QIAGEN-DNA甲基化試劑盒說明中文版

1、QIAGEN EpiTect Bisulfite 重亞硫酸鹽處理DNA時，需要經(jīng)高鹽濃度、高溫和低PH條件，會導(dǎo)致DNA斷裂和片段化，并在隨后的純化過程中丟失，所以需要大量的input DNA 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化未甲基化的胞嘧啶，轉(zhuǎn)化率超過99% Bisulfite Mix 足夠做8個反應(yīng)，用時要將Bisulfite Mix溶于800l RNase-free water中，溶解的Bisulfite Mix 在-20可以保存4周 DNA Protect Buffer 能保護重亞硫酸鹽處理的DNA在高溫、低ph條件下被片段化 Carrier RNA 能提高小量DNA（小于500pg，體積大于40l）綁

2、定在回收柱濾膜上的效率，幫助核酸沉淀；總量大于100ng的基因組DNA沒有必要加Carrier RNA EpiTect Bisulfite Kit 在-20可以保存3年；可以適用于大范圍的DNA量，input DNA范圍為1ng2g；模板DNA片段范圍可以在500bp30kb之間ProtocolDNA量在1ng2g之間，體積20l以上開始前的準備重點： Bisulfite Mix 足夠做8個反應(yīng)，如果樣本少于8個，可以把溶解的Bisulfite Mix 保存于-20，4周內(nèi)并不會影響其性能 DNA Protect Buffer在加入DNABisulfite Mix后會由綠變藍（step 2），

3、表明溶液混合很充分且PH值正確 所有的離心分離步驟均在室溫（1525C）下完成開始前準備的東西： 加入30ml乙醇（96%100%）到Buffer BW中，室溫（1525C）保存，使用之前搖勻 加入27ml乙醇（96%100%）到Buffer BD中，28保存，使用之前搖勻，使用之后要立即蓋上蓋子。儲存一段時間后底部可能會出現(xiàn)白色沉淀，沉淀不影響B(tài)uffer BD的性能，但是還是要避免將沉淀吸到回收柱中。 加入310l RNase-free water到凍干的carrier RNA（310 g）中，配成1 g/l的溶液。當一次處理48個樣本，將溶解的carrier RNA加入到Buffer B

4、L的瓶子中，搖勻并確認瓶蓋標簽。如果處理的樣本較少，則將溶解的carrier RNA分裝，并儲存于-20，分裝的carrier RNA能保存1年。如果少于48個樣本要在2周之內(nèi)完成處理，則參照表1的體積比取一定體積的Buffer BL與carrier RNA混合。DNA量大于100ng不需要加carrier RNA。如果Buffer BL有沉淀，則需加熱（最高不超過70）并溫和攪拌使其溶解。表1 Buffer BL與carrier RNA的體積比 室溫平衡樣本和Buffers實驗流程重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化DNA1. 融化DNA備用，溶解Bisulfite Mix，加入800l RNase-free w

5、ater，混勻5min使其完全溶解。如有必要，60加熱并混勻Bisulfite MixRNase-free water溶液使其溶解。注意不要將溶解的Bisulfite Mix置于冰上。2. 在200l離心管中配制重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化反應(yīng)液，參照表2配制反應(yīng)體系，DNA體積不足20 l則用RNase-free water補足。（處理低濃度DNA（1500ng或小于500pg）時，DNA體積增加到40l，DNA Protect Buffer減少為15l，總體積140l不變）表2 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系3. 蓋上PCR管蓋，混勻反應(yīng)液，置于室溫（1525C）。DNA Protect Buffer在加入DN

6、ABisulfite Mix后會由綠變藍，表明混勻充分且PH值正確。4. 在循環(huán)加熱器上進行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化DNA反應(yīng)，反應(yīng)條件參照表3。整個反應(yīng)過程需要5h。表3 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件5. 將PCR管放入循環(huán)加熱器中，開始轉(zhuǎn)化反應(yīng)。注意PCR管中不要加入礦物油，保證管蓋密封。已經(jīng)轉(zhuǎn)化的DNA可以在循環(huán)加熱器中保存過夜，不會影響其性能。純化重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的DNA6. 待轉(zhuǎn)化反應(yīng)完成之后，取出PCR管，瞬時離心，再將PCR管中的反應(yīng)液轉(zhuǎn)到一個1.5ml的干凈的離心管中。轉(zhuǎn)移反應(yīng)液不影響其性能。7. 在每個樣本中加入560l現(xiàn)配的Buffer BL（參照表1加入10g/ml carrier RNA

7、），渦流混勻并瞬時離心。如果DNA大于100ng，則不需要加入carrier RNA。（處理FFPE樣本或DNA量小于500pg的樣本時，加入現(xiàn)配的Buffer BL的體積減少為310l（加入10g/ml carrier RNA），混勻離心，之后再加入250l 96100% 乙醇，混勻15s后瞬時離心）8. 將收集管和回收柱按樣本編號并放置在架子上，將1.5ml離心管中的樣本混合液全部轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的回收柱內(nèi)。9. 以離心機最大轉(zhuǎn)速離心1min，棄收集管內(nèi)的液體，再將回收柱放回收集管中。10. 在每個回收柱內(nèi)加入500 l Buffer BW（wash buffer），用最大轉(zhuǎn)速離心1min，棄收

8、集管內(nèi)的液體，再將回收柱放回收集管中。11. 在每個回收柱內(nèi)加入500 l Buffer BD（desulfonation buffer，脫磺酸基），蓋上回收柱蓋子，室溫（1525C）放置15min。如果Buffer BD中有沉淀，避免將沉淀加到回收柱內(nèi)。裝有Buffer BD的瓶子在使用后要立即蓋上蓋子，避免接觸的空氣中的CO2發(fā)生酸化。12. 以離心機最大轉(zhuǎn)速離心1min，棄收集管內(nèi)的液體，再將回收柱放回收集管中。13. 在每個回收柱內(nèi)加入500 l Buffer BW，用最大轉(zhuǎn)速離心1min，棄收集管內(nèi)的液體，再將回收柱放回收集管中。14. 重復(fù)步驟13一次。15. 將回收柱放到一個新的2ml收集管中，以離心機最大轉(zhuǎn)速離心1min，移除所有的殘余液體。16. （推薦）將回收柱放到一個干凈的1.5ml離心管中，56加熱5min，使殘余的液體完全蒸發(fā)。17. 再將回收柱轉(zhuǎn)移到一個新的1.5ml離心管中，在每個回收柱的濾膜上加20l Buffer EB，然后15000g（12000rpm）離心1min