如何建立HPLC法測定有關物質的方法PPT課件

1、1,藥品研究及生產過程中有關物質的控制方法和要求,上海藥檢所化學室 謝沐風,2,有關物質的來源 原料藥合成過程中帶入; 制劑過程中產生; 或是在貯藏、運輸、使用過程中產生。 控制的必要性,3,有關物質的測定方法 儀器角度： 高效液相色譜法（HPLC法）、 薄層色譜法（TLC法）、 紫外分光光度法（UV法）、 氣相色譜法（GC法）、 毛細管電泳色譜法（CE）等 試驗角度： 對照品法 自身（稀釋）對照法 歸一化法,4,有關物質的計算方法 雜質對照品法 加響應因子（即重量校正因子）計算 的自身對照法、 不加響應因子計算的自身對照法 根據(jù)不同雜質采用不同方法等。 有關物質的計算方法 定量檢測和限度檢測

2、,5,高效液相色譜法（HPLC法,1 .色譜條件的確定（即專屬性試驗） 專屬性是提供被分析物在雜質和輔料存在時能被區(qū)分的證明，通常采用在純物質（原料或制劑）中加入一定量的雜質或輔料，證明各雜質均可與被分析物分離。 配制含有1%(w/w)濃度各中間體（即各雜質）的主成分對照品溶液作為系統(tǒng)適用性試驗用溶液，來確證色譜條件的適用性,6,專屬性試驗驗證圖譜,7,2 . 檢測波長的確定 涉及到各被檢測物質在該波長下的響應因子是否相同，即所謂重量校正因子的問題。（f=A雜質/A被測成分） 選取主成分與各雜質具有相同紫外吸收的波長（f=1.0）。 選取各雜質紫外吸收大于主成分紫外吸收的波長（f1.0），這樣

3、可更加嚴格控制雜質的限度。 如選取各雜質紫外吸收小于主成分紫外吸收的波長，應必須加入重量校正因子（f1.0），否則將得到錯誤的判斷。 目前國外有關該項研究的進展,8,3. 供試品溶液濃度的確定 （靈敏度試驗最低檢出量的測定） 供試品溶液濃度的設定至關重要。通常其設定是依據(jù)最低檢出量和最大進樣量來進行的。 最低檢出量雖然是個絕對值，但其真正的意義確是其相對值，即相對于供試品溶液中樣品濃度的多少而言。 其測定方法分為直觀評價法和依據(jù)信躁比兩種方法。 最大進樣量以不斷增加樣品溶液濃度，直至被分析物不拖尾的濃度為準,9,3. 供試品溶液濃度的確定 設定雜質總量不得過1.0%，最低檢出量通常需達到對照溶

4、液濃度的1/101/50（即相當于供試品溶液濃度的0.1%0.02%）。也就是說供試品溶液的濃度至少是最低檢出量的1000倍 20000 倍，又由于最低檢出量受各因素的不同而改變（即耐受性因數(shù)），故供試品溶液的濃度在保證不拖尾的情況下（即小于最大進樣量），可在此基礎上再設定的高一些，以保證該濃度可適用各種條件,10,3. 供試品溶液濃度的確定 舉例說明：進樣量為20l，主成分的最低檢出量為1g/ml（以濃度表示），規(guī)定雜質限度為1%，此時供試品溶液的濃度可設定為 1mg/ml 20mg/ml，或者再高一些，但始終需保持主成分峰不拖尾為準，即不超過最大進樣量。 拖尾情況也可通過流速進行適當調節(jié),

5、11,3. 供試品溶液濃度的確定,12,4. 加樣回收試驗（即準確性試驗） 準確性試驗可采用樣品中加入已知量雜質的方式來評價。準確稱量各雜質，將含有1% (w/w)濃度的各雜質加入到樣品溶液中，以驗證所采用的色譜條件是否可分離檢出出相應的各雜質。該原理同前面所述的專屬性研究是一致的,13,5. 流速、柱溫與溶劑的選擇 在測定時通常調節(jié)流速使主成分保留時間稍長些，且使主成分峰不拖尾即可。 柱溫對分離效果的影響雖有一定的影響，但不甚顯著，如有柱溫箱，通常設定不超過35。 溶劑的選擇應測定樣品溶液在該溶劑中的穩(wěn)定性來衡量，盡量勿選擇揮發(fā)性強的溶劑；同時應保證對照溶液的主成分峰面積精密度良好,14,6

6、. 積分參數(shù)的設定 積分參數(shù)的設定是非常重要的。它主要由斜率(Slope)、峰寬(Width)、最小峰面積(Min Area)組成。 采用自身對照法時，對照溶液與供試品溶液必須在同一斜率、峰寬下進行積分計算。 這里主要是供試品溶液的最小峰面積設定，它將直接導致測定結果。設定的太小，會導致很多小峰甚至是基線漂移的小峰均被積分出作為雜質峰，從而導致雜質峰面積增加，易判斷為不合格；如設定的太大，又將反應不出雜質的存在情況,15,6. 最小峰面積的設定 其設定，不是絕對值，而是相對值。 英國藥典中有明確的說明：凡有關物質的檢測采用HPLC法測定時，均規(guī)定舍棄對照溶液主峰面積幾分之幾的峰面積。普通樣品測

7、定時，通常為1/10 1/20（即相當于樣品測定濃度的0.1%0.05%）。如規(guī)定雜質限度為1.0%，對照溶液峰面積為10000，那么，最小峰面積可考慮設定為1000500左右。新藥穩(wěn)定性考核時，可設定到0.01%的最小峰面積。 同時請大家注意，在進行原料藥銷售與購買的合同中，為確保雙方達成一致意見，此點應予以重視,16,7. 保留時間的設定 經過上述方法學認證后，確定供試品溶液的保留時間，通常以洗脫出全部雜質和經強力破壞試驗出的雜質，規(guī)定至主成分保留時間的幾倍為止,17,8. 強力破壞試驗 水破壞 取原料適量，加水溶解后，在90放置24小時。 氧化破壞 取原料適量，用5%過氧化氫溶液溶解后，

8、在90放置24小時。 強堿破壞 取原料適量，用1mol/L氫氧化鈉溶液溶解后，在90放置24小時。 強酸破壞 取原料適量，加1mol/L鹽酸溶液溶解后，在90放置24小時。 高溫破壞 取原料適量，依據(jù)各自品種的熔點不同，在高溫下破壞至外觀性狀改變 強光破壞 取原料適量，置紫外燈下照射48小時,18,9. 定量檢測 如有關物質的檢查為定量檢測，即為雜質對照品法，在上述項目的各項研究后，需增加線性試驗以及一些必要的方法論證項目,19,10. HPLC/UV二極管陣列檢測器 采用二極管陣列檢測器進行論證，也是目前常采用的一個強有力的手段。它通過對一個色譜峰的幾點進行紫外掃描，然后比較所得到的掃描圖譜

9、的接近程度從而評價被檢測峰的純度。 我室有一臺該檢測器，曾多次做過該方面的工作,20,薄 層 色 譜 法,薄層色譜法由于既可檢測具有紫外吸收的物質，又可檢測不具有紫外吸收，因此也被廣泛地應用。但由于其不具有準確定量的性質，故其應用受到一定的限制。 1. 展開劑的確定 與HPLC法相同，配制含有1%濃度各中間體的主成分對照品溶液作為系統(tǒng)適用性試驗用溶液進行試驗，來確證展開劑的適用性,21,2 . 檢測方法的確定 可采用紫外燈下檢測，由于通常只具有兩種波長254mn和360nm，故測定有其局限性。 采用顯色的方法進行時，通常噴以顯色劑后需立即檢視,22,3 . 供試品溶液與對照溶液濃度的確定 （靈

10、敏度試驗最小檢出點樣量的測定） 其原理與HPLC法相同。 最低檢出量可采用不斷稀釋樣品溶液濃度，點樣直至觀測不到為止。 最大點樣量可采用不斷增加樣品溶液濃度，直至不拖尾的濃度為準。 通?？紤]到試驗耐受性因素的影響，將供試品溶液濃度設定為比最大點樣量略小一些為好。 該項試驗要求必須附有試驗的點樣圖譜照片。 目前USP、BP、EP中的一些規(guī)定,23,4 .定量的確定 由于TLC法通常無法準確定量，故可采用配制一系列濃度的對照溶液來衡量雜質介于何種濃度之間的方法進行，但此法較為煩瑣,24,紫外分光光度法（UV法,在一些溶液劑的雜質檢測中，也常采用在可見區(qū)某波長處測定樣品溶液的吸收度值，以不超過某限度

11、為準的方法。 這里需注意的是，同時需附有溶劑、輔料（制劑時）的紫外掃描圖譜，以驗證該法的專屬性,25,有關物質在質量標準中的制訂,1. 通常在原料藥的質量標準中，需制訂有關物質檢查項。制劑時，如經制劑工藝后，與原料藥比較有關物質有所增加或經穩(wěn)定性考核后，有關物質量有所增加，均應在質量標準中制訂有關物質檢查項，如未有明顯增加，可考慮不予以制訂,26,有關物質在質量標準中的制訂,2. 質量標準中的系統(tǒng)適用性試驗，應規(guī)定理論板數(shù)按主成分峰計應不低于多少（通常為2000） ，且最好能將相應的雜質（該雜質為最難分離的）訂入，以用于系統(tǒng)適用性試驗用溶液的配制，將雜質的濃度配制為主成分濃度的1%進行試驗，從

12、而確保本試驗在各種條件下均可準確進行。該法已在USP、BP、進口樣品和國外藥品資料中多次采用,27,有關物質在質量標準中的制訂,2. 舉例說明： 如： 供試品溶液濃度為0.5mg/ml； 對照溶液濃度為5g/ml（限度為1.0%） 系統(tǒng)適用性試驗用溶液： 對照品溶液濃度為0.5mg/ml； 最難分離雜質對照品濃度為5g/ml（1.0,28,有關物質在質量標準中的制訂,3。系統(tǒng)適用性試驗進行一強破壞試驗，以驗證分離度。如中國藥典中的氧氟沙星所有品種，均在HPLC法的色譜條件下擬定了：取供試品溶液，置紫外燈下（254nm）照射4小時以上，使產生的緊鄰主峰前的雜質峰與主峰的分離度應符合規(guī)定,29,有關物質在質量標準中的制訂,4。再如：國家藥品標準WS1-(X-350)-2004Z注射用奧美拉唑鈉的質量標準中規(guī)定：取供試品溶液，加3%過氧化氫溶液3ml，放置10分鐘后，再加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性驗證用溶液。色譜圖中與主成分峰相鄰的氧化降解產物峰與主成分峰的分離度應符合規(guī)定,30,典 型 圖 譜 分 析,31,有關物質在質量標準中的制訂,5。再如：進口的鹽酸氨溴索質量標準中規(guī)定：取對照品5mg，加甲醇1ml溶解后，加甲醛1滴，置60加熱5分鐘，氮氣吹干，殘渣用水5ml溶解，再加流動相稀釋至25ml，進樣測定，使產生的雜質B（相對保留時間為0.8）與