發(fā)酵實(shí)驗(yàn)報(bào)告(細(xì)菌液體發(fā)酵生產(chǎn)淀粉酶

1、本科學(xué)生實(shí)驗(yàn)報(bào)告僅供參考后果自負(fù)學(xué)號(hào) 姓 名 孫 永 升 學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 專業(yè)、班級(jí) 10生物技術(shù) 實(shí)驗(yàn)課程名稱 發(fā) 酵 工 程 學(xué) 教師及職稱 唐 湘 華 開(kāi)課學(xué)期 2012 至 2013 學(xué)年 第二學(xué)期 填報(bào)時(shí)間 2013 年 5 月 15 日 云南師范大學(xué)教務(wù)處編印實(shí)驗(yàn)名稱實(shí)驗(yàn)方式小組成員實(shí)驗(yàn) 六 細(xì)菌液體發(fā)酵生產(chǎn)淀粉酶小組合作XXXXXXXX一、 實(shí)驗(yàn)原理及內(nèi)容1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.1 了解產(chǎn)淀粉酶的微生物；1.2 了解液體發(fā)酵操作過(guò)程；1.3 了解發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)構(gòu)成；2、 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨2 ,酵母膏1,木薯淀粉2,氯化鈉0.2%。pH 6.0 ，121，滅菌30

2、min。 2.2 菌種：T4細(xì)菌 2.3 器材：三角瓶、燒杯、天平、滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱，發(fā)酵罐，搖床等。3、實(shí)驗(yàn)原理及實(shí)驗(yàn)流程或裝置示意圖：3.1實(shí)驗(yàn)原理：將產(chǎn)淀粉酶的枯草芽孢桿菌T4細(xì)菌接種于富含淀粉的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶。微生物生產(chǎn)的a-淀粉酶可以說(shuō)是一種半合成酶大多數(shù)工業(yè)生產(chǎn)的淀粉酶菌種，如；枯草桿菌、米曲霉、淀粉液化芽孢桿菌等，即使培養(yǎng)基種不含淀粉或者不含有具有a-1、4鍵的多糖或低聚糖，仍然可以生產(chǎn)a-淀粉酶，但是它們的產(chǎn)量可受到淀粉或其它a-1，4麥芽寡糖的誘導(dǎo)而增加。氮源：是合成a-淀粉酶的原料有機(jī)氮：各種氨基酸與酪蛋白的酶水解物有利于a-淀粉酶的生成。實(shí)際生產(chǎn)中，

3、酪蛋白、豆餅的熱、堿水抽出物是工業(yè)上最優(yōu)良的氮源。無(wú)機(jī)氮：硝酸鈉、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、醋酸銨及尿素等無(wú)機(jī)氮均可在不同程度上增加a-淀粉酶的產(chǎn)量，但大多喜用硝酸鈉。整個(gè)實(shí)驗(yàn)按照“菌種的培養(yǎng)、空消、實(shí)消、接種、發(fā)酵、放罐”的發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行。在整個(gè)發(fā)酵的過(guò)程中，每隔6h取一次發(fā)酵液樣品檢測(cè)其pH值、酶活、殘?zhí)橇考吧锪克膫€(gè)生理指標(biāo)。最后將所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、分析，可以得出整個(gè)發(fā)酵過(guò)程各物質(zhì)的生成和消耗的變化規(guī)律以及如何調(diào)整培養(yǎng)條件來(lái)提高發(fā)酵生產(chǎn)的效率，對(duì)大工業(yè)生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。 3.2 裝置示意圖: 圖一 200L發(fā)酵罐與種子罐。發(fā)酵罐 圖一3.3 操作流程工藝圖：整個(gè)實(shí)驗(yàn)按照“菌種的培養(yǎng)、空

4、消、實(shí)消、接種、發(fā)酵、放罐”的發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行。在整個(gè)發(fā)酵的過(guò)程中，每隔6h取一次發(fā)酵液樣品檢測(cè)其pH值、酶活、殘?zhí)橇考吧锪克膫€(gè)生理指標(biāo)。最后將所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、分析，可以得出整個(gè)發(fā)酵過(guò)程各物質(zhì)的生成和消耗的變化規(guī)律以及如何調(diào)整培養(yǎng)條件來(lái)提高發(fā)酵生產(chǎn)的效率，對(duì)大工業(yè)生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。4. 操作步驟、注意事項(xiàng)：4.1 操作步驟1、裝料，開(kāi)動(dòng)攪拌，定容后，加入食用油10毫升用于消泡；2、排空夾套水，通入蒸汽對(duì)物料加熱，三路進(jìn)汽；物料溫度升到80 ，停止攪拌。3、排空冷空氣，升壓到0.1MPa,保壓30min；4、夾套降溫，物料溫度降到80，啟動(dòng)攪拌，注意罐壓，當(dāng)罐壓降到0.05MPa時(shí)，通入空

5、氣，保持罐壓在0.07Mpa；5、溫度降低到37 就可以接種，接種方式采用火焰燒；6、根據(jù)通風(fēng)比和控制參數(shù)要求進(jìn)行罐壓、攪拌的調(diào)整。4.2 方法與注意事項(xiàng)（一）原則1通蒸汽前先關(guān)閉所有閥門2粗過(guò)濾器不空消也不實(shí)消，要定期處理，所以必須關(guān)閉通向粗過(guò)濾器的閥門。3活蒸汽，滅過(guò)頭，即尾汽不能關(guān)死，要保證有活蒸汽放出，但不能太大，以免分壓。4罐體排汽口排汽，并保持罐內(nèi)正壓。5空氣過(guò)濾系統(tǒng)只空消，不實(shí)消，以免罐中物料沖入過(guò)濾器內(nèi)。但空消一結(jié)束，即要通入無(wú)菌空氣吹干管路并保壓，避免染菌。6進(jìn)蒸汽時(shí)順著蒸汽管路開(kāi)閥門，結(jié)束時(shí)逆著進(jìn)路關(guān)閥門，先開(kāi)尾閥后開(kāi)主閥，結(jié)束時(shí)先關(guān)主閥后關(guān)尾閥。7蒸汽一停，即由無(wú)菌空氣充

6、入保持罐內(nèi)正壓。8蒸汽對(duì)設(shè)備與物料滅菌中注意安全，控制時(shí)間、壓力限制。9操作中注意發(fā)酵參數(shù)監(jiān)測(cè)與控制。（二） 空消：先開(kāi)啟蒸汽發(fā)生器，自有蒸汽產(chǎn)生并排掉管路中冷凝水后，按以下步驟進(jìn)行：1先關(guān)閉所有閥門，檢查處是否關(guān)緊密封，打開(kāi)罐上方排氣口。2蒸汽先進(jìn)空氣系統(tǒng)，蒸汽蒸汽過(guò)濾器分過(guò)濾器，無(wú)論蒸汽走到哪一路得先放尾閥，放出冷凝水，排掉冷空氣，待有蒸汽沖出后調(diào)小，打開(kāi)主閥。3再進(jìn)罐體：由主路進(jìn)罐，然后通入取料管路，再入補(bǔ)料系統(tǒng)（兩邊）。4罐壓升至所需溫度（121）時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，保溫保壓30min。保壓方式：（1）調(diào)節(jié)主汽路進(jìn)汽閥門控制進(jìn)汽量；（2）調(diào)節(jié)排氣口排氣量大小或尾閥放汽量。5結(jié)束空消：（1）逆著

7、蒸汽進(jìn)路關(guān)，先關(guān)近罐閥。（2）同時(shí)準(zhǔn)備好壓縮空氣確保蒸汽一停即充入無(wú)菌壓縮空氣以維持空氣系統(tǒng)及罐內(nèi)的正壓。近罐空氣閥的尾閥要一直微開(kāi)啟。注意：空消前應(yīng)檢查夾套中是否殘留了冷水，若有，影響罐體升溫，須自?shī)A套出水口將水放出。（三）種子制備：液體搖瓶培養(yǎng)。（四）培養(yǎng)基配制、實(shí)消：關(guān)閉氣路入罐閥，主汽路進(jìn)汽補(bǔ)料口進(jìn)汽（方法同空消）罐壓升至0.12Mpa（121），保壓、保溫30分鐘實(shí)消結(jié)束。（五）冷卻接種與發(fā)酵：1、待培養(yǎng)基冷卻至28左右時(shí)，在加料口周圍放一圈酒精棉球，點(diǎn)燃，在無(wú)菌條件下打開(kāi)進(jìn)料口，迅速接種。2、將溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量等參數(shù)設(shè)定好后，進(jìn)行發(fā)酵。（六）參數(shù)監(jiān)測(cè)每隔6 h取一次樣，檢測(cè)其

8、pH、生物量、酶活及殘?zhí)呛康戎笜?biāo)。. pH的測(cè)定：標(biāo)準(zhǔn)液校準(zhǔn)pH計(jì)后，測(cè)定樣品pH值。. 生物量的測(cè)定：每次取20-30mL的發(fā)酵液，先用大離心機(jī)(5000 rpm, 35 min)離心，收集上清液，用小離心機(jī)（10000rpm，1min）用來(lái)測(cè)酶活，沉淀用水清洗幾次后再離心，然后將所得沉淀放入100烘箱中，烘干（2 h左右），然后測(cè)其干重，取平均值。. 酶活：DNS法測(cè)定淀粉酶活（七）后續(xù)工作：罐體清洗，藥品整理歸類，物品放好。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析1.1枯草芽孢桿菌T4發(fā)酵過(guò)程形態(tài)觀察：發(fā)酵液渾濁黃色，惡臭味。對(duì)發(fā)酵液用番紅染色觀察呈桿狀，無(wú)雜菌污染。如圖二 圖二 發(fā)酵液番紅染色結(jié)果1.2淀

9、粉酶活測(cè)定：酶活力單位（U/ml）= K(ODA + ODB )/2 + bN103 /10/0.2/180.2 式中：ODAA管的吸收光度值； 103mg轉(zhuǎn)換為ug；ODBB管的吸收光度值； 180.2葡萄糖的摩爾質(zhì)量；N酶液的稀釋倍數(shù)； 10表示酶反應(yīng)時(shí)間為10min；K：標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率?；貧w直線方程y=kx-0.0747，k=0.7023。酶活力單位（U/ml）= K(ODA + ODB )/2 + bN103 /10/0.2/180.2=0.794U/ml結(jié)果與討論：對(duì)發(fā)酵液跟蹤監(jiān)測(cè)（菌染：形態(tài)觀察）無(wú)污染，基本為枯草芽孢桿菌T4。因?yàn)闇y(cè)定時(shí)未完全真確按六小時(shí)測(cè)定一次，酶活測(cè)定發(fā)現(xiàn)測(cè)定結(jié)果較低。按照發(fā)酵時(shí)間總體上是呈上升趨勢(shì)，測(cè)定過(guò)程中只對(duì)發(fā)酵液：液體、菌體簡(jiǎn)單離心操作，未作發(fā)酵液提純壓縮處理，等于酶液稀釋較低水平，因此結(jié)果低。三、實(shí)驗(yàn)小結(jié)通過(guò)親自體驗(yàn)本次試驗(yàn)，能夠真正了解到微生物發(fā)酵的過(guò)程，將課本上的東西都結(jié)合到實(shí)驗(yàn)來(lái)，并且對(duì)一些不理解的器具也有了充分的認(rèn)識(shí)，包括對(duì)發(fā)酵罐各個(gè)部件的，各個(gè)管路的認(rèn)識(shí)以及他們的作用。在操作過(guò)程中我們要嚴(yán)格自己的操作,實(shí)驗(yàn)測(cè)量的數(shù)據(jù)要保持真實(shí)性。最重要的是掌握一般發(fā)酵罐的常規(guī)操作、流程?？梢愿玫貫閷?shí)習(xí)打下基礎(chǔ)，提高操作技能水平。參考文