/L鹽酸溶液量取蒸餾水500mL于2000mL試劑瓶中，加濃鹽酸1500mL，搖勻2mol/L鹽酸溶液量取濃鹽酸16.7mL加蒸餾水至100mL，搖勻0.01mol/L鹽酸溶液量取2mol/L的鹽酸5mL加蒸餾水至1000mL，搖勻1000u/mg土霉素標準液在分析天平上稱取已知u/mL（生物效價）土霉素標準品W克

45、，加1mol/L鹽酸4mL，溶解完全后（約5min），加蒸餾水至200mL，放冰箱備用實驗七 中性蛋白酶產(chǎn)生菌株的篩選一、實驗?zāi)康囊螅赫莆瘴⑸锓蛛x純化的方法，學(xué)習(xí)篩選培養(yǎng)基的制備，滅菌等無菌操作技術(shù)，棉塞等過濾介質(zhì)的制作。二、實驗原理中性蛋白酶是許多微生物分泌到胞外的能在pH值中性范圍內(nèi)水解蛋白質(zhì)的酶類，利用此機制以干酪素為底物，根據(jù)水解透明圈與菌落比值的大小來進行菌株的篩選。比值大的其產(chǎn)酶活力明顯增大。三、材料與方法1.1材料1.1.1試驗材料供試材料為土壤樣品。采自本校二食堂附近。1.1.2培養(yǎng)基（1）干酪素培養(yǎng)基：干酪素2.0（用適量NaOH溶液加熱溶解），瓊脂1.5，pH7.0（或

46、干酪素 4g，硫酸鎂 0.5g，氯化鉀 0.5g，硫酸鐵 0.01g，蔗糖 30g，瓊脂20g， 1000mL）。（2）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏0.4，蛋白胨0.6，酵母浸出粉0.2，NaCl 0.5，瓊脂2.0，pH7.0（3）發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮4.0，蛋白胨0.1，Na2HPO412H2O 0.4，KH2PO4 0.03%，pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉1.0，蛋白胨0.5，Na2HPO412H2O 0.4%，KH2PO4 0.03%，CaCl2 0.1%，pH7.0。1.2主要儀器與設(shè)備超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫振蕩培養(yǎng)箱，恒溫水浴鍋，臺式低速離心機，721型分光光度計1.3方法步

47、驟1.3.1菌種的分離純化與篩選初篩：從土壤中采集樣品，通過常規(guī)稀釋平板法，即取10 g土壤樣品置于已加入90mL無菌水的三角瓶中，220 rmin旋轉(zhuǎn)搖床，20 min后取出，靜置30 s。此三角瓶中液體的濃度為10-1，再用7支分別裝有9 mL無菌水的試管進行稀釋，稀釋至10-8。將干酪素培養(yǎng)基分別倒入已滅菌的6個平皿中，每個平皿倒入10 mL左右，然后吸取0.1 mL的10-6，10-7，10-8稀釋液分別涂布于干酪素培養(yǎng)基表面，每個稀釋濃度涂布2個平皿。37 培養(yǎng)24 h。肉眼選出產(chǎn)生透明圈的菌株。將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分別倒入7個已滅菌的平皿（每個平皿倒10mL左右，置平板）和7支試管

48、（每支試管6mL左右，置斜面）內(nèi)。然后將選出來的若干株菌在平皿上劃線，每株劃一個平皿。37 培養(yǎng)24 h。取出，然后從平皿中選出其單菌落劃線至斜面試管（每個平皿對應(yīng)一支斜面試管）進行活化培養(yǎng)，37 培養(yǎng)24 h。復(fù)篩：從斜面試管中分別接一環(huán)對應(yīng)于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中進行發(fā)酵培養(yǎng)。30 恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，3500rmin離心30 min，取上清液測蛋白酶活力。然后從中挑選出酶活力較高的1-3株。用發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，30 恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，3500 rmin離心30 min，取上清液測蛋白酶活力。然后從中挑選出酶活力最高的1株。2.中性蛋白酶活力的測定2.1原理 采用福林-酚試劑

49、法。福林酚試劑在堿性條件下可被酚類化合物還原呈藍色（鉬藍和鎢藍混合物），由于蛋白質(zhì)分子中有含酚基的氨基酸（如酪氨酸，色氨酸等），可使蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物呈上述反應(yīng)。因此可利用此原理測定蛋白酶活力。通常以酪蛋白為底物，在一定pH值和溫度條件下，同酶液反應(yīng)，經(jīng)一段時間后終止酶反應(yīng)，經(jīng)離心或過濾除去酪蛋白等沉淀物后取上清液，用Na2CO3堿化，再加入福林-酚試劑顯色，藍色的深淺與濾液中生成產(chǎn)物酪氨酸量成正比，酪氨酸含量用分光光度計在660 nm處測定，從而計算出蛋白酶活力。2.2試劑2.2.1福林-酚試劑在2000mL磨口回流瓶中，加入100g鎢酸鈉（Na2WO42H2O），25g鉬酸鈉（Na2MoO42