牛磺酸對(duì)大鼠視網(wǎng)膜損傷論文

1、?；撬釋?duì)大鼠視網(wǎng)膜損傷論文摘要摘要：目的觀察飼料中添加?；撬釋?duì)光化學(xué)損傷后大鼠光感受器細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步從氧化應(yīng)激基因cfos表達(dá)變化角度探索其防護(hù)機(jī)制。方法70只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、?；撬峤M。分別喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料或添加4牛磺酸飼料喂飼15d后接受(3000200)lx持續(xù)0，1，3，6，9，12,24h光照，凋亡細(xì)胞原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)光感受器細(xì)胞凋亡情況并計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)；RTPCR法及免疫印跡法檢測(cè)視網(wǎng)膜內(nèi)cfosmRNA以及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果感光細(xì)胞凋亡指數(shù)隨光照時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，?；撬峤MAI顯著低于對(duì)照組(P%26lt;005)，其中光照12h?；撬峤M和對(duì)照組A

2、I分別為(12347)和(32462)；視網(wǎng)膜cfosmRNA光照1h后一過性表達(dá)增高，牛磺酸組較對(duì)照組低(P%26lt;005)；光照后視網(wǎng)膜cfos蛋白表達(dá)逐漸升高，于3h達(dá)峰值，牛磺酸組顯著低于對(duì)照組(P%26lt;005)。結(jié)論在視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷條件下，?；撬峥赡芡ㄟ^抑制視網(wǎng)膜cfos的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，阻斷光感受器細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)從而保護(hù)視網(wǎng)膜。 摘要：?；撬?；視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷；凋亡細(xì)胞；cfos Effectsoftaurineoncfosexpressionofratretinaafterphotochemicaldamage Abstract摘要：ObjectiveToobserveth

3、eeffectofdietarysupplementationwithtaurineonphotoreceptorapoptosisandfurtherinvestigatechangesofcfosexpressionofratretinaafterphotochemicaldamage.MethodsSeventyratswererandomlydividedintocontrolgroup(Control)and4%taurinesupplementationgroup(Taurine).Thesubjectswereexposedto(3000200)lxtransmittedbysi

4、xcoldwhitelightsfor0,1,3,6,9,12,24h.TheapoptoticphotoreceptorcellsweredetectedusingTUNELmethod;TotalRNAandproteinofretinawereextracted;relativecfosmRNAlevelsweredeterminedusingRT-PCRandcfosproteinlevelsweredetectedbywestern-blotanalysis.ResultsWiththelightexposuretimeprolonged,apoptosisindex(AI)ofph

5、otoreceptorcellswaselevated,amongwhichtheAIof12hwere(12.34.7)%and(32.46.2)%inTaurineandcontrolgroup(P%26lt;0.05).ThecfosmRNAofratretinawastransientlyinducedafterone-hourlightexposureanditwaslowerintaurinegroup(P%26lt;0.05);cfosproteinlevelincreasedafterthreehourexposureanditwaslowerintaurinegroup(P%

6、26lt;0.05).ConclusionTaurinecanpartlyreducethetranscriptionandtranslationofc-fos,whichwouldfurtherinhibittheapoptosissignaltransductionandprotecttheratretinafromphotochemicaldamage. Keywords摘要：taurine;photochemicaldamage;apoptoticcell;cfos 視網(wǎng)膜是視覺形成的重要組織結(jié)構(gòu)，若光照時(shí)間或光照強(qiáng)度等超過視網(wǎng)膜承受力，則會(huì)導(dǎo)致光化學(xué)損傷1，損傷早期視功能減退，光感受

7、器細(xì)胞丟失，后期內(nèi)層神經(jīng)元變性壞死，最終導(dǎo)致失明12。近年探究認(rèn)為，凋亡是視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷中光感受器細(xì)胞丟失的主要機(jī)制1,3，持續(xù)高強(qiáng)度光照使視網(wǎng)膜內(nèi)自由基和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物激增，同時(shí)氧化應(yīng)激基因AP1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，且證實(shí)其亞單位cfos是必需調(diào)控因子。?；撬岷鸵暰W(wǎng)膜生長(zhǎng)發(fā)育和功能維持關(guān)系密切，前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，4?；撬崮苡行ПＷo(hù)光化學(xué)損傷條件下的大鼠視網(wǎng)膜4。本探究擬進(jìn)一步觀察其對(duì)光感受器細(xì)胞凋亡的影響，并從cfos表達(dá)變化角度探索防護(hù)機(jī)制。 1材料和方法 11實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組清潔級(jí)SD大鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院動(dòng)物中心)70只，體重150g左右，雌雄各半。隨機(jī)分為對(duì)照組、?；撬峤M

8、，分別喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料或添加4?；撬?北京世紀(jì)維他生物技術(shù)有限公司，純品)飼料15d后，各組5只大鼠分別接受(3000200)lx持續(xù)0，1，3，6，9，12，24h光照。 12凋亡細(xì)胞的原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)光感受器細(xì)胞凋亡情況大鼠光照后立即取出眼球，4多聚甲醛固定過夜，常規(guī)石蠟切片，TUNEL試劑盒(德國(guó)Roche公司)檢測(cè)視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞凋亡情況參照試劑說明書，計(jì)數(shù)10個(gè)油鏡視野下每張切片TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，其和光感受器細(xì)胞總數(shù)比值為光感受器細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。 13視網(wǎng)膜總RNA提取及RTPCR大鼠光照后立即取出眼球，解剖顯微鏡下小心剝離視網(wǎng)膜，參考Trizol試劑說明書常

9、規(guī)提取總RNA，核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定其含量和純度。-20保存?zhèn)溆谩TPCR按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，以大鼠actin為內(nèi)參，上游引物序列為5GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3，下游引物序列為5GCCAGGATAGAGCCACCAAT-3，退火溫度為554，產(chǎn)物長(zhǎng)度為684bp；cfos上游引物序列為5GCCTTTCCTACTACCATTCC-3，下游引物序列為5ATCTTATTCCTTTCCCTTCG-3，退火溫度為533，產(chǎn)物長(zhǎng)度為370bp。擴(kuò)增條件為945min40s，各退火溫度45s，循環(huán)32次，7210min。2瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)掃描以及分

10、析。PCR特異條帶以相對(duì)吸光度面積(mm2)表示，以各組的校正吸光度和其actin校正吸光度的比值表示(V)。 14免疫印跡法測(cè)定視網(wǎng)膜cfos蛋白表達(dá)情況大鼠光照后立即取出眼球，剝離視網(wǎng)膜，常規(guī)方法提取總蛋白，Lowry法定量。總蛋白(40g)經(jīng)十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)(5積層膠、12分離膠)后，采用BioRad半干轉(zhuǎn)印儀將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，利用cfos多克隆抗體(1摘要：150稀釋，北京中杉生物制劑公司)檢測(cè)膜上蛋白。BioRad凝膠成像分析系統(tǒng)分析相對(duì)表達(dá)量，以0h組蛋白表達(dá)量為內(nèi)參，其他各個(gè)時(shí)相點(diǎn)灰度值和內(nèi)參比值為相對(duì)灰度值(A)。

11、 15統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS100統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。 2結(jié)果 21?；撬釋?duì)光照后大鼠視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞凋亡的影響對(duì)照組光照6h后，發(fā)現(xiàn)棕褐色TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞散在分布于外核層(ONL)內(nèi)部，即受損的多為視桿細(xì)胞，而?；撬峤M光照9h后才開始出現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，隨光照時(shí)間延長(zhǎng)，陽(yáng)性感光細(xì)胞增多，光照24h后視網(wǎng)膜內(nèi)核層、節(jié)細(xì)胞層也出現(xiàn)大量陽(yáng)性細(xì)胞(圖1)。光化學(xué)損傷后AI隨光照時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高，牛磺酸組光照12hAI值(12347)顯著低于對(duì)照組(32462)，其他時(shí)相點(diǎn)也顯著低于對(duì)照組(P%26lt;005)。 A摘要：對(duì)照組，光照0h；B摘要：對(duì)照組，光照9h；C摘要：?；撬峤M，光照9h 圖1牛磺

12、酸對(duì)光化學(xué)損傷后大鼠視網(wǎng)膜光感受器凋亡的影響(TUNEL，400)（略） 22?；撬釋?duì)光照后大鼠視網(wǎng)膜cfos轉(zhuǎn)錄以及表達(dá)的影響 221牛磺酸對(duì)光照后大鼠視網(wǎng)膜cfosmRNA表達(dá)的影響光照后對(duì)照組和?；撬峤M大鼠視網(wǎng)膜cfosmRNA表達(dá)均出現(xiàn)一過性增高，且在光照1h達(dá)到峰值，隨著光照時(shí)間延長(zhǎng)其表達(dá)逐漸降低，于6h光照后其表達(dá)量接近未光照水平(圖2)。利用灰度掃描計(jì)算V值發(fā)現(xiàn)，光照1h時(shí)?；撬峤M大鼠視網(wǎng)膜cfosmRNA較對(duì)照組表達(dá)低(P%26lt;005)。 222?；撬釋?duì)光照后大鼠視網(wǎng)膜cfos蛋白表達(dá)的影響光照后2組動(dòng)物視網(wǎng)膜cfos蛋白表達(dá)逐漸增高，于光照3h達(dá)到峰值，隨光照時(shí)間延長(zhǎng)其

13、表達(dá)量逐漸降低，光照12h其表達(dá)量接近未光照時(shí)水平(圖3)。A分析提示牛磺酸組3h蛋白表達(dá)相對(duì)量比對(duì)照組低(P%26lt;005)。 D摘要：對(duì)照組；T摘要：?；撬峤M 圖2不同光照時(shí)間對(duì)大鼠視網(wǎng)膜cfosmRNA表達(dá)的影響（略） D摘要：對(duì)照組；T摘要：?；撬峤M 圖3不同光照時(shí)間對(duì)大鼠視網(wǎng)膜中cfos蛋白表達(dá)的影響（略） 3討論 視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷后光感受器細(xì)胞丟失的機(jī)制尚存在一定的爭(zhēng)議，但大部分探究者認(rèn)為，凋亡是光化學(xué)損傷以及其他視網(wǎng)膜變性疾病光感受器細(xì)胞丟失的主要機(jī)制3，5。本探究在前階段證實(shí)，4%?；撬崮苡行ПＷo(hù)持續(xù)高強(qiáng)度光照(300020)lx，24h條件下大鼠視網(wǎng)膜基礎(chǔ)上，結(jié)合凋亡細(xì)胞

14、生化特征，采用TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，?；撬釡p少了光照不同時(shí)相點(diǎn)凋亡指數(shù)，和其他探究報(bào)道6，7?；撬峋哂锌股窠?jīng)元凋亡功能相符。近年探究發(fā)現(xiàn)，AP1是調(diào)控光感受器細(xì)胞凋亡的重要影響因子，其亞基cfos是必需的調(diào)控因子3，8。AP1參和了許多生理過程如細(xì)胞增殖、分化、死亡及惡性轉(zhuǎn)化等，脂多糖、氧化應(yīng)激、紫外線等均能增加其活性，并通過調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮功能7，其中，cjuncfos二聚體形式的AP1復(fù)合物生物活性最強(qiáng)6。光損傷條件下cfos(-)大鼠光感受器細(xì)胞幾乎未丟失，以及大鼠、小鼠和661W光感受器細(xì)胞短期光照后cfosmRNA表達(dá)一過性增高，均說明cfos在光誘導(dǎo)光感受器細(xì)胞

15、凋亡中促進(jìn)凋亡功能3，8。本探究發(fā)現(xiàn),?；撬峤McfosmRNA以及蛋白表達(dá)峰值均比對(duì)照組低，推測(cè)牛磺酸可能通過抑制cfos表達(dá)，導(dǎo)致整個(gè)AP1復(fù)合物減少，阻斷凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而有效保護(hù)光感受器細(xì)胞。文獻(xiàn)報(bào)道，TauCl能降低FLS細(xì)胞AP1活性，而?；撬岵荒?。因此，?；撬峥赡芡ㄟ^捕捉次氯酸(HOCI)形成TauC1，TauCl才是牛磺酸的活性形式，上述推論還需進(jìn)一步證實(shí)。 參考文獻(xiàn) 1劉輝，金玉蘭.?；撬崽骄康倪M(jìn)展J.國(guó)外醫(yī)學(xué)婦幼保健分冊(cè)，2002，13(1)摘要：40-41. 2張劍利，蘇小枚，畢力夫，等.牛磺酸對(duì)小鼠視網(wǎng)膜光損傷保護(hù)功能的實(shí)驗(yàn)探究J.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，34(2)

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