微生物工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、微生物工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程系2007年10月實(shí)驗(yàn)一 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解細(xì)菌生長(zhǎng)曲線特點(diǎn)及測(cè)定原理；學(xué)習(xí)用比濁法測(cè)定細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。二、原理 將少量細(xì)菌接種到一定體積的、適合的新鮮培養(yǎng)基中，在適宜的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，定時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液中的菌量，以菌量的對(duì)數(shù)作縱坐標(biāo)，生長(zhǎng)時(shí)間作橫坐標(biāo)，繪制的曲線叫生長(zhǎng)曲線。它反映了單細(xì)胞微生物在一定環(huán)境條件下于液體培養(yǎng)時(shí)所表現(xiàn)出的群體生長(zhǎng)規(guī)律。依據(jù)其生長(zhǎng)速率的不同，一般可把生長(zhǎng)曲線分為延緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。這四個(gè)時(shí)期的長(zhǎng)短因菌種的遺傳性、接種量和培養(yǎng)條件的不同而有所改變。因此通過(guò)測(cè)定微生物的生長(zhǎng)曲線，可了解各菌的生長(zhǎng)規(guī)

2、律，對(duì)于科研和生產(chǎn)都具有重要的指導(dǎo)意義。 測(cè)定微生物的數(shù)量有多種不同的方法，可根據(jù)要求和實(shí)驗(yàn)室條件選用。本實(shí)驗(yàn)采用比濁法測(cè)定，由于細(xì)菌懸液的濃度與光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度計(jì)測(cè)定菌懸液的光密度來(lái)推知菌液的濃度，并將所測(cè)的OD值與其對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長(zhǎng)曲線，此法快捷、簡(jiǎn)便。三、實(shí)驗(yàn)材料1. 菌種大腸桿菌（E.coli）2. 培養(yǎng)基肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，瓊脂 15-20g，水 1000mL，調(diào)pH 7.0-7.2。3. 儀器和器具721分光光度計(jì)，比色杯，恒溫?fù)u床，無(wú)菌吸管，試管，三角瓶。四、流程種子液標(biāo)記接種

3、培養(yǎng)測(cè)定五、實(shí)驗(yàn)方法1. 種子液制備 取大腸桿菌斜面菌種1支，以無(wú)菌操作挑取1環(huán)菌苔，接入肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，靜止培養(yǎng)18h作種子培養(yǎng)液。2. 標(biāo)記編號(hào) 取盛有50mL（5mL）無(wú)菌肉膏蛋白胨培養(yǎng)液的250mL三角瓶（18180試管）11個(gè)，分別編號(hào)為0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h。3. 接種培養(yǎng) 用2mL（1mL）無(wú)菌吸管分別準(zhǔn)確吸取2mL（0.2mL）種子液加入已編號(hào)的11個(gè)三角瓶（試管）中（可早、晚各接種一次，則均在白天取樣，次日下午或晚上可測(cè)），于37下振蕩培養(yǎng)。然后分別按對(duì)應(yīng)時(shí)間將三角瓶（試管）取出，立即放冰箱中貯存，待培養(yǎng)結(jié)束時(shí)一同測(cè)定OD600值。4.

4、 生長(zhǎng)量測(cè)定 將未接種的肉膏蛋白胨培養(yǎng)基傾倒入比色杯中，選用600nm波長(zhǎng)分光光度計(jì)上調(diào)節(jié)零點(diǎn)，作為空白對(duì)照，并對(duì)不同時(shí)間培養(yǎng)液從0h起依次進(jìn)行測(cè)定，對(duì)濃度大的菌懸液用未接種的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測(cè)定，使其OD值在0.10-0.65以?xún)?nèi)，經(jīng)稀釋后測(cè)得的OD值要乘以稀釋倍數(shù)，才是培養(yǎng)液實(shí)際的OD值。六、結(jié)果 1. 將測(cè)定的OD值填入下表：時(shí)間(h)對(duì)照01.534681012141620OD60002. 以上述表格中的時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)二 從土壤中分離產(chǎn)酸細(xì)菌一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊螅赫莆瘴⑸锓蛛x純化的方法，學(xué)習(xí)篩選培養(yǎng)基制備原理和方法。二.實(shí)

5、驗(yàn)原理：從混雜的微生物群體中獲得某一種或某一株微生物的過(guò)程，稱(chēng)微生物的分離與純化，本實(shí)驗(yàn)采用稀釋涂布平板法分離產(chǎn)酸細(xì)菌，以碳酸鈣為底物，經(jīng)產(chǎn)酸菌酸化形成透明圈。2H+ + CO32-CO2+ H2O三.主要設(shè)備、器材：1.實(shí)驗(yàn)器皿：250 mL三角瓶2只；試管7支（帶棉或硅膠塞）；9 cm培養(yǎng)皿6個(gè)；1 mL移液管7根；吸耳球1個(gè)；涂布棒3個(gè)；廢報(bào)紙、棉花、棉繩、玻璃珠若干。凈工作臺(tái)、接種環(huán)、酒精燈各一套 2.實(shí)驗(yàn)試劑：瓊脂，蛋白胨，牛肉膏，CaCO3，0.5mol/L的HCl溶液，0.5mol/L的NaOH溶液，玻璃棒，pH試紙 四 實(shí)驗(yàn)步驟：1. 分離用器皿的準(zhǔn)備用報(bào)紙包扎6個(gè)培養(yǎng)皿，7根

6、1mL移液管，3個(gè)涂布棒，160 干熱滅菌60 min。（亦可121濕熱滅菌20 min）2. 無(wú)菌水的制備取1只250 mL三角瓶裝入90 mL自來(lái)水和15-20粒玻璃珠。121濕熱滅菌20 min。取6支試管各加自來(lái)水9 mL (6只一捆)。 121濕熱滅菌20 min。3. 培養(yǎng)基的制備及分離平板制作取1只250 mL三角瓶制作細(xì)菌固體培養(yǎng)基100 mL（配方：蛋白胨1.0%，牛肉膏0.3%，CaCO3 1%，瓊脂1.8-2.0%，pH 7.0），121 濕熱滅菌20 min，60恒溫箱保溫。倒平板，將培養(yǎng)基充分搖勻呈渾濁液，立即在超靜臺(tái)上將6個(gè)培養(yǎng)皿倒入細(xì)菌培養(yǎng)基（約15-16 mL）

7、。4. 土壤中產(chǎn)酸細(xì)菌的分離操作稱(chēng)取校園土10 g，在超靜臺(tái)無(wú)菌操作倒入冷卻至室溫的無(wú)菌水中（90 mL蒸餾水/250mL三角瓶帶玻璃珠），搖勻5-10 min，制成菌液，用十倍稀釋法稀釋到10-6（5支無(wú)菌水試管）。分別取10-4，10-5，10-6稀釋度的稀釋液，每個(gè)稀釋度涂布兩個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿0.1 mL（2-3滴）。35培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d，觀察單菌落周?chē)袩o(wú)透明圈出現(xiàn)。如有透明圈說(shuō)明該菌株可能產(chǎn)酸。（以下內(nèi)容選作）挑取具有透明圈的單菌落至牛肉膏蛋白胨斜面，進(jìn)一步利用劃線分離法純化，做產(chǎn)酸能力實(shí)驗(yàn)。從復(fù)篩培養(yǎng)基上挑取透明圈較大的單菌落接種至三角瓶液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)2天后，檢測(cè)產(chǎn)酸能力

8、（用pH試紙或酸堿滴定法）。五 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析討論六 思考題:1. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果回答，如何區(qū)分平板中非產(chǎn)酸菌？2. 你覺(jué)得本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的篩選培養(yǎng)基該如何改進(jìn)？實(shí)驗(yàn)二 噴霧干燥酶粉中分離篩選1398中性蛋白酶生產(chǎn)菌株（選做）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊笳莆瘴⑸锓蛛x純化的方法，學(xué)習(xí)篩選培養(yǎng)基的制備，滅菌等無(wú)菌操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理中性蛋白酶是許多微生物分泌到胞外的能在pH值中性范圍內(nèi)水解蛋白質(zhì)的酶類(lèi)，利用此機(jī)制以干酪素為底物，根據(jù)水解透明圈與菌落比值的大小來(lái)進(jìn)行菌株的篩選。比值大的其產(chǎn)酶活力明顯增大。三、材料與方法1、試驗(yàn)材料供試材料為噴霧干燥的中性蛋白酶樣品。購(gòu)自市場(chǎng)。2、培養(yǎng)基（1）干酪素培養(yǎng)基：干

9、酪素2.0（用適量NaOH溶液加熱溶解），瓊脂1.5，pH7.0（或干酪素 4g，硫酸鎂 0.5g，氯化鉀 0.5g，硫酸鐵 0.01g，蔗糖 30g，瓊脂20g，1000mL）。（2）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏0.4，蛋白胨0.6，酵母浸出粉0.2，NaCl 0.5，瓊脂2.0，pH7.0（3）發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮4.0，蛋白胨0.1，Na2HPO412H2O 0.4，KH2PO4 0.03%，pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉1.0，蛋白胨0.5，Na2HPO412H2O 0.4%，KH2PO4 0.03%，CaCl2 0.1%，pH7.0。3、儀器與設(shè)備超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫振蕩培養(yǎng)箱

10、，恒溫水浴鍋，臺(tái)式低速離心機(jī)，721型分光光度計(jì)4、步驟（1）初篩利用樣品通過(guò)常規(guī)稀釋平板法：即取10 g樣品置于已加入90mL無(wú)菌水的三角瓶中，220 rmin旋轉(zhuǎn)搖床，20 min后取出，靜置30 s。此三角瓶中液體的濃度為10-1，再用7支分別裝有9 mL無(wú)菌水的試管進(jìn)行稀釋?zhuān)♂屩?0-8。將干酪素培養(yǎng)基分別倒入已滅菌的6個(gè)平皿中，每個(gè)平皿倒入10 mL左右，然后吸取0.1 mL的10-6，10-7，10-8稀釋液分別涂布于干酪素培養(yǎng)基表面，每個(gè)稀釋濃度涂布2個(gè)平皿。37 培養(yǎng)24 h。肉眼選出產(chǎn)生透明圈的菌株。將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分別倒入7個(gè)已滅菌的平皿（每個(gè)平皿倒10mL左右，置平

11、板）和7支試管（每支試管6mL左右，置斜面）內(nèi)。然后將選出來(lái)的若干株菌在平皿上劃線，每株劃一個(gè)平皿。37 培養(yǎng)24 h。取出，然后從平皿中選出其單菌落劃線至斜面試管（每個(gè)平皿對(duì)應(yīng)一支斜面試管）進(jìn)行活化培養(yǎng)，37 培養(yǎng)24 h。（2）復(fù)篩面試管中分別接一環(huán)對(duì)應(yīng)于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。30 恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，3500rmin離心30 min，取上清液測(cè)蛋白酶活力。然后從中挑選出酶活力較高的1-3株。用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，30 恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，3500 rmin離心30 min，取上清液測(cè)蛋白酶活力。然后從中挑選出酶活力最高的1株。5、蛋白酶活力的測(cè)定（1）原理 采用福

12、林-酚試劑法。福林酚試劑在堿性條件下可被酚類(lèi)化合物還原呈藍(lán)色（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)混合物），由于蛋白質(zhì)分子中有含酚基的氨基酸（如酪氨酸，色氨酸等），可使蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物呈上述反應(yīng)。因此可利用此原理測(cè)定蛋白酶活力。通常以酪蛋白為底物，在一定pH值和溫度條件下，同酶液反應(yīng)，經(jīng)一段時(shí)間后終止酶反應(yīng)，經(jīng)離心或過(guò)濾除去酪蛋白等沉淀物后取上清液，用Na2CO3堿化，再加入福林-酚試劑顯色，藍(lán)色的深淺與濾液中生成產(chǎn)物酪氨酸量成正比，酪氨酸含量用分光光度計(jì)在660 nm處測(cè)定，從而計(jì)算出蛋白酶活力。（2）試劑福林-酚試劑在2000mL磨口回流瓶中，加入100g鎢酸鈉（Na2WO42H2O），25g鉬酸鈉（Na2MoO

13、42H2O）及700mL蒸餾水，再加50mL85%磷酸，100mL濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時(shí)，回流結(jié)束時(shí)，加入50g 硫 酸 鋰（Li2SO4），50mL蒸餾水及數(shù)滴濃溴水（99），開(kāi)口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過(guò)量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加濃溴水的步驟）。定容至1000mL，過(guò)濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。此溶液使用時(shí)加兩倍蒸餾水稀釋?zhuān)闯梢严♂尩母Ａ衷噭?.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液精確稱(chēng)取TCA65.4g ，加去離子水定容至1000 mL。0.4mo1/L碳酸鈉溶液精確稱(chēng)取無(wú)水碳酸鈉42.4 g，加去離于水溶解后，定容至1000 mL

14、。pH7.2磷酸鹽緩沖液稱(chēng)取磷酸二氫鈉(NaH2PO42H2O)31.2 g，定容至1000 mL，即成0.2 mol/L溶液(A液)。稱(chēng)取磷酸氫二鈉(Na2HPO412H2O)71.63 g，定容至1000 mL，即成0.2 mol/L溶液(B液)。取A 液28 mL 和B 液72 mL，再用蒸餾水稀釋1倍，即成0.1 mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液。2%酪蛋白溶液 準(zhǔn)確稱(chēng)取干酪素2 g，稱(chēng)準(zhǔn)至0.002 g，加入0.1 mol/L氫氧化鈉10 mL，在水浴中加熱使溶解(必要時(shí)用小火加熱煮沸)，然后用pH7.2磷酸鹽緩沖液定容至100 mL即成。配制后應(yīng)及時(shí)使用或放入冰箱內(nèi)保存，否則極

15、易繁殖細(xì)菌，引起變質(zhì)。100 g/mL酪氨酸溶液精確稱(chēng)取在105 烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000 g，用1 molL鹽酸溶液60 mL溶解后，用蒸餾水定容至100 mL，即為1mg/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取1 mgmL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10 mL，用0.1 molL鹽酸溶液定容至100 mL，即得到100g/mL的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。此溶液配成后也應(yīng)及時(shí)使用或放入冰箱內(nèi)保存，以免繁殖細(xì)菌而變質(zhì)。（3）酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取18支試管分成6組(每組3支，平行樣)，編號(hào)，按下表分別加入標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸、去離子水、0.4 moL/L的碳酸鈉和福林-酚試劑，混勻后，放入40水浴保溫20min，然后在721型分光

16、光度計(jì)上進(jìn)行比色測(cè)定(波長(zhǎng)660 nm)，以濃度為0 g/mL酪氨酸反位液做空白對(duì)照。管號(hào)標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸(mL)去離子水(mL)Na2CO3(mL)福林一酚試劑(mL)酪氨酸含量(g/mL)101.051020.20.8512030.40.6514040.60.4516050.80.2518061.0051100（4）樣品酶活力的測(cè)定取4支試管編號(hào)(1號(hào)為空白對(duì)照)，分別加入酶液1mL，1號(hào)管立即加入0.4mol/LTCA溶液2mL，使酶失活，另3支樣品加入1 mLpH7.2、濃度為2%酪蛋白底物緩沖液(如測(cè)酸性蛋白酶活力加pH 3.6、2%酪蛋白底物緩沖液)，迅速混勻，并立即放入40 恒溫水浴準(zhǔn)

17、確計(jì)時(shí)，保溫10 min后，立即加入0.4 moL/LTCA溶液2 mL，終止反應(yīng)，同時(shí)向1號(hào)空白管中加入1 mL 2%酪蛋白底物緩沖液，搖勻，繼續(xù)置于水浴中保溫20 min，取出離心或過(guò)濾除去剩余酪蛋白及酶蛋白沉淀物，然后取各試管濾液1 mL，分別移入另4支試管中，再加入0.4 mol/L碳酸鈉溶液5 mL和己稀釋的福林-酚試劑1 mL，搖勻，保溫顯色20 min后，進(jìn)行比色測(cè)定(波長(zhǎng)660 nm)。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酪氨酸含量。（5）蛋白酶活力計(jì)算： 蛋白酶活力=A4N/10。 式中：A表示對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的酪氨酸釋放量；4表示反應(yīng)液總體積；N表示酶液的稀釋倍數(shù)；10表示反應(yīng)時(shí)間10 mi

18、n；蛋白酶活性定義:在一定pH值(pH 7.0)和40 溫度條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 g酪氨酸定義為一個(gè)蛋白酶活力單位。思考題： 某菌株的透明圈的大小可以完全反映該菌株的蛋白酶活力大小嗎？說(shuō)明理由。實(shí)驗(yàn)三 黑曲霉三角瓶固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)一、概述 固體發(fā)酵法作為一個(gè)古老的生物工藝早在幾千年前已在食品和調(diào)味品上得到應(yīng)用。與液體發(fā)酵相比，固態(tài)發(fā)酵操作簡(jiǎn)易、工藝簡(jiǎn)單、能耗低，無(wú)廢水廢渣產(chǎn)生，不造成對(duì)環(huán)境的二次污染。因此，固態(tài)發(fā)酵法目前在生產(chǎn)有機(jī)酸、發(fā)酵食品、酶制劑以及動(dòng)植物廢棄物、垃圾的處理和利用等方面有著廣泛的應(yīng)用。利用曲霉屬菌種，通過(guò)固體或液體發(fā)酵法生產(chǎn)酸性蛋白酶，我國(guó)在七十年代末和八十年代初作過(guò)

19、一些研究，但此后有關(guān)這方面研究的報(bào)導(dǎo)極少見(jiàn)到。近年來(lái)，隨著酸性蛋白酶應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，尤其是作為一種新型的生物飼料添加劑，在飼料工業(yè)中表現(xiàn)出來(lái)的潛在功能，越來(lái)越引起人們對(duì)它的研究興趣。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求通過(guò)三角瓶固態(tài)培養(yǎng)黑曲霉，掌握固態(tài)培養(yǎng)微生物的原理和技術(shù)，并掌握蛋白酶的分析方法。 三、菌種和培養(yǎng)基 1、 菌種：黑曲霉（上海華東理工大學(xué)贈(zèng)送） 2、培養(yǎng)基：（1）斜面培養(yǎng)基土豆培養(yǎng)基或察氏培養(yǎng)基。（土豆培養(yǎng)基：取去皮馬鈴薯200克，切成小塊，加水1000毫升煮沸30分鐘，濾去馬鈴薯塊，將濾液補(bǔ)足至1000毫升，加葡萄糖20克，瓊脂15克，溶化后分裝，15磅滅菌30分鐘。） （2）固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基

20、麩皮 8g，豆餅粉 2g，(NH4)2SO2 0.2g，水11mL，121滅菌45分鐘。四、儀器與設(shè)備 三角瓶100個(gè)、普通天平4個(gè)，分析天平1臺(tái)，滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)接種鏟8個(gè)，100mL量筒8個(gè)，10mL移液管8支，塑料盆8個(gè)五、實(shí)驗(yàn)過(guò)程 原始斜面菌種斜面接種培養(yǎng)（28、7天）麩皮試管培養(yǎng)（28、7天）三角瓶培養(yǎng)(28、72h)測(cè)定酸性蛋白酶酶活力，觀察孢子形態(tài)。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后將培養(yǎng)基拍散，冷卻至室溫，接入麩皮試管種子，混勻，于恒溫培養(yǎng)箱中28-30靜置培養(yǎng)72小時(shí)，取樣測(cè)定酶活力。 實(shí)驗(yàn)分四組：組：裝料量對(duì)酶活力的影響。取53（2）個(gè)250mL三角瓶，按以上固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基

21、，分別按下列裝料量（按干料計(jì)算）裝料：5g/瓶；10 g/瓶；15 g/瓶；20 g/瓶；25 g/瓶。接種培養(yǎng)72小時(shí)后，測(cè)定每一瓶的發(fā)酵酶活力，計(jì)算三瓶平均數(shù)。組：碳氮比對(duì)酶活力的影響。取53（2）個(gè)250mL三角瓶，麩皮和豆餅粉的比例按下列配比：6:4；7:3；8:2；9:1；10:0。接種培養(yǎng)72小時(shí)后，測(cè)定每一瓶的發(fā)酵酶活力，計(jì)算三瓶平均數(shù)。組：料水比對(duì)酶活力的影響。取53（2）個(gè)250mL三角瓶，麩皮和豆餅粉的比例按給出的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，但料水比按以下比例配制：10:8；10:9；10:10；10:11；10:12，接種培養(yǎng)72小時(shí)后，測(cè)定每一瓶的發(fā)酵酶活力，計(jì)算三瓶平均數(shù)。組：酶

22、活力的時(shí)間變化曲線。取53（2）個(gè)250mL三角瓶，麩皮和豆餅粉的比例按給出的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，接種培養(yǎng)，分別于接種后24、36、48、60、72小時(shí)取樣，測(cè)定每一瓶的發(fā)酵酶活力，計(jì)算三瓶平均數(shù)。實(shí)驗(yàn)四 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵曲的酸性蛋白酶活力測(cè)定（承接試驗(yàn)三）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求：1.學(xué)習(xí)固態(tài)發(fā)酵胞外產(chǎn)物（酶）的提取方法2.掌握福林-酚試劑法測(cè)定蛋白酶活力的步驟與方法二、蛋白酶活力的測(cè)定原理：采用福林-酚試劑法。福林-酚試劑在堿性條件下可被酚類(lèi)化合物還原呈藍(lán)色(鉬藍(lán)和鎢藍(lán)混合物)，由于蛋白質(zhì)分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物呈上述反應(yīng)。因此可利用此原理測(cè)定蛋白酶活力。通

23、常以酪蛋白為底物，在一定pH值和溫度條件下，同酶液反應(yīng)，經(jīng)一段時(shí)間后終止酶促反應(yīng)，經(jīng)離心或過(guò)濾除去酪蛋白等沉淀物后取上清液，用Na2CO3堿化，再加入福林-酚試劑顯色，藍(lán)色的深淺與濾液中生成產(chǎn)物酪氨酸量成正比；酪氨酸含量用分光光度計(jì)在680nm波長(zhǎng)處測(cè)定，從而計(jì)算出蛋白酶的活力。 三、儀器、設(shè)備、物品：分析天平，電爐，分光光度計(jì)，恒溫水浴鍋，恒溫箱，試管架試管（18180）200支，小燒杯100個(gè)，紗布1卷，玻璃棒8，記號(hào)筆8，四、試劑配制1、福林-酚試劑 （磷鎢酸與磷鉬酸的混合物）向2000mL的磨口回流瓶中加入100g鎢酸鈉(Na2WO42H2O)、25g鉬酸鈉及700mL的去離子水，再加

24、入50mL85%的磷酸及濃鹽酸l00mL，充分混合后，接上回流冷凝管，以文火回流10h，結(jié)束后再加入50g的硫酸鋰(LiSO4)、50mL去離子水及數(shù)滴濃溴水（99%），再繼續(xù)沸騰15min，以驅(qū)除過(guò)量的溴，冷卻后濾液呈黃綠色(如仍呈綠色，需再重復(fù)滴加溴水的步驟)，加去離子水定容至1000mL，過(guò)濾，濾液置于棕色試劑瓶中，貯于冰箱中可長(zhǎng)期保存?zhèn)溆?。此溶液使用時(shí)可按1:2比例用去離子水稀釋?zhuān)ㄒ环莞Ａ衷噭┡c兩份水混合）。 2、 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液 精確稱(chēng)取TCA65.4g，加去離子水定容至1000mL。 3、0.4mo1/L碳酸鈉溶液 精確稱(chēng)取無(wú)水碳酸鈉42.4g，加去離于水溶

25、解后，定容至1000mL。 4、乳酸緩沖液（pH=3.0）的制備甲液 稱(chēng)取乳酸（8090%）10.6g，加水溶解并定容至1000mL。乙液 稱(chēng)取乳酸鈉（70%）16g，加水溶解并定容至1000 mL。使用溶液 取甲液8mL，加乙液1mL，混勻，稀釋一倍，即成0.05mol/L乳酸緩沖液。5、2%酪素溶液取酪素2.000g，精確至0.001g，用濃乳酸2-3滴潤(rùn)濕后，加入適量的乳酸緩沖液約80mL，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)入100mL的容量瓶中，用乳酸緩沖液稀釋至刻度，冰箱中貯存。有效期為三天。6、100g/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液 精確稱(chēng)取預(yù)先于105干燥23h的L-酪氨酸0

26、.1g，逐步加入6mL 1NHCl使之溶解，用0.2NHCl定容至100mL，即得1mg/mL的酪氨酸溶液，取此溶液10mL，用0.2NHCl定容至100mL即成100g/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液五、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制為了確定酪氨酸濃度與OD值的對(duì)應(yīng)關(guān)系，須事先以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸與福林試劑反應(yīng)顯色，測(cè)定OD值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1、不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸按下表配制：試管號(hào)100g/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液（mL）蒸餾水（mL）酪氨酸的濃度（g/mL）對(duì)照01001191022820337304464055550664602、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將上表配制的各種濃度酪氨酸溶液各取1mL（需做平行）分別加入0.4mol/L

27、Na2CO3溶液5mL，稀福林試劑1mL，置40水浴中顯色20min，以721分光光度計(jì)在波長(zhǎng)680nm測(cè)定OD值，用0.2NHCl做對(duì)照，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，酪氨酸的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。此曲線應(yīng)是通過(guò)零點(diǎn)的直線，然后計(jì)算K值標(biāo)準(zhǔn)曲線中OD為1時(shí)的酪氨酸濃度（g/mL）。K值一般應(yīng)在95100范圍內(nèi)。六、黑曲霉曲中酸性蛋白酶活力的測(cè)定1、待測(cè)酶液的制備精確稱(chēng)取曲塊5g，加水100mL，在40水浴中充分?jǐn)嚢?0min，充分溶出酶蛋白，然后過(guò)濾，濾液用緩沖液稀釋待測(cè)（稀釋倍數(shù)應(yīng)使水解底物后與福林試劑顯色的OD值在0.20.4范圍內(nèi)）。酶曲稀釋倍數(shù)可參考下表酶活力u/g總倍數(shù)第一次稀釋第二次稀

28、釋20002005g50mL(10倍)0.5mL10mL(20倍)30002502g50mL(25倍)1mL10mL(10倍)40004005g50mL(10倍)5mL200mL(40倍)50005002g50mL(25倍)0.5mL10mL(20倍)1000010002g50mL(25倍)5mL200mL(40倍)2、樣品酶活的測(cè)定（1）先將酪素溶液放入400.5的恒溫水浴中，預(yù)熱5min。（2）按下列程序操作：試管B（空白）加酶液1mL400.5,2min加酪素1.00mL（搖勻）400.5，10min加三氯醋酸2.00mL(搖勻)取出靜止10min，過(guò)濾取1.00mL濾液加碳酸鈉溶液5.

29、0mL加富林試劑使用液1.00mL400.5顯色20min于680nm波長(zhǎng)，用10mm比色皿測(cè)吸光度試管A（酶試樣，需作平行）加酶液1mL加酪素1.00mL（搖勻）400.5，10分鐘加三氯醋酸2.00mL(搖勻)取出靜止10min，過(guò)濾取1.00mL濾液加富林試劑使用液1.00mL400.5,2min加碳酸鈉溶液5.0mL于680nm波長(zhǎng)，用10mm比色皿測(cè)吸光度400.5顯色20min3、蛋白酶活力的計(jì)算蛋白酶活力X=(4/l0)KODN。 式中: 44mL反應(yīng)液取出1mL；10反應(yīng)時(shí)間10min；K標(biāo)準(zhǔn)曲線中OD為1時(shí)所相當(dāng)?shù)睦野彼釢舛龋╣/mL）N酶曲的稀釋倍數(shù)蛋白酶活性定義:在一定p

30、H值(pH3.0)和40溫度條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1g酪氨酸定義為一個(gè)蛋白酶活力單位。七、數(shù)據(jù)處理用表格來(lái)表示發(fā)酵過(guò)程中裝料量、碳氮比、料水比對(duì)酶活力的影響。用表格或曲線來(lái)表示酶活力隨時(shí)間的變化。八、思考題影響固體發(fā)酵的因素還有哪些？本次實(shí)驗(yàn)做的為單因子試驗(yàn)，能否用多因子實(shí)驗(yàn)如正交試驗(yàn)法？2008-2009第一學(xué)期開(kāi)設(shè)本實(shí)驗(yàn)課的班級(jí)及人數(shù)：實(shí)驗(yàn)班級(jí)生物技術(shù)05級(jí)生物技術(shù)（現(xiàn)科）05級(jí)生物技術(shù)及應(yīng)用（專(zhuān)）06級(jí)人數(shù)35444個(gè)班課時(shí)數(shù)1616162009-2010第一學(xué)期開(kāi)設(shè)本實(shí)驗(yàn)課的班級(jí)及人數(shù)：實(shí)驗(yàn)班級(jí)生物技術(shù)06級(jí)生物技術(shù)（現(xiàn)科）06級(jí)生物技術(shù)及應(yīng)用（專(zhuān)）07級(jí)人數(shù)521082個(gè)班課時(shí)

31、數(shù)1616162010-2011第一學(xué)期開(kāi)設(shè)本實(shí)驗(yàn)課的班級(jí)及人數(shù)：實(shí)驗(yàn)班級(jí)生物技術(shù)07級(jí)生物技術(shù)（現(xiàn)科）07級(jí)人數(shù)2個(gè)班30人5個(gè)班119人課時(shí)數(shù)16162011-2012第一學(xué)期開(kāi)設(shè)本實(shí)驗(yàn)課的班級(jí)及人數(shù)：實(shí)驗(yàn)班級(jí)生物技術(shù)08級(jí)生物技術(shù)（現(xiàn)科）08級(jí)人數(shù)2個(gè)班57人6個(gè)班158人課時(shí)數(shù)1616實(shí)驗(yàn)五 土霉素?fù)u瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、 熟悉放線菌的微生物學(xué)特性及培養(yǎng)方法2、 了解和掌握種子制備和搖瓶發(fā)酵技術(shù)和方法3、 了解抗生素發(fā)酵的一般規(guī)律和代謝調(diào)控理論4、 熟悉和掌握常用的比色分析方法的操作技術(shù)5、 掌握分光光度法測(cè)定發(fā)酵樣品土霉素效價(jià)的方法二、實(shí)驗(yàn)原理土霉素是四環(huán)類(lèi)抗生素

32、，其在結(jié)構(gòu)上含有四并苯的基本母核，隨環(huán)上取代基的不同或位置的不同而構(gòu)成不同種類(lèi)的四環(huán)素類(lèi)抗生素。其結(jié)構(gòu)和命名如圖。R1R2R3R4R5土霉素HOHCH3OHH四環(huán)素HOHCH3HH金霉素ClOHCH3HH去甲基金霉素ClOHHHH多西環(huán)素HHCH3OHH米諾環(huán)素N(CH3)2HHHH美他環(huán)素H=CH2-OHCH2(NH)CH(COOH)(CH2)4NH2土霉素具有廣譜抗菌性，能抑制多種細(xì)菌、較大的病毒及一部分原蟲(chóng)。土霉素能抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，在濃度高的時(shí)候也具有殺菌的作用。它的作用機(jī)制是干擾蛋白質(zhì)的合成。由于它的毒副作用小，所以其在醫(yī)療上用途廣泛，主要是應(yīng)用于呼吸道和腸道感染。土霉素是由龜裂鏈霉菌

33、產(chǎn)生的，屬于放線菌中的鏈霉菌屬，它們具有發(fā)育良好的菌絲體，菌絲體分支，無(wú)隔膜，直徑約0.41.0米，長(zhǎng)短不一，多核。菌絲體有營(yíng)養(yǎng)菌絲、氣生菌絲和孢子絲之分，孢子絲再形成分生孢子。而龜裂鏈絲菌的菌落灰白色，后期生褶皺，成龜裂狀。菌絲成樹(shù)枝分支，白色，孢子灰白色，柱形。土霉素是典型的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其發(fā)酵的特點(diǎn)之一就是分批過(guò)程分為菌體的生長(zhǎng)期、產(chǎn)物期和菌體期三個(gè)階段。龜裂鏈絲菌的生長(zhǎng)和土霉素的生物合成受到許多發(fā)酵條件的影響：溫度、發(fā)酵pH值、溶氧、接種量、泡沫等。同時(shí)還受到一些代謝調(diào)控機(jī)制的控制：磷酸鹽的調(diào)節(jié)作用、ATP的調(diào)節(jié)和產(chǎn)生菌生長(zhǎng)速率的調(diào)節(jié)等。三、儀器與材料（一）培養(yǎng)基1、斜面高氏一號(hào)培養(yǎng)基

34、(100mL灌裝斜面若干支)可溶性淀粉2% 氯化鈉0.05%(配成1%溶液，使用時(shí)5mL/100mL) 硝酸鉀0.1% 三水磷酸氫二鉀0.05%(配成1%溶液，使用時(shí)5mL/100mL) 七水硫酸鎂0.05%(配成1%溶液，使用時(shí)5mL/100mL) 七水硫酸亞鐵0.001%(配成1%溶液，使用時(shí)0.1mL/100mL) 瓊脂1.5%-2.0% pH：7.4-7.62、母瓶培養(yǎng)基淀粉3%(1.5g/50mL) 黃豆餅粉0.3%(0.15g/50mL) 硫酸銨0.4%(0.2g/50mL) 碳酸鈣0.5%(0.25g/50mL) 玉米漿0.4%(0.2mL/50mL) 氯化鈉0.5%(0.2g/

35、50mL) 磷酸二氫鉀0.015%(配成1%溶液，使用時(shí)0.75mL/50mL) pH：7.0-7.23、發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉15%( 7.5g/50mL) 黃豆餅粉2%(1g/50mL) 硫酸銨1.4%(0.7g/50mL) 碳酸鈣1.4%(0.7g/50mL) 氯化鈉0.4%(0.2g/50mL) 玉米漿0.4%(0.2mL/50mL) 磷酸二氫鉀0.01% (配成1%溶液，使用時(shí)0.5mL/50mL) 氯化鈷10g/mL(配成1mg/mL溶液，使用時(shí)0.5mL/50mL) 消沫劑0.01% 淀粉酶0.1%-0.2%(0.1g/50mL) pH7.0-7.2（二）實(shí)驗(yàn)菌種：龜裂鏈霉菌，本實(shí)驗(yàn)室保

36、藏（三）儀器：玻璃試管（18180）、試管架8、吸管（1mL，2mL，10mL）、吸耳球、離心管（7 mL）、容量瓶、燒杯、三角瓶360個(gè)（250 mL）、量筒（250mL，500mL，1000mL）、玻璃棒、試紙、塑料漏斗、電爐、接種鏟（針）、恒溫?fù)u床、恒溫箱、臺(tái)秤等四、實(shí)驗(yàn)題目1、溶氧對(duì)土霉素發(fā)酵的影響：取43個(gè)250mL的三角瓶，培養(yǎng)基裝量： 30mL/250mL；40mL/250mL；50mL/250mL；60mL/250mL。接種后的發(fā)酵瓶于30恒溫室搖床上搖67天，轉(zhuǎn)速為230轉(zhuǎn)/分。測(cè)定發(fā)酵液的效價(jià)。2、培養(yǎng)基中磷量對(duì)土霉素發(fā)酵的影響：取53個(gè)250mL的三角瓶，培養(yǎng)基裝量50m

37、L/250mL，培養(yǎng)基中磷酸二氫鉀的含量分別為：0.005%、0.01%、0.02%、0.04%、0.1%。培養(yǎng)后測(cè)定發(fā)酵液的效價(jià)。取三個(gè)平行樣的平均數(shù)。3、接種量對(duì)土霉素發(fā)酵的影響。取53個(gè)250mL的三角瓶，培養(yǎng)基裝量50mL/250mL，接種量分別設(shè)計(jì)為：2%、5%、10%、15%、20%。培養(yǎng)后測(cè)定發(fā)酵液的效價(jià)。取三個(gè)平行樣的平均數(shù)。4、碳源、氮源濃度對(duì)土霉素發(fā)酵的影響：取63個(gè)250mL的三角瓶，培養(yǎng)基裝量50mL/250mL。淀粉10%、淀粉15%、淀粉20% ；黃豆餅粉1%、黃豆餅粉2%、黃豆餅粉3%。培養(yǎng)后測(cè)定發(fā)酵液的效價(jià)。取三個(gè)平行樣的平均數(shù)。五、實(shí)驗(yàn)步驟1斜面孢子的制備無(wú)菌

38、條件下，從冷藏的產(chǎn)生菌的斜面孢子中，刮取適量孢子涂在高氏斜面上，然后置36.537的恒溫箱培養(yǎng)3天，再置30的恒溫室培養(yǎng)1天。2 種子的制備（1）搖瓶種子培養(yǎng)基的配制 按母瓶培養(yǎng)基成分配比，配制培養(yǎng)基，并加淀粉酶液化后，再加入CaCO3，冷卻后調(diào)pH值，分裝，包裝滅菌。（2）接種在超凈工作臺(tái)上，將長(zhǎng)好的斜面孢子用無(wú)菌接種鏟挖塊約2cm2，接種于滅過(guò)菌的搖瓶種子培養(yǎng)基中。（3）培養(yǎng)將接種好的種子搖瓶于30恒溫室搖床上，轉(zhuǎn)速為230轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)28小時(shí)左右。3 發(fā)酵（1） 發(fā)酵瓶培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基配方以發(fā)酵培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)，依據(jù)實(shí)驗(yàn)題目不同而設(shè)計(jì)。搖瓶裝量依據(jù)實(shí)驗(yàn)題目而設(shè)計(jì)。制備方法同種子瓶。（2

39、） 接種在超凈工作臺(tái)上，將培養(yǎng)28小時(shí)的搖瓶種子接種于發(fā)酵瓶中，接種量一般為10%或依據(jù)實(shí)驗(yàn)題目而設(shè)計(jì)。（3）培養(yǎng)將接種后的發(fā)酵瓶于30恒溫室搖床上搖67天，轉(zhuǎn)速為230轉(zhuǎn)/分。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)方案、具體實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)過(guò)程。七、思考題1.為什么種子搖瓶培養(yǎng)28小時(shí)左右？2.分析發(fā)酵培養(yǎng)基成分，龜裂鏈霉菌發(fā)酵土霉素的碳源和氮源有哪些？3.培養(yǎng)基加淀粉酶的目的是什么？消沫劑的作用是什么？為什么搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基可以不加消沫劑？關(guān)于淀粉液化：1.酶法液化原理： 淀粉的酶法液化是以-淀粉酶為催化劑，該酶作用于淀粉的-1,4糖苷鍵，從內(nèi)部隨機(jī)地水解淀粉，從而迅速將淀粉水解為糊精及少量麥芽糖，所以也稱(chēng)內(nèi)切

40、淀粉酶。淀粉受到-淀粉酶的作用后，其碘色反應(yīng)發(fā)生如下變化：藍(lán)紫紅淺紅不顯色(即碘原色)。2.淀粉液化方法：配制15-30的淀粉乳，調(diào)節(jié)pH值至6.5，加入氯化鈣(對(duì)固形物0.2)，加入液化酶(12-20U/g淀粉)，在劇烈攪拌下，先加熱至72，保溫15min，再加熱至80-90，并維持30-60min，以達(dá)到所需的液化程度。實(shí)驗(yàn)六 土霉素?fù)u瓶發(fā)酵的效價(jià)測(cè)定（設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)）一、實(shí)驗(yàn)原理關(guān)于四環(huán)素族類(lèi)抗生素的測(cè)定，目前多用微生物測(cè)定法及高效液相色譜法。 可用的物理化學(xué)方法有： FeCl3 比色法、鹽酸比色法、紫外分光光度法、熒光法及近年內(nèi)文獻(xiàn)所報(bào)道的用流動(dòng)注射分析法（ FIA ）。 土霉素化驗(yàn)采用可

41、見(jiàn)光分光光度法測(cè)定。土霉素在酸性條件下，能與FeCl3作用生成橙褐色的物質(zhì)，根據(jù)有色物質(zhì)對(duì)光的吸收定律，在480 nm處測(cè)定樣品的吸光度，然后對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)濃度-吸光度曲線，以計(jì)算土霉素的濃度。土霉素與金屬離子生成有色配位化合物Fe2+褐色橙褐色深褐色紅棕色鹽酸多西環(huán)素鹽酸土霉素鹽酸金霉素鹽酸四環(huán)素FeCl3二、實(shí)驗(yàn)步驟（一）發(fā)酵液狀態(tài)觀察：粘度、顏色、氣味、菌絲形態(tài)（二）發(fā)酵樣品預(yù)處理：發(fā)酵瓶搖勻，將少量倒入小燒杯，測(cè)pH。用9mol/L的鹽酸溶液酸化pH至1.7-2.0攪拌10分鐘。取5mL酸化液至7mL離心管，6000轉(zhuǎn)離心4分鐘，取上清液，備測(cè)。（三）發(fā)酵樣品土霉素效價(jià)的測(cè)定：采用分光光度法

42、測(cè)定其效價(jià)。1.土霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將土霉素標(biāo)準(zhǔn)樣用0.01mol/L的鹽酸配成1000u/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。用2mL移液管分別取標(biāo)準(zhǔn)液0.4mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL于七支試管中，加0.01mol/L的鹽酸使全量均為10mL。再向每支試管中加0.05%（g/mL）的三氯化鐵溶液10mL，搖勻，靜置20分鐘。另取樣同上，加0.01mol/L的鹽酸使全量為20mL，搖勻，作為空白，在480nm的波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。以土霉素效價(jià)為縱坐標(biāo)，以吸光度值為橫坐標(biāo)繪制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.發(fā)酵液效價(jià)的測(cè)定：用移液管吸取適宜稀釋倍數(shù)（使稀釋后效價(jià)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)）的

43、濾液1mL稀釋液于試管中，準(zhǔn)確加入0.01mol/L的鹽酸，使全量為10mL。再加入0.05%（g/mL）的三氯化鐵溶液10mL，使全量為20mL。另取一支試管，加入1mL稀釋液，再加入0.01mol/L的鹽酸19mL，使全量為20mL，搖勻，放置20分鐘，作為空白。在480nm的波長(zhǎng)下測(cè)兩種液體的吸光度。三、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1.自己設(shè)計(jì)表格記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。2.用圖、表匯總實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3.對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作出分析和討論。四、思考題1、寫(xiě)出土霉素發(fā)酵工藝流程圖。2、通過(guò)查閱資料，試述次級(jí)代謝產(chǎn)物的發(fā)酵規(guī)律和代謝調(diào)節(jié)機(jī)制。試劑配制如下表試劑名稱(chēng)配置方法10%（g/mL）三氯化鐵溶液稱(chēng)取三氯化鐵500g（FeCl3H

44、2O稱(chēng)830克）用少量蒸餾水溶解過(guò)濾，加濃鹽酸30mL，加蒸餾水至4000毫升，根據(jù)初算結(jié)果用2mol/L的鹽酸和蒸餾水調(diào)節(jié)酸度至2mol/L和濃度為10%。0.05% (g/mL)三氯化鐵溶液量取10%三氯化鐵溶液5mL，2mol/L鹽酸5mL，加蒸餾水至1000mL，搖勻9mol/L鹽酸溶液量取蒸餾水500mL于2000mL試劑瓶中，加濃鹽酸1500mL，搖勻2mol/L鹽酸溶液量取濃鹽酸16.7mL加蒸餾水至100mL，搖勻0.01mol/L鹽酸溶液量取2mol/L的鹽酸5mL加蒸餾水至1000mL，搖勻1000u/mg土霉素標(biāo)準(zhǔn)液在分析天平上稱(chēng)取已知u/mL（生物效價(jià)）土霉素標(biāo)準(zhǔn)品W克

45、，加1mol/L鹽酸4mL，溶解完全后（約5min），加蒸餾水至200mL，放冰箱備用實(shí)驗(yàn)七 中性蛋白酶產(chǎn)生菌株的篩選一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊螅赫莆瘴⑸锓蛛x純化的方法，學(xué)習(xí)篩選培養(yǎng)基的制備，滅菌等無(wú)菌操作技術(shù)，棉塞等過(guò)濾介質(zhì)的制作。二、實(shí)驗(yàn)原理中性蛋白酶是許多微生物分泌到胞外的能在pH值中性范圍內(nèi)水解蛋白質(zhì)的酶類(lèi)，利用此機(jī)制以干酪素為底物，根據(jù)水解透明圈與菌落比值的大小來(lái)進(jìn)行菌株的篩選。比值大的其產(chǎn)酶活力明顯增大。三、材料與方法1.1材料1.1.1試驗(yàn)材料供試材料為土壤樣品。采自本校二食堂附近。1.1.2培養(yǎng)基（1）干酪素培養(yǎng)基：干酪素2.0（用適量NaOH溶液加熱溶解），瓊脂1.5，pH7.0（或

46、干酪素 4g，硫酸鎂 0.5g，氯化鉀 0.5g，硫酸鐵 0.01g，蔗糖 30g，瓊脂20g， 1000mL）。（2）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏0.4，蛋白胨0.6，酵母浸出粉0.2，NaCl 0.5，瓊脂2.0，pH7.0（3）發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮4.0，蛋白胨0.1，Na2HPO412H2O 0.4，KH2PO4 0.03%，pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉1.0，蛋白胨0.5，Na2HPO412H2O 0.4%，KH2PO4 0.03%，CaCl2 0.1%，pH7.0。1.2主要儀器與設(shè)備超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫振蕩培養(yǎng)箱，恒溫水浴鍋，臺(tái)式低速離心機(jī)，721型分光光度計(jì)1.3方法步

47、驟1.3.1菌種的分離純化與篩選初篩：從土壤中采集樣品，通過(guò)常規(guī)稀釋平板法，即取10 g土壤樣品置于已加入90mL無(wú)菌水的三角瓶中，220 rmin旋轉(zhuǎn)搖床，20 min后取出，靜置30 s。此三角瓶中液體的濃度為10-1，再用7支分別裝有9 mL無(wú)菌水的試管進(jìn)行稀釋?zhuān)♂屩?0-8。將干酪素培養(yǎng)基分別倒入已滅菌的6個(gè)平皿中，每個(gè)平皿倒入10 mL左右，然后吸取0.1 mL的10-6，10-7，10-8稀釋液分別涂布于干酪素培養(yǎng)基表面，每個(gè)稀釋濃度涂布2個(gè)平皿。37 培養(yǎng)24 h。肉眼選出產(chǎn)生透明圈的菌株。將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分別倒入7個(gè)已滅菌的平皿（每個(gè)平皿倒10mL左右，置平板）和7支試管

48、（每支試管6mL左右，置斜面）內(nèi)。然后將選出來(lái)的若干株菌在平皿上劃線，每株劃一個(gè)平皿。37 培養(yǎng)24 h。取出，然后從平皿中選出其單菌落劃線至斜面試管（每個(gè)平皿對(duì)應(yīng)一支斜面試管）進(jìn)行活化培養(yǎng)，37 培養(yǎng)24 h。復(fù)篩：從斜面試管中分別接一環(huán)對(duì)應(yīng)于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。30 恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，3500rmin離心30 min，取上清液測(cè)蛋白酶活力。然后從中挑選出酶活力較高的1-3株。用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，30 恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，3500 rmin離心30 min，取上清液測(cè)蛋白酶活力。然后從中挑選出酶活力最高的1株。2.中性蛋白酶活力的測(cè)定2.1原理 采用福林-酚試劑

49、法。福林酚試劑在堿性條件下可被酚類(lèi)化合物還原呈藍(lán)色（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)混合物），由于蛋白質(zhì)分子中有含酚基的氨基酸（如酪氨酸，色氨酸等），可使蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物呈上述反應(yīng)。因此可利用此原理測(cè)定蛋白酶活力。通常以酪蛋白為底物，在一定pH值和溫度條件下，同酶液反應(yīng)，經(jīng)一段時(shí)間后終止酶反應(yīng)，經(jīng)離心或過(guò)濾除去酪蛋白等沉淀物后取上清液，用Na2CO3堿化，再加入福林-酚試劑顯色，藍(lán)色的深淺與濾液中生成產(chǎn)物酪氨酸量成正比，酪氨酸含量用分光光度計(jì)在660 nm處測(cè)定，從而計(jì)算出蛋白酶活力。2.2試劑2.2.1福林-酚試劑在2000mL磨口回流瓶中，加入100g鎢酸鈉（Na2WO42H2O），25g鉬酸鈉（Na2MoO42