神經毒理學基本知識及實驗方法

1、神經毒理學基本知識及實驗方法,神經系統(tǒng)生理結構簡介,中樞神經系統(tǒng)與外周神經系統(tǒng) 細胞及其附屬器 神經系統(tǒng)信號傳遞 神經遞質 血-腦和血-神經屏障,中樞神經系統(tǒng)與外周神經系統(tǒng),細胞及其附屬器,神經細胞及膠質細胞 Astrocytes - star-shaped cells that help support the nutritional, immunological, and structural requirements of neurons. Oligodendrocytes - cells responsible for making the insulation of neurons

2、called myelin, a substance critical to the effective transmission of nerve impulses. Ependyma cells that line the brains system of ventricles, spaces that hold the fluid that bathes the brain. Microglia - cells that are activated by injury, infection, or degeneration to produce inflammation, remove

3、dead tissue, and help fight infections,細胞及其附屬器,神經系統(tǒng)信號傳遞,神經系統(tǒng)信號傳遞,神經遞質,遞質的釋放 遞質的種類 乙酰膽堿 去甲腎上腺素 - 氨基丁酸（GABA） 氨基乙酸 谷氨酸 天冬氨酸 NO,血-腦和血-神經屏障,保護神經系統(tǒng)免受某些神經毒物的毒性作用 血-腦屏障（blood-brain barrier, BBB） 血-神經屏障（blood-nerve barrier, BNB） 外周神經被兩層結締組織鞘膜，即神經束膜和神經外膜所覆蓋，并于神經內膜相互交織。BNB由神經內膜中的血管與神經外鞘的扁平細胞提供支持。它的作用不如BBB，因而背根

4、神經節(jié)一般較CNS中的神經細胞對神經毒物更為敏感,血-腦和血-神經屏障,神經毒物,神經毒物 神經毒物可泛指引起機體神經系統(tǒng)功能或結構損傷的外源性的物理、化學或生物因素。 外源性的化學物引起的神經毒性是損傷機體神經系統(tǒng)的主要因素，污染環(huán)境后會持續(xù)存在于我們的生產和生活環(huán)境中 現(xiàn)有神經毒物分類,現(xiàn)有神經毒物分類,按理化性質、用途 金屬類 溶劑類 氣體類 農藥類 藥物 天然毒素,按毒作用靶器官 神經細胞毒物 神經髓鞘毒物 神經軸索毒物 神經遞質毒物,請參考,金屬類,重金屬及其化合物：鉛、汞、砷、鎘。 非必需金屬及其化合物：鋁、銻、錫、鉈、鎳、鋰、鋇、鈹、鉍、金。 必需金屬及其化合物：鉻、銅、鐵、鎂、

5、錳、鈷、鉀、硒、鋅,溶劑類,脂肪族烴類：烷烴、烯烴、炔烴、汽油。 脂肪族環(huán)烴類：松節(jié)油、環(huán)丙烷、環(huán)丁烷、正己烷。 鹵化物：四氯化碳、氯仿、氯丁二烯、三氯苯、氯乙烯、三氯乙烯、四氯乙烯、二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、氯丹、氯苯、對-二氯苯、氯甲烷、1，2-二氯乙烷、多氯聯(lián)苯、三碘甲烷,溶劑類,醇類：乙醇、甲醇、1-丙醇、異丙醇、乙二醇、丙二醇、二乙二醇、丁醇、環(huán)己醇、二丙酮乙醇、2，5-己烷二醇。 酚類：甲酚、六氯酚。 其他：石油蒸餾物、甲醛、丙酮、甲基丁酮、丙烯酰胺、環(huán)氧化合物、烷基苯乙烯聚合物、乙酯、醋酸丁酯、醋酸戊酯、甲基乙酯、苯胺、松油脂、三甲酚磷酸酯、1-甲基-4苯基-1，2，3，6四氫吡

6、啶、興奮性氨基酸、磷酸三鄰甲苯酯,氣體類,一氧化碳、氫化氰、硫化氫、二硫化碳、燃燒產物、汽車尾氣、氨、氮氧化物,農藥類,有機磷類、擬除蟲菊酯、有機氯（開蓬、DDT,藥物及天然毒素,鴉片、可卡因、巴比妥、地西洋、阿霉素、長春新堿、鏈霉素、奎寧。 蛇毒、蝎毒、蓖麻子蛋白,按毒作用靶器官分類,神經細胞毒物：汞和汞化合物、錳、鋁、谷氨酸、氰化物、鉛、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）。 神經髓鞘毒物：六氯酚、三甲基錫、鉛、銻。 神經軸索毒物：正己烷、二硫化碳、taxol、長春新堿、丙烯酰胺、氯丙烯、除蟲菊酯。 神經遞質毒物：尼古丁、有機磷化合物、氨基甲酸酯類殺蟲劑、可卡因、興奮性

7、氨基酸、苯丙胺,神經毒作用,神經毒性(neurotoxicity)是指外源性的物理、化學或生物因素引起的生物體神經系統(tǒng)功能或結構損害的能力。 神經系統(tǒng)損傷 結構改變 功能改變 行為改變,神經毒作用結構改變,結構改變是指神經毒物作用后神經組織的細胞、軸索、髓鞘及細胞內超微結構發(fā)生的病理改變。 缺氧性損害：中樞神經系統(tǒng)對缺氧最為敏感，很多毒物可通過引起大腦缺氧而導致大腦器質性損傷。 毒物特異性損害：中樞神經系統(tǒng)特異性損害、周圍神經系統(tǒng)特異性損害、中樞周圍混合型損傷,缺氧性損害,吸入高濃度二氧化碳、氮氣、甲烷等單純性大腦缺氧。 神經肌肉阻斷劑箭毒堿呼吸肌麻痹。 一氧化碳、亞硝酸鹽、苯的氨基和硝基化合

8、物等親血紅蛋白毒物血紅蛋白攜氧能力損失。 氰化物、疊氮化物、二硝基苯酚、丙二腈細胞毒性缺氧，即供氧、供血充足但細胞能量代謝過程被阻斷。 影響心臟驟停的毒物或急性中毒合并心力衰竭供血不足引起缺血性缺氧,毒物特異性損害,鉛中毒智力低下、鉛中毒性腦病 汞及其有機化合物情緒不穩(wěn)、易激動、思維混亂、震顫、弱視、聽力喪失、共濟失調、癱瘓 MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶)引起不可逆的類似帕金森病的癥狀 錳類似帕金森病和運動障礙 孕婦使用可卡因嬰兒神經系統(tǒng)對外界刺激的反應和認知能力均有下降 孕婦大量飲酒其子代產生顱面畸形和智力低下 興奮性氨基酸等神經遞質類毒物、鋁、有機溶劑等中樞神經系

9、統(tǒng)損傷。 周圍神經系統(tǒng)特異性損傷毒物有機磷、丙烯酰胺、正己烷、氯丙烯、鉛、砷、二硫化碳等不同程度的感覺和運動功能障礙,神經毒作用,功能改變是在神經毒物引起神經細胞的結構和生化改變的基礎上而引起感覺、運動功能紊亂。 行為改變是中樞神經系統(tǒng)的綜合功能改變。神經毒物可引起腦的各種精神活動能力改變，如抽象思維、記憶與學習、情緒表現(xiàn)、覺醒狀態(tài)、感覺的感受能力、注意力等的改變。由于這些精神活動能力改變，從而出現(xiàn)各種精神障礙或行為缺陷。這些改變涉及大腦網狀結構、基底核、邊緣系統(tǒng)和大腦皮層等結構。由于這些結構受累，導致意識喪失、學習記憶下降、興奮或抑制、情緒性格等改變。這些改變可用行為毒理學方法檢查,神經毒性

10、作用特點,神經毒性表現(xiàn)可隨年齡的增長有所不同。如鉛中毒（血-腦屏障發(fā)育）。 神經系統(tǒng)損傷常持續(xù)存在。 有些神經細胞最初是過量存在的，因此對損傷具有一定的緩沖作用，神經細胞少量損失不會影響神經功能和行為活動。這種細胞過量存在的結果可能會使毒物的作用呈現(xiàn)一個閾值，或呈現(xiàn)非線性的劑量-反應關系。 神經毒性反應的表現(xiàn)可能是進行性的，輕微的功能損傷也可能變得異常嚴重。 某些物質特別是各種藥物在不同劑量下，神經系統(tǒng)可產生不同的反應。 化學物質的聯(lián)合接觸會產生相互作用,毒物作用一般機制,直接損傷作用 受體配體的相互作用與立體選擇性作用 干擾易興奮細胞膜的功能 干擾細胞能量的產生 與生物大分子結合 與蛋白質結

11、合 與核酸結合 與脂質結合 膜自由基損傷 細胞內鈣穩(wěn)態(tài)失調 選擇性細胞死亡 體細胞非致死性遺傳改變 誘發(fā)凋亡,神經毒性作用機制,神經遞質與神經毒性 通道與神經毒性 受體信號轉導與神經毒性 神經膠質細胞與神經毒性 細胞骨架與神經毒性,神經遞質與神經毒性,神經遞質釋放依賴于許多生物化學和電化學活動的協(xié)調作用，不僅與突觸前神經元的動作電位有關，還包括鈣動員和突觸前神經末梢遞質儲存囊泡與質膜的融合、融合后囊泡中的神經遞質被釋放到突觸間隙、與突觸后膜上高度特異性受體結合將化學信息再轉換成電信號或調控其他神經化學活動等一系列活動。 毒物可通過干擾遞質合成酶活性或遞質前體物質的利用影響神經遞質合成；可通過影

12、響囊泡中神經遞質的儲存或釋放、影響神經遞質滅活或清除（重攝取或遞質分解酶）、干擾神經遞質與受體作用或毒物本身直接與受體結合等作用影響神經系統(tǒng)正常功能,神經遞質與神經毒性,例： 有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑選擇性抑制乙酰膽堿酯酶活性，從而抑制乙酰膽堿遞質的滅活，造成突觸間隙大量乙酰膽堿遞質堆積，過度刺激突觸后膜上的相應受體，使突觸后神經元正?；顒邮艿接绊?，產生一系列中毒癥狀。 最強的脊椎動物神經遞質釋放激動劑之一的黑寡婦毒素(latrotoxin)可引起囊泡內的神經遞質暴發(fā)性非特異釋放，隨之破壞神經末梢。 可卡因和它的同類物通過抑制多巴胺和其他單胺的突觸重吸收提高突觸間隙多巴胺遞質濃度。 乙醇影響

13、兒茶酚胺類遞質釋放、吸收和代謝，并刺激GABA受體活性。 肉堿毒素阻斷神經肌肉接頭處的神經遞質乙酰膽堿的釋放，引起遲緩性癱瘓。破傷風毒素阻斷脊髓抑制性神經元產生的氨基酸類神經遞質釋放，導致肌肉強直，進一步發(fā)展為致死性僵硬和痙攣性抽搐。一些動物毒素如金環(huán)蛇毒素作用于突觸前，通過特異的減少遞質的釋放以阻斷神經肌肉傳遞從而致使從而致使運動終板對神經刺激不起反應,通道與神經毒性,Na+通道 河豚毒素(tetrodotoxin, TTX)能阻斷Na+通道電導的升高，破壞動作電位的生成。 擬除蟲菊酯類殺蟲劑和DDT引起神經元電壓門控Na+通道關閉延遲，神經元反復持續(xù)去極化造成神經系統(tǒng)過度興奮，表現(xiàn)為運動失

14、調、驚厥抽搐、振顫、易激惹和手舞足蹈綜合癥等。 局部麻醉藥普魯卡因和可卡因對Na+通道和K+通道均有阻斷作用,通道與神經毒性,Ca2+通道 Ca2+通道在神經和肌肉活動中（包括神經遞質和激素釋放、動作電位的生成和興奮性收縮偶聯(lián)等）發(fā)揮著重要作用，因此是許多治療藥物、神經毒素和神經毒物的潛在作用靶部位。傳統(tǒng)上將電壓依賴性Ca2+通道分為四型，即T-型、L-型、N-型和P-型 殺蟲劑胺菊酯阻斷成神經細胞瘤細胞和竇房結細胞的T-型Ca2+通道。 辛醇選擇性阻斷下橄欖體神經元T-型Ca2+通道，在成神經細胞瘤細胞中阻斷T-型和L-型Ca2+通道。 鉛是一種較強的N-型Ca2+通道非選擇性阻斷物,受體信

15、號轉導與神經毒性,受體 受體可被看作是能與毒物發(fā)生高親和性反應并產生特殊效應的大分子。 毒物分子可模擬內源性配基，引起激動劑樣作用。 毒物分子可能結合于受體，但并不引起激活效應，而是阻斷內源性配基的作用（即拮抗作用） 毒物可能對受體產生變構效應。如有些毒物不是結合于內源性配基的同一位點，而是結合于生物大分子的相鄰部位，這種作用可引起構象變化而影響受體與神經遞質的結合。 由谷氨酸傳遞的神經毒性被稱為興奮毒性（excitoxicity）。 信號轉導因子 神經毒物除了可影響受體以外，還可以影響細胞內信號轉導因子如Ca2+ 、肌醇磷酸酯、蛋白激酶等。 即早反應基因c-fos的表達被認為是神經毒性的潛在

16、標記。 有機氯殺蟲劑林丹柯引起大腦皮層和海馬的c-fos的表達，并具有劑量效應關系。 接觸丙烯酰胺的大鼠腦組織也發(fā)現(xiàn)c-fos和c-jun表達增加,神經膠質細胞與神經毒性,星型膠質細胞在許多神經毒性損傷中既有防御作用又有促進作用。 如，在中樞神經系統(tǒng)谷氨酸穩(wěn)態(tài)研究中，星型膠質細胞在興奮性神經遞質谷氨酸代謝中具有重要作用：星型膠質細胞具有高親和性谷氨酸遞質攝取系統(tǒng)，它們可通過谷氨酸重攝取或經谷氨酰胺合成酶催化作用將谷氨酸代謝為谷氨酰胺，調節(jié)控制細胞外谷氨酸水平。星型膠質細胞還可直接引起中樞神經系統(tǒng)損傷。星型膠質細胞中的谷氨酸-谷氨酰胺通路是腦組織中谷氨酸遞質的微型儲備庫。星型膠質細胞腫脹會引起遞

17、質釋放,細胞骨架與神經毒性,細胞骨架是軸漿運輸本身所固有的結構成分，也是一個易感位點,神經毒理學研究方法,神經學檢查 腦神經 運動功能檢查 反射性檢查 步態(tài)異常檢查,神經毒理學研究方法,形態(tài)學檢查 神經元胞體 神經元核周體 軸突的近端或遠端 髓鞘 星型膠質細胞 內皮細胞,神經毒理學研究方法,電生理檢查 外周神經：運動神經傳導速度的測定、感覺神經傳導速度和動作電位測定、慢纖維傳導速度的測定等 肌電圖：將電極探針插入肌肉，在靜息和肌肉收縮時，記錄和檢查肌肉的電活動。 神經毒性作用可表現(xiàn)為：異常的插入性活動；靜息肌肉的自發(fā)性電活動；隨意性肌肉收縮期間，運動單位出現(xiàn)干擾圖形,神經毒理學研究方法,生化檢

18、查 糖代謝過程中涉及的酶系統(tǒng) 蛋白質合成 亞細胞結構 髓鞘成分 神經系統(tǒng)特殊位點的神經遞質水平 通過使用促效劑和拮抗劑，觀察神經遞質受體的結合情況,神經毒理學研究方法,行為檢查（大鼠或小鼠精神行為初步測試項目） 神經行為功能測試 行為測試 感覺 視覺、嗅覺、本位感覺、聽覺 定位 痛覺 甩尾 空間定位（方向） 翻正反射 運動 自發(fā)性動作 Automex活動 肌肉無力 前肢抓物、后肢伸肌試驗 認知能力 學習與保持能力 一路式回避法 多步式回避 情感反應 反應性 對陣風的驚異性 對新奇環(huán)境的應激性 生理完善性 體溫調節(jié) 體重 進食與飲水情況 主要部位體溫,神經毒理學研究方法,行為檢查（大鼠或小鼠精神行為二級測