克隆基因的表達(dá)

1、原核生物作為基因表達(dá)系統(tǒng)的受體細(xì)胞所具有的特點(diǎn),原核生物大多數(shù)為單細(xì)胞異養(yǎng)，生長(zhǎng)快，代謝易于控制，可通過(guò)發(fā)酵迅速獲得大量基因表達(dá)產(chǎn)物。 基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，便于基因操作和分析。 多數(shù)原核生物細(xì)胞內(nèi)含有質(zhì)?；蚴删w，便于構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體。 生理代謝途徑及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制比較清楚。 不具備真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物無(wú)特定的空間構(gòu)相。 內(nèi)源蛋白酶會(huì)降解表達(dá)的外源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定,pIJ486 是鏈霉菌的質(zhì)粒（如下圖所示），其中 neo 和 tsr 分別為新霉素和硫鏈絲菌素的抗性基因。為了準(zhǔn)確克隆并篩選出目的 DNA 片段的克隆，最為理想的插入位點(diǎn)是？說(shuō)明其原因,位點(diǎn)為tsr內(nèi)的Eco

2、RV。當(dāng)外源基因插入EcoRV位點(diǎn)時(shí)，硫鏈絲菌素基因失活。利用新霉素來(lái)篩選重組子,怎樣將一個(gè)平末端DNA片段插入到EcoR I限制位點(diǎn)中去,化學(xué)合成一些長(zhǎng)為10bp含有EcoRI識(shí)別位點(diǎn)的短的DNA片段，然后與待克隆片段兩端連接起來(lái)，如果用EcoRI切割這種連接片段，就會(huì)產(chǎn)生EcoRI的單鏈末端。這種片段就可以插入到任何EcoRI的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)中,列舉兩種外源基因轉(zhuǎn)化的方法? 如何提高其轉(zhuǎn)化效率,CaCl2處理后的細(xì)菌轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染：低溫和CaCl2處理制備感受態(tài)細(xì)胞，使細(xì)胞膜通透性增加，處于容易捕捉和接受外源DNA 的狀態(tài)。 電穿孔轉(zhuǎn)化法：利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細(xì)胞膜上進(jìn)行電穿孔，形

3、成可逆的瞬間通道，從而促進(jìn)外源DNA的有效吸收,質(zhì)粒的大小，拷貝數(shù)；受體細(xì)胞的狀態(tài)；轉(zhuǎn)化的外在條件，如溫度等;質(zhì)粒與宿主菌的比例,建立了一個(gè)基因文庫(kù)后，如何鑒定一個(gè)攜帶目的基因的克隆,1 基因表達(dá)的機(jī)制,1.1 外源基因的起始轉(zhuǎn)錄,外源基因的起始轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達(dá)的限速步驟。選擇可調(diào)控的啟動(dòng)子和相關(guān)的調(diào)控序列，是構(gòu)建一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)首先要考慮的問(wèn)題,原核生物啟動(dòng)子,誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,組成型啟動(dòng)子,如lac、trp、PR、 PL、 tac等的啟動(dòng)子,如T7噬菌體的啟動(dòng)子,真核生物啟動(dòng)子也可分為誘導(dǎo)型和組成型等類(lèi)型,mRNA的延伸與穩(wěn)定,外源基因起始轉(zhuǎn)錄后，保持mRNA的有

4、效延伸、終止及穩(wěn)定存在是外源基因有效表達(dá)的關(guān)鍵,一方面，要防止因轉(zhuǎn)錄物內(nèi)的衰減和非特異性終止而誘發(fā)的mRNA轉(zhuǎn)錄提前終止的現(xiàn)象； 另一方面，又要存在正常的轉(zhuǎn)錄終止序列以防止產(chǎn)生不必要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，使mRNA的長(zhǎng)度限制在一定的范圍內(nèi)，從而增加外源基因表達(dá)的穩(wěn)定性,外源基因mRNA的有效翻譯,外源基因mRNA有效翻譯必須考慮的基本原則,AUG(ATG)是首選的起始密碼子。 SD序列為與核糖體16S rRNA互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，該序列至少含有AGGAGG序列中的4個(gè)堿基。 SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離為39個(gè)堿基。 在翻譯起始區(qū)周?chē)蛄胁灰仔纬擅黠@的二級(jí)結(jié)構(gòu),不同基因組使用密碼子具有選擇性,主密碼子

5、（major codon,罕用密碼子（rare codon,如果外源基因mRNA的主密碼子與受體細(xì)胞基因組的主密碼子相同或接近，則該基因表達(dá)的效率就高； 反之，若外源基因含有較多的罕用密碼子，其表達(dá)效率就低,1.4 表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性,避免外源基因表達(dá)蛋白降解的對(duì)策,構(gòu)建融合蛋白表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)建分泌蛋白表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)建包涵體表達(dá)系統(tǒng),選擇蛋白水解酶基因缺陷型的受體系統(tǒng),1.5 目的基因沉默,基因沉默的作用機(jī)制,位置效應(yīng)的基因沉默,轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默,轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默,是指基因在基因組中的位置對(duì)其表達(dá)的影響,是在DNA水平上的基因調(diào)控,是在RNA水平上的基因調(diào)控,第七章 克隆基因的表達(dá),基

6、因激活,轉(zhuǎn)錄起始,mRNA水平,蛋白質(zhì)水平,克隆基因的表達(dá),第一節(jié) 基因表達(dá)的基本過(guò)程 第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá) 第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá) 第四節(jié) 提高外源基因表達(dá)效率的途徑,基因表達(dá)(gene expression)是指儲(chǔ)存遺傳信息的基因經(jīng)過(guò)一系列步驟表現(xiàn)出其生物功能的整個(gè)過(guò)程。典型的基因表達(dá)是基因經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯，產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)的過(guò)程,第一節(jié) 基因表達(dá)的基本過(guò)程,基因表達(dá)的基本過(guò)程,基因表達(dá)的基本過(guò)程,基因的表達(dá)主要涉及到兩個(gè)過(guò)程：轉(zhuǎn)錄和翻譯。 首先，目的基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄(transcription)形成mRNA（信使RNA, messenger RNA,然后， tR

7、NA （轉(zhuǎn)運(yùn)RNA, transfer RNA）將各種氨基酸運(yùn)送到核糖體并按照mRNA的密碼子順序?qū)⒏鞣N氨基酸連接成特定的氨基酸序列(translation) 最終得到基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì),基因表達(dá)機(jī)制,1. 外源基因的起始轉(zhuǎn)錄,外源基因的起始轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟，轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達(dá)的限速步驟。因此，啟動(dòng)子是關(guān)鍵,2. mRNA的延伸和穩(wěn)定性,外源基因起始轉(zhuǎn)錄后，保持mRNA的有效延伸、終止及穩(wěn)定存在是外源基因有效表達(dá)的關(guān)鍵。另外， mRNA的穩(wěn)定性直接決定翻譯產(chǎn)物的多少,思考,基因表達(dá)與克隆基因表達(dá)的異同,表達(dá)的對(duì)象、過(guò)程、場(chǎng)所,克隆基因的表達(dá),外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá),外源基因

8、,表達(dá)載體,重組載體,導(dǎo)入宿主細(xì)胞,在宿主細(xì)胞中 表達(dá)出蛋白質(zhì),提取蛋白,宿主細(xì)胞,原核細(xì)胞或真核細(xì)胞,基因激活,轉(zhuǎn)錄起始,mRNA水平,蛋白質(zhì)水平,原核中表達(dá),真核中表達(dá),外源基因,用原核生物作宿主,A dividing E. coli,第一節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),原核或噬菌體啟動(dòng)子,MCS,SD序列,終止子,大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征,大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì),全基因組測(cè)序，共有4405個(gè)開(kāi)放型閱讀框架 基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善 繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定 被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物,大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征,大腸桿菌表達(dá)外源基因的

9、劣勢(shì),缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能 缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng) 內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白 細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類(lèi)繁多的內(nèi)毒素,一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn),二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng),三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控,四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位,六、影響外源基因表達(dá)效率的因素,五、幾種類(lèi)型的原核表達(dá)載體,七、提高表達(dá)水平常用的方法,九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾,十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷,八、細(xì)菌表達(dá)載體舉例,原核基因表達(dá),識(shí)別原核細(xì)胞的啟動(dòng)子，催化所有的RNA合成,數(shù)個(gè)相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因與其調(diào)控區(qū)結(jié)合形成一個(gè)表達(dá)的協(xié)同單位,一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn),2. 以操縱子為單位,1

10、. 只有一種RNA多聚酶,乳糖操縱元（lac operon）的結(jié)構(gòu),lacI,lacZ lacY lacA,PlacI Plac Olac,RNA,DNA,lacZ lacY lacA,lacI,乳糖阻遏物（單體、四聚體） -半乳糖苷酶 滲透酶 乙酰轉(zhuǎn)移酶,Protein,乳糖 葡萄糖半乳糖,增加乳糖的吸收 功能未知,有意義鏈,5,反意義鏈,3,轉(zhuǎn)錄,mRNA,5,3,翻譯,蛋白質(zhì),N,C,5,3,3. 轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)、連續(xù)進(jìn)行,4. 不含內(nèi)含子，缺乏轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng),5. 調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上,含有一個(gè)啟始密碼子和一段同核糖體16SRNA3末端堿基互補(bǔ)的序列，叫Shine-Dalgarno（

11、S-D）序列,6. mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn),Shine-Dalgarno（S-D）sequence,一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn),二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng),三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控,四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位,六、影響外源基因表達(dá)效率的因素,五、幾種類(lèi)型的原核表達(dá)載體,七、提高表達(dá)水平常用的方法,九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾,十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷,八、細(xì)菌表達(dá)載體舉例,原核基因表達(dá),二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng),外源基因不能帶有內(nèi)含子,2. 必須用cDNA,3. 不能直接用真核基因組DNA,4. 必須利用原核細(xì)胞的調(diào)控原件（啟動(dòng)子等,5. 防止外源基因產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的毒害,為何,

12、一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn),二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng),三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控,四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位,六、影響外源基因表達(dá)效率的因素,五、幾種類(lèi)型的原核表達(dá)載體,七、提高表達(dá)水平常用的方法,九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾,十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷,八、細(xì)菌表達(dá)載體舉例,原核基因表達(dá),大腸桿菌基因表達(dá)載體基本結(jié)構(gòu)特征,三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控,是DNA上的能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列,大腸桿菌的所有啟動(dòng)子中都有兩段一致順序（consensus sequence,1. 啟動(dòng)子,35 Box 和 -10 Box,1） 啟動(dòng)子序列,consensus sequenc

13、es,5-TTGACA-3,5-TATAAT-3,-10box（Pribnow Box,TTGACA,TATAAT,轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),17bp,5,核糖體結(jié)合位點(diǎn),RNA聚合酶 亞基的識(shí)別位點(diǎn),-35box,原核啟動(dòng)子共有序列的功能,2 翻譯的起始位點(diǎn),核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ RBS,1）Shine-Dalgarno（SD） sequence,mRNA上與核糖體16sRNA結(jié)合的序列,ribosome binding site,SD,mRNA 5AGGAGGUAUG,16S rRNA3,UCCUCCA,S-D序列距離AUG的距離也影響翻譯,AUG（91%） GUG（8%） UUG（1,位于SD序列下游,

14、ii）起始密碼,全酶是一個(gè)5聚體，含有兩個(gè)小亞基，和2兩個(gè)大亞基（和），一個(gè)亞基,3 RNA多聚酶,大腸桿菌只有一種類(lèi)型的RNA多聚酶轉(zhuǎn)錄tRNA，rRNA和mRNA,結(jié)構(gòu),4. 轉(zhuǎn)錄終止子,內(nèi)終止子,intrinsic terminator,E.coli中促使轉(zhuǎn)錄終止的DNA位置有一段反向回文順序，其后緊接一串A，稱(chēng)為內(nèi)終止子，形成終止信號(hào),在表達(dá)載體克隆位點(diǎn)的下游一般設(shè)計(jì)一段轉(zhuǎn)錄終止子,啟動(dòng)子,操縱子,S-D序列,目的基因,終止子,由于莖環(huán)3段緊接一串A/U的配對(duì)，穩(wěn)定性比較差，有利于轉(zhuǎn)錄物脫落而不利于轉(zhuǎn)錄延續(xù),終止形成的原因,反向回文順序被轉(zhuǎn)錄后，立即形成一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使轉(zhuǎn)錄物與模板之間

15、配對(duì)的堿基數(shù)降低，整個(gè)減弱了RNA 與DNA的互作,莖環(huán)結(jié)構(gòu),多聚A/U,5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-3 3-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板,轉(zhuǎn)錄,5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA,RNA折疊,mRNA折疊,U C,C,U G,GC,AU,CG,CG,GC,CG,CG,GC,A A,CCCAC UUUU3,DNA,RNA聚合酶,脫落,大腸桿菌偏愛(ài)UAAU。一般安置上全部的三個(gè)終止密碼防止核糖體跳躍（skip

16、ping,5. 翻譯終止密碼,6. 翻譯增強(qiáng)子,Translation enhancer,能夠顯著增強(qiáng)外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)效率的特殊序列,T7噬菌體基因10前導(dǎo)序列（簡(jiǎn)稱(chēng)g10-L序列）; 大腸桿菌atpE基因mRNA5-UTR中富含U的區(qū)段,21,1 基因表達(dá)的機(jī)制,1.1 外源基因的起始轉(zhuǎn)錄,外源基因的起始轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達(dá)的限速步驟。選擇可調(diào)控的啟動(dòng)子和相關(guān)的調(diào)控序列，是構(gòu)建一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)首先要考慮的問(wèn)題,原核生物啟動(dòng)子,誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,組成型啟動(dòng)子,如lac、trp、PR、 PL、 tac等的啟動(dòng)子,如T7噬菌體的啟動(dòng)子,真核生物啟動(dòng)子也可分為誘導(dǎo)

17、型和組成型等類(lèi)型,必須是一種強(qiáng)啟動(dòng)子,能使外源基因的蛋白產(chǎn)量達(dá)到細(xì)胞總蛋白的10%-30%以上,應(yīng)呈現(xiàn)低水平的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄,便于表達(dá)毒性蛋白等,應(yīng)是可誘導(dǎo)型的,用溫度或化學(xué)試劑誘導(dǎo),最佳啟動(dòng)子必須具備的條件,7. 基因工程常用的原核啟動(dòng)子,一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn),二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng),三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控,四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位,六、影響外源基因表達(dá)效率的因素,五、幾種類(lèi)型的原核表達(dá)載體,七、提高表達(dá)水平常用的方法,九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾,十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷,八、細(xì)菌表達(dá)載體舉例,原核基因表達(dá),四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位,1. 細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),1）包涵

18、體（inclusion body,是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種不溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物,形成原理未知,在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人生長(zhǎng)激素（human growth hormone, hGH,例,使重組蛋白易于分離、免受蛋白酶降解、不損害寄主細(xì)胞,回收的蛋白生物活性差,缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn),2. 周質(zhì)中表達(dá),1）周質(zhì)（periplasm,格蘭氏陰性大腸桿菌位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分,蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)的復(fù)雜機(jī)理目前不完全清楚,優(yōu)點(diǎn)： 容易被濃縮和純化、有利于正確折疊、被降解的少,由于需要穿過(guò)兩層膜，大腸桿菌只能分泌極少的蛋白質(zhì)到培養(yǎng)基中，效果都不太理想,用溶血素（hemolysin）基因構(gòu)建

19、分泌性融合蛋白,使在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中,3. 胞外表達(dá),或與細(xì)菌素釋放蛋白（bacteriocin release protein)共表達(dá),一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn),二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng),三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控,四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位,六、影響外源基因表達(dá)效率的因素,五、幾種類(lèi)型的原核表達(dá)載體,七、提高表達(dá)水平常用的方法,九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾,十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷,八、細(xì)菌表達(dá)載體舉例,原核基因表達(dá),一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn),二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng),三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控,四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位,六、影響

20、外源基因表達(dá)效率的因素,五、幾種類(lèi)型的原核表達(dá)載體,七、提高表達(dá)水平常用的方法,九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾,十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷,八、細(xì)菌表達(dá)載體舉例,原核基因表達(dá),載體表達(dá)出的外源基因蛋白質(zhì)不與細(xì)菌的任何蛋白質(zhì)融合在一起,S-D序列,ATG-外源基因-TAG,優(yōu)點(diǎn),五、幾種類(lèi)型的原核表達(dá)載體,1. 非融合型表達(dá)載體,產(chǎn)物結(jié)構(gòu)接近于真核細(xì)胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),缺點(diǎn),容易被宿主菌的蛋白酶所破壞,哈佛大學(xué)的Gilbert實(shí)驗(yàn)室建立的。表達(dá)能力強(qiáng),舉例：pKK223-3 載體,組成結(jié)構(gòu),強(qiáng)啟動(dòng)子: tac（trp-lac,trp的-35區(qū),lacUV5的-10區(qū),lac操縱基因,操縱基因,乳糖操

21、縱子系統(tǒng),終止子,調(diào)節(jié)基因,Lac I,宿主菌染色體上的乳糖操縱子系統(tǒng)。 如JM105菌,rrnB的強(qiáng)終止子,rrnB強(qiáng)終止子,S-D,插入位點(diǎn)區(qū),S-D序列和插入位點(diǎn)區(qū),tac P,Lac O,S-D,插入位點(diǎn)區(qū),rrnB T,宿主lac I,載體的其余部分,來(lái)自pBR322質(zhì)粒,表達(dá)誘導(dǎo)物： IPTG（乳糖的類(lèi)似物，不會(huì)被降解,阻遏物,IPTG,啟動(dòng)子,載體表達(dá)出的外源蛋白質(zhì)與細(xì)菌的分泌信號(hào)肽連在一起，可被宿主菌分泌到細(xì)胞周質(zhì)中,如：pIN III系列,2. 分泌型表達(dá)載體,pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,1）組成結(jié)構(gòu),Ipp,lac

22、 P,lac O,S-D/ATG,ompa,插入位點(diǎn),Ipp（脂蛋白基因啟動(dòng)子）和lacUV5啟動(dòng)子,調(diào)節(jié)基因：lac I S-D序列和起始密碼ATG。 分泌信號(hào)肽,大腸桿菌外膜蛋白基因ompa,插入位點(diǎn)區(qū)（多克隆位點(diǎn),強(qiáng)啟動(dòng)子,pIN III-comA1,表達(dá)出的外源基因產(chǎn)物蛋白是與質(zhì)粒載體上的菌體蛋白連接在一起的,啟動(dòng)子：tac 操縱基因：lacP 調(diào)節(jié)基因：lacI S-D序列,3. 融合蛋白表達(dá)載體系統(tǒng)-pGEX系列,1）優(yōu)點(diǎn),2）組成結(jié)構(gòu),便于融合蛋白的分離和純化,22,lacI,tac,lac O,S-D/ATG,GST,插入位點(diǎn),TGA,lacP,ori：pBR322 ori 融

23、合肽：GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶,GST融合蛋白用Glutathione Sepharose親和層析柱分離純化,3）產(chǎn)物提純,4）產(chǎn)物分離,用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白從GST上切下來(lái),柱（column,GST,外源蛋白,凝血酶,外源蛋白,柱（column,GST,GST,洗脫,柱（column,可再利用,5）其他融合蛋白系統(tǒng),His-tag（組氨酸標(biāo)簽,在外源多肽的N端或C端接上6個(gè)組氨酸（His,His-tag能與Ni2+柱結(jié)合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脫下來(lái)，可以純化蛋白質(zhì),人胰島素在大腸桿菌中的表達(dá),溴化氰,Cyanogen bromide,一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn),二

24、、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng),三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控,四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位,六、影響外源基因表達(dá)效率的因素,五、幾種類(lèi)型的原核表達(dá)載體,七、提高表達(dá)水平常用的方法,九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾,十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷,八、細(xì)菌表達(dá)載體舉例,原核基因表達(dá),5-TTGACA-3,5-TATAAT-3,-35box,-10box（Pribnow Box,六、影響外源基因表達(dá)效率的因素,1. 啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)對(duì)表達(dá)效率的影響,RNA聚合酶 亞基的識(shí)別位點(diǎn),1）一致順序,2）-35區(qū)與-10區(qū)之間的距離,間隔為17bp時(shí)，啟動(dòng)子最強(qiáng),3） -35區(qū)和-10區(qū)的堿基順序,越接近一致順序，啟動(dòng)子

25、越強(qiáng),5-TTGACA,TATAAT,一致順序,lac,trp,PL,recA,tac I,tac II,5-TTTACA,TATGTT,5-TTGACA,TTAACT,5-TTGACA,GATACT,5-TTGATA,TATAAT,5-TTGACA,TATAAT,5-TTGACA,TTTAAT,35box,10box,5-AGGAGGU-3,S-D序列后面的4個(gè)堿基： 如果是A（T）, 翻譯效率最高； 如果是G（C）,效率只有50%或25,2. 轉(zhuǎn)譯起始序列對(duì)表達(dá)效率的影響,1）S-D序列,SD 序列與16Sr分子之間的堿基互補(bǔ)程度，可明顯地影響mRNA的轉(zhuǎn)譯速率當(dāng)序列為，可與16Sr端完全

26、互補(bǔ)，轉(zhuǎn)譯效率最高；而當(dāng)該序列發(fā)生單堿基突變時(shí)，轉(zhuǎn)譯效率便會(huì)下降倍,AUG左側(cè)的三個(gè)堿基也有影響,2）起始密碼AUG,半乳糖苷酶的mRNA中： AUG左側(cè)如果是UAU或CUU時(shí)，最為有效； 如果是UUC、UCA或AGG時(shí)下降20倍,AUG右側(cè)的三個(gè)堿基也有影響,多順?lè)醋拥膍RNA與核糖體的結(jié)合位點(diǎn)有一個(gè)或幾個(gè)終止密碼。 噬菌體外殼蛋白或核糖體蛋白mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)有多個(gè)U,3） 其它,終止子能有效控制目的基因mRNA的長(zhǎng)度、提高mRNA的穩(wěn)定性,3. 啟動(dòng)子與外源基因之間的距離,轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的存在保證載體不會(huì)轉(zhuǎn)錄非必須基因，不必浪費(fèi)源量和能量、不會(huì)干擾正常的表達(dá),增加載體的拷貝數(shù)會(huì)增加轉(zhuǎn)錄

27、出的mRNA數(shù)目。增加表達(dá)效率,4. 轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對(duì)表達(dá)效率的影響,5.載體拷貝數(shù)及穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響,6.外源蛋白在菌體中的穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響,但過(guò)度的外源基因的表達(dá)會(huì)影響宿主的正常生長(zhǎng),一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn),二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng),三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控,四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位,六、影響外源基因表達(dá)效率的因素,五、幾種類(lèi)型的原核表達(dá)載體,七、提高表達(dá)水平常用的方法,九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾,十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷,八、細(xì)菌表達(dá)載體舉例,原核基因表達(dá),選擇強(qiáng)啟動(dòng)子序列，如tac 等,七、提高表達(dá)水平常用的方法,2. 調(diào)整S-D序列與AUG堿的距離,距離過(guò)

28、長(zhǎng)或過(guò)短都影響真核基因的表達(dá)。根據(jù)不同的啟動(dòng)子選擇不同的距離,3. 改變起始密碼下面的幾組密碼子,一般為5-9bp,能提高翻譯的起始效率,4. 增加mRNA的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性,在外源基因的下游插入“重復(fù)性基因外回文序列”能防止mRNA受到35外切酶的攻擊,5. 減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷,合理地調(diào)節(jié)代謝負(fù)荷與外源基因高效表達(dá)的關(guān)系,將宿主生長(zhǎng)代謝與外源基因表達(dá)分開(kāi),1）誘導(dǎo)表達(dá),一般采用溫度誘導(dǎo)或藥物誘導(dǎo),cI857阻遏物有活性，抑制PL啟動(dòng)子，外源基因不表達(dá)，宿主大量生長(zhǎng),32C,42C,cI857阻遏物失活，PL啟動(dòng)子啟動(dòng)，外源基因高水平表達(dá)，宿主生長(zhǎng)受到限制,cI857,PL,外源基因,PO,

29、PL啟動(dòng)子是溫度誘導(dǎo)型,調(diào)節(jié)基因lac I（位于宿主基因組內(nèi)或載體上）始終產(chǎn)生阻遏物,無(wú)IPTG,阻遏物與lac操縱基因結(jié)合，抑制外源基因轉(zhuǎn)錄。宿主大量生長(zhǎng),有IPTG,阻遏物與IPTG結(jié)合，lac操縱基因解放，外源基因大量轉(zhuǎn)錄。宿主生長(zhǎng)受抑制,tac啟動(dòng)子是藥物誘導(dǎo)型,2）表達(dá)載體誘導(dǎo)復(fù)制,將宿主的生長(zhǎng)與載體的復(fù)制分開(kāi),當(dāng)宿主大量生長(zhǎng)后，再誘導(dǎo)載體制粒的復(fù)制，增加拷貝數(shù),當(dāng)需要宿主大量生長(zhǎng)時(shí)，抑制載體質(zhì)粒的復(fù)制,N末端：由原核基因編碼一段多肽， C末端：是完整的真核外源基因,1）設(shè)計(jì)成融合蛋白,這是避免被降解的最好措施,質(zhì)?；虍a(chǎn)物,目的基因產(chǎn)物,N,C,切割,6. 提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性,防

30、止被宿主的酶降解,Z系列載體,ZUV5載體,lac Z,G,AATTC,CTTAA,G,外源基因,Z2載體,lac Z,GGG,AATTC,CCCTTAA,G,外源基因,Z3載體,lac Z,GG,AATTC,CCTTAA,G,外源基因,提供三種融合插入閱讀框,使用次黃嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，減少宿主菌的蛋白酶合成。 大腸桿菌的htp R基因突變也減少蛋白酶的降解作用。 T4噬菌體的pin基因產(chǎn)物能抑制細(xì)菌的蛋白酶。可把pin增加到載體上,2） 使用突變菌株，保護(hù)外源蛋白不被降解,減少宿主菌本身的蛋白酶的表達(dá),3）表達(dá)分泌蛋白,細(xì)胞質(zhì),外膜,內(nèi)膜,周間質(zhì),質(zhì)粒,染色體,外排”： 蛋白質(zhì)從

31、細(xì)胞質(zhì)跨過(guò)內(nèi)外膜到培養(yǎng)液中。 “分泌”： 蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過(guò)內(nèi)膜到周間質(zhì)中,細(xì)菌蛋白分泌的條件,位于N端，一般為15-30aa 。真核與原核的結(jié)構(gòu)相似, 功能相似，可以互換,堿性氨基酸,N,疏水氨基酸核心區(qū),切割位點(diǎn),Arg、Lys,Leu、Ile,AlaGlySer,信號(hào)肽酶,外源蛋白,有信號(hào)肽,細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,真核細(xì)胞中的分泌蛋白能在大腸桿菌中很好地分泌表達(dá)； 但非分泌蛋白很難在大腸桿菌中分泌,信號(hào)肽酶I、信號(hào)肽酶II等近20多種蛋白質(zhì)的參與,蛋白質(zhì)內(nèi)有與分泌相關(guān)的aa 序列,為蛋白指明目的地,23,一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn),二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng),三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控,四、

32、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位,六、影響外源基因表達(dá)效率的因素,五、幾種類(lèi)型的原核表達(dá)載體,七、提高表達(dá)水平常用的方法,九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾,十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷,八、原核表達(dá)系統(tǒng),原核基因表達(dá),九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾,分子內(nèi)二硫鍵、分子間二硫鍵。二硫鍵異構(gòu)酶催化。使蛋白質(zhì)能夠正確折疊,1. 形成正確的二硫鍵,人胰島素分子,抗體分子,人血紅蛋白分子,如信號(hào)肽、內(nèi)含肽（intein）等序列的切割,2. 前體切割,1）O-糖基化（Ser, Thr,增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和某些特殊性質(zhì),3. 蛋白質(zhì)糖基化,糖基,2）N-糖基化（Asn,Dol：長(zhǎng)醇,Mannose：甘露糖,Gluco

33、se：葡萄糖,N-AcGlc：N乙酰氨基葡萄糖,一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn),二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng),三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控,四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位,六、影響外源基因表達(dá)效率的因素,五、幾種類(lèi)型的原核表達(dá)載體,七、提高表達(dá)水平常用的方法,九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾,十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷,八、細(xì)菌表達(dá)載體舉例,原核基因表達(dá),1、缺乏翻譯后蛋白質(zhì)的加工修飾系統(tǒng)。 （如糖基化、氨基酸修飾等,十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷,2、原核表達(dá)外源蛋白常以包涵體形式存在，必須經(jīng)過(guò)變形、復(fù)性處理才能獲得有生物活性的蛋白，并且其表達(dá)量非常低,3、原核細(xì)胞中表達(dá)的真核蛋白不穩(wěn)定，容易被細(xì)菌蛋白酶降解

34、。 4、原核細(xì)胞沒(méi)有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，無(wú)法識(shí)別內(nèi)含子，故原核細(xì)胞無(wú)法表達(dá)沒(méi)有加工過(guò)的真核基因組。 5、重組原核細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的毒素難以排除，污染表達(dá)產(chǎn)物，影響產(chǎn)品純度,一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn),二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng),三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控,四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位,六、影響外源基因表達(dá)效率的因素,五、幾種類(lèi)型的原核表達(dá)載體,七、提高表達(dá)水平常用的方法,九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾,十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷,八、原核表達(dá)系統(tǒng),原核基因表達(dá),原核生物作為基因表達(dá)系統(tǒng)的受體細(xì)胞所具有的特點(diǎn),原核生物大多數(shù)為單細(xì)胞異養(yǎng)，生長(zhǎng)快，代謝易于控制，可通過(guò)發(fā)酵迅速獲得大量基因表達(dá)產(chǎn)物

35、。 基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，便于基因操作和分析。 多數(shù)原核生物細(xì)胞內(nèi)含有質(zhì)粒或噬菌體，便于構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體。 生理代謝途徑及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制比較清楚。 不具備真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物無(wú)特定的空間構(gòu)相。 內(nèi)源蛋白酶會(huì)降解表達(dá)的外源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定,6.3.1 大腸桿菌基因表達(dá)系統(tǒng),大腸桿菌是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，其遺傳背景清楚，目標(biāo)基因表達(dá)的水平高，培養(yǎng)周期短。目前大多數(shù)外源基因都是以大腸桿菌為受體系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)的，是目前應(yīng)用最廣泛的基因表達(dá)系統(tǒng),與其它表達(dá)系統(tǒng)相比，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)所具有的優(yōu)越性,經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期研究，人們已經(jīng)掌握了十分豐富的有關(guān)大腸桿菌基礎(chǔ)生物學(xué)、遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)等方面

36、的背景知識(shí)，特別是對(duì)其基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理有了深刻的了解； 大腸桿菌已被發(fā)展成為一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，擁有各類(lèi)適用的寄主菌株和不同類(lèi)型的載體系列； 實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，許多克隆的真核基因，例如抑制生長(zhǎng)素基因和胰島素基因等，都可以在大腸桿菌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效的、高水平的表達(dá)； 大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡(jiǎn)單、成本低廉，易于進(jìn)行工業(yè)化批量生產(chǎn),常見(jiàn)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),Lac和Tac表達(dá)系統(tǒng)：是以lac操縱子調(diào)控機(jī)制為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)和構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng),PL和PR表達(dá)系統(tǒng)：是以噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子PL和PR構(gòu)建的,T7表達(dá)系統(tǒng)：是利用大腸桿菌T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)元件構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)，它具有很高的表達(dá)能力,2 芽孢桿菌表

37、達(dá)系統(tǒng),芽孢桿菌屬革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)胞壁不含內(nèi)毒素，能將表達(dá)蛋白分泌到細(xì)胞外。 目前常用作基因表達(dá)系統(tǒng)的有枯草桿菌和短小芽孢桿菌等,利用芽孢桿菌作為表達(dá)外源基因的受體菌的優(yōu)點(diǎn),許多芽孢桿菌是非致病性微生物，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)迅速； 表達(dá)產(chǎn)物能分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，且多數(shù)表達(dá)產(chǎn)物具有天然構(gòu)相和生物學(xué)活性； 某些芽孢桿菌的遺傳背景比較清楚，便于進(jìn)行遺傳操作； 利用芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵的技術(shù)相當(dāng)成熟,6.3.2.1 芽孢桿菌表達(dá)載體,復(fù)制子,金色葡萄球菌的復(fù)制子：如pUB110、pC194和pE194等,短小芽孢桿菌的復(fù)制子：如pHY481和pWT481等,含金色葡萄球菌復(fù)制子的質(zhì)粒表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中

38、拷貝數(shù)高，但不穩(wěn)定，原因是質(zhì)粒載體與宿主染色體DNA之間發(fā)生遺傳重組,短小芽孢桿菌型復(fù)制子的質(zhì)粒表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)較低，但能穩(wěn)定存在于宿主細(xì)胞中，甚至在沒(méi)有抗生素選擇壓力下也不易造成質(zhì)粒的丟失,啟動(dòng)子,芽孢桿菌含多種轉(zhuǎn)錄起始識(shí)別因子（）。 芽孢桿菌啟動(dòng)子的表達(dá)具有明顯的時(shí)序性，它與菌體的生長(zhǎng)周期和生理代謝活動(dòng)密切相關(guān),表達(dá)載體,自主復(fù)制質(zhì)粒：是一類(lèi)穿梭質(zhì)粒，能在大腸桿菌中復(fù)制，同時(shí)含有能在芽孢桿菌中復(fù)制的起始序列，因而也能在芽孢桿菌中進(jìn)行自主復(fù)制,整合質(zhì)粒：在大腸桿菌質(zhì)粒基礎(chǔ)上構(gòu)建而成，不含在芽孢桿菌進(jìn)行復(fù)制的起始序列，因而不能在芽孢桿菌中自主復(fù)制，但它能插入到宿主染色體并將外源基因

39、和標(biāo)記基因整合到染色體上，隨細(xì)胞染色體復(fù)制而復(fù)制，該方式表達(dá)外源基因解決了芽孢桿菌中質(zhì)粒不能穩(wěn)定遺傳的問(wèn)題,噬菌體：以芽孢桿菌溫和型噬菌體構(gòu)建的表達(dá)載體能將外源基因定位整合到染色體上，并且在合適條件下（溫度）誘導(dǎo)外源基因表達(dá),6.3.2.2 宿主菌,常用的宿主菌,枯草芽孢桿菌,短小芽孢桿菌,地衣芽孢桿菌,6.3.2.3 外源基因在芽孢桿菌中的分泌表達(dá),芽孢桿菌的細(xì)胞膜不同與大腸桿菌，通常只有一層細(xì)胞膜，當(dāng)分泌型蛋白質(zhì)跨膜后就進(jìn)入到培養(yǎng)基中，因此，外源蛋白的表達(dá)量可以達(dá)到很高的水平，其表達(dá)量可達(dá)30g/L,6.3.2.4 在芽孢桿菌中高效表達(dá)外源基因的策略,提高表達(dá)質(zhì)粒在細(xì)胞中的穩(wěn)定性,滅活芽孢桿菌胞外蛋白酶,6.3.3 鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng),鏈霉菌是一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，廣泛分布于土壤中，能夠產(chǎn)生多種生理活性物質(zhì),鏈霉菌作為外源基因表達(dá)的受體細(xì)胞所具有的特點(diǎn),為非致病性細(xì)菌，不產(chǎn)生內(nèi)毒素； 可進(jìn)行外源蛋白的分泌表達(dá)； 可進(jìn)行高密度培養(yǎng)，具有豐富的次級(jí)代謝途徑和初、次級(jí)代謝調(diào)控體系，表達(dá)外