NGS測序技術(shù)與分析流程圖

1、第一代測序技術(shù),sanger測序,1977桑格測定了第一個基因組序列，是噬菌體x174的，全長5375個堿基,sanger法核心原理是：由于ddntp的2和3都不含羥基，其在dna的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷dna合成反應(yīng)，在4個dna合成反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標(biāo)記的ddntp（分為：ddatp,ddctp,ddgtp和ddttp），通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測分子的dna序列,新一代測序介紹,三大測序平臺的前世今生,lynx mpss,solexa,abi solid,454,ion torrent,helicos,smrt,

2、illumina solexa,roche 454,polony seq,abi ion torrent,pacific biosciences,roche-454,454公司可謂新一代測序技術(shù)的奠基人。2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統(tǒng)genome sequencer 20 system，被nature雜志以里程碑事件報道，開創(chuàng)了邊合成邊測序（sequencing-by-synthesis）的先河。之后，454公司被羅氏診斷公司以1.55億美元收購。 454測序原理,測序?qū)嶒?yàn)流程,1、文庫制備：根據(jù)樣品的種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，將基因組dna/cdna片段

3、化處理至400-800bp間，經(jīng)末端修復(fù)與特異性接頭連接等修飾后變性處理回收單鏈的dna（sstdna）；然后和兩個44個堿基長的銜接子（adaptor）a、b進(jìn)行平端連接。a、b 銜接子各自含有20個堿基的pcr 引物序列、20個堿基的測序引物序列和4個堿基的對照序列（tacg），除此之外，b銜接子的5端還標(biāo)記有一個生物素基團(tuán)，供后續(xù)的分離合適的測序模板使用,測序?qū)嶒?yàn)流程,2、emulsion pcr：特定比例的單鏈dna文庫被固定在特別設(shè)計(jì)的dna捕獲磁珠上，使大部分磁珠磁珠攜帶了一個獨(dú)特的單鏈dna片斷。磁珠結(jié)合的文庫被擴(kuò)增試劑乳化，形成油包水的混合物，每個獨(dú)特的片斷在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)

4、行獨(dú)立的擴(kuò)增，而不受其他的競爭性或者污染性序列的影響。整個片段文庫的擴(kuò)增平行進(jìn)行。擴(kuò)增后產(chǎn)生了幾百萬個相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴(kuò)增后仍結(jié)合在磁珠上的片段既可被回收純化用于后續(xù)的測序?qū)嶒?yàn),測序?qū)嶒?yàn)流程,3、測序反應(yīng)：攜帶dna的珠子與其他反應(yīng)物混合物，隨后放入ptp板中進(jìn)行后繼的測序。 ptp孔的直徑（29um）只能容納一個珠子（20um）。然后將ptp板放置在gs flx中，測序開始。每一個與模板鏈互補(bǔ)的核苷酸的添加都會產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的信號，并被ccd照相機(jī)所捕獲,測序?qū)嶒?yàn)流程,4、數(shù)據(jù)分析：gs flx系統(tǒng)在10小時的運(yùn)行當(dāng)中可獲得100多萬個讀長，讀取超過4-6億個堿基信息，通過

5、gs flx系統(tǒng)提供兩種不同的生物信息學(xué)工具對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,454 pyrosequencing,454 的特點(diǎn)與主要應(yīng)用,讀長較長，400600bp 通量較低，1run 1m 序列，400600mb 相對成本較高 主要應(yīng)用：de novo測序,illumina solexa,solexa 測序原理,illumina solexa,illumina solexa 橋式pcr,diol,diol,1st cycle denaturation,illumina solexa base calling,solexa 的特點(diǎn)與主要應(yīng)用,讀長較短，100150bp 通量高，25g每天，120-150

6、g每run 主要應(yīng)用：rna測序、表觀遺傳學(xué)研究,abisolid,solidsequencing by oligo ligation/detection oligo連接測序：通過連接酶連接，再對oligo上熒光基團(tuán)進(jìn)行檢測,solid 5500 xl,abi solid測序前期制備,a 樣品片段化 磁珠連接,b 乳化pcr 3末端修飾,c 磁珠富集 轉(zhuǎn)到測序玻片,abi solid測序原理,abi solid熒光結(jié)合和結(jié)果示例,srr029969.1 vab_5551_12_381_f3 length=35 t11.0203.3.1113211010332111302330201 +srr0

7、29969.1 vab_5551_12_381_f3 length=35 !36!8/8:!:!4626=(8.)43),(95,a. solid oligo熒光基團(tuán)模式圖,b. solid 測序結(jié)果示例（color space,solid 的特點(diǎn)與主要應(yīng)用,讀長較短，50-75bp 精度高，可達(dá)q40 通量高， 20-30g每天，1run 可達(dá)120g 主要應(yīng)用：基因組重測序、snp檢測等,ion torrent,ion torrent 測序原理,精度,examples: 90%condence(10%errorrate)=q10 99%condence(1%errorrate)=q20 9

8、9.9%condence(.1%errorrate)=q30,三種平臺的技術(shù)差異,三種平臺的效能參數(shù)差異,轉(zhuǎn)錄組測序測序流程,轉(zhuǎn)錄組主要分析內(nèi)容,小rna測序,果蠅三種組織中mirna表達(dá)情況,mirna表達(dá)模式分析,新mirna預(yù)測,mirna編輯情況分析與統(tǒng)計(jì),分析軟件介紹,質(zhì)量控制軟件 (quality control) 定位軟件 (mapping the reads) 已知基因（差異）表達(dá)評估軟件 (differential expression) 新基因鑒定軟件 (new gene identification) 可視化展示軟件 (virsulization) 基因功能注釋軟件 (go term or kegg pathway analysis,數(shù)據(jù)格式示例,fastq 格式,color space 格式,phred score,質(zhì)量控制,利用galaxy進(jìn)行原始數(shù)據(jù)處理,,galaxy history vgn fastq,https:/main.g2.bx