新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā)課件

1、新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),1,抗腫瘤藥物新藥研究,藥理學(xué)教研室,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),2,講課內(nèi)容,抗腫瘤藥物治療與發(fā)展 抗腫瘤藥物研究方法 體內(nèi)法 體外法 抗腫瘤藥物機(jī)制研究 新靶點(diǎn)抗腫瘤藥研究 抗腫瘤新藥研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),3,抗腫瘤藥物治療與發(fā)展,惡性腫瘤，仍為第一位致死疾病，WHO發(fā)表了全球癌癥報(bào)告2014，2012年全球有1400萬(wàn)新癌癥病例，死亡人數(shù)達(dá)820萬(wàn)。中國(guó)每年新增病例為350萬(wàn)，死亡人數(shù)為250萬(wàn) 中國(guó)新增癌癥病例高居第一位?；疾∪藬?shù)為約200/10萬(wàn)（但低于發(fā)達(dá)國(guó)家,每6小時(shí)有一名病人診斷為癌癥患者,2月4日是“世界癌癥日,新藥理 抗腫瘤

2、藥研究與開發(fā),4,抗腫瘤藥物治療與發(fā)展,腫瘤是機(jī)體在各種致瘤因素的作用下，局部組織的細(xì)胞在基因水平上失去對(duì)其生長(zhǎng)的正常調(diào)控，導(dǎo)致克隆性異常增生或凋亡不足而形成的新生物，這種新生物往往形成局部腫塊,致瘤因素 基因突變 細(xì)胞突變 腫瘤,良性腫瘤增殖慢、不轉(zhuǎn)移、易根治、死亡率低 惡性腫瘤增殖快、易轉(zhuǎn)移、難根治、死亡率高,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),5,惡性腫瘤根據(jù)其組織來(lái)源不同可分為三類： 癌：由上皮組織引起的惡性腫瘤統(tǒng)稱為癌。 肉瘤: 由中胚組織引起的惡性腫瘤統(tǒng)稱為肉癌。 母細(xì)胞瘤：其他的惡性腫癌則稱為母細(xì)胞瘤,治療方法：術(shù)療、放療、化療（抗腫瘤藥治療,化療是利用化學(xué)藥物殺死腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞

3、的生長(zhǎng)繁殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分化的一種治療方式，它是一種全身性治療手段，原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶和亞臨床轉(zhuǎn)移灶均有治療作用,抗腫瘤藥物治療與發(fā)展,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),6,近代腫瘤化療學(xué)始于20世紀(jì)40年代。 偶然發(fā)現(xiàn) （氮 芥 類） 尋找抗癌藥的途徑 隨機(jī)篩選 （亞硝基脲類） 推理設(shè)計(jì) （抗代謝藥物,抗腫瘤藥物治療與發(fā)展,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),7,50年代通過(guò)動(dòng)物篩選化療藥物發(fā)現(xiàn)了5-FU、MTX、CTX等，化療學(xué)有了發(fā)展。 60年代認(rèn)識(shí)到腫瘤細(xì)胞動(dòng)力學(xué)及化療藥藥代動(dòng)力學(xué)的重要性。大部分目前所用的抗癌藥已發(fā)現(xiàn)。急淋、睪丸癌等可化療治愈。 70年代形成腫瘤內(nèi)科學(xué)，更多腫瘤有了比較成熟的化療方案

4、,抗腫瘤藥物治療與發(fā)展,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),8,抗腫瘤藥物治療與發(fā)展,80年代研究以生物反應(yīng)修飾劑等藥物來(lái)提高化療療效，探索抗藥性產(chǎn)生的原因，5%腫瘤患者可治愈。 90年代新抗癌藥進(jìn)入臨床，多藥耐藥基因發(fā)現(xiàn)，生物治療，基因治療，輔助治療改善等，療效進(jìn)一步提高。 目前發(fā)展靶向治療，腫瘤免疫治療，提高特異性療效，減少副作用,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),9,氮芥類 乙撐亞胺類 生物烷化劑 亞硝基脲類 （按化學(xué)） 甲磺酸酯及多元醇類 金屬鉑類配合物 嘧啶拮抗劑 分 類1 抗代謝藥物 嘌呤拮抗劑 （混和） （按作用機(jī)理） 葉酸拮抗劑 抗腫瘤抗生素 其它類 植物藥有效成份 （按來(lái)源,抗腫瘤藥物治療

5、與發(fā)展藥物分類,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),10,直接作用DNA的藥物,干擾DNA合成的藥物,抗有絲分裂的藥物： 高等植物提取的天然產(chǎn)物 （有絲分裂抑制劑） 及其衍生物,烷化劑 金屬鉑類 抗生素類 作用DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的藥物,抗代謝藥物,分 類2 （作用原理,抗腫瘤藥物治療與發(fā)展藥物分類,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),11,抗腫瘤藥物治療與發(fā)展新分類,1、細(xì)胞毒類抗腫瘤藥 2、以細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物 3、腫瘤新生血管生成抑制藥物 4、腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑 5、細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑 6、基因調(diào)節(jié)藥物 7、單克隆抗體藥物,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),12,抗腫瘤藥物治療與發(fā)展抗腫瘤新藥,1、細(xì)胞毒

6、類抗腫瘤藥 1）拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑: 喜樹堿類化合物 2）胸苷酸合成酶抑制劑: 培美曲塞 3）鉑類抗腫瘤藥物: 順鉑和奧沙利鉑,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),13,抗腫瘤藥物治療與發(fā)展抗腫瘤新藥,2、以細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物 1）蛋白酪氨激酶（PTK）抑制劑:依馬替尼 2）表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑: 吉非替尼 3）法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑: 替匹法尼,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),14,抗腫瘤藥物治療與發(fā)展抗腫瘤新藥,3. 腫瘤新生血管生成抑制藥物 原理：原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移是依賴于新生血管生成的，開發(fā)和研究能夠破壞或抑制血管生成、有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的藥物（稱為TA

7、抑制劑），是新型抗腫瘤藥物研究的活躍領(lǐng)域之一。 代表藥物:angiostatin和endostatin Avastin,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),15,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),16,抗腫瘤藥物治療與發(fā)展抗腫瘤新藥,4. 腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑 代表藥物： 鈣拮抗藥（維拉帕米及其衍生物） 鈣調(diào)蛋白拮抗藥（包括氯丙嗪等吩噻嗪類衍生物） 環(huán)孢素類（及其衍生物PSC833，SDZ280-466等） 抗雌激素類化合物（他莫昔芬）等,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),17,抗腫瘤藥物治療與發(fā)展抗腫瘤新藥,5. 細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑 原理：通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡達(dá)到腫瘤縮小、消退的目的已成為當(dāng)今腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。促進(jìn)惡性

8、細(xì)胞向成熟分化的抗癌藥物稱分化誘導(dǎo)劑。 代表藥物：維A酸類化合物 咪唑衍生物利阿唑,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),18,維A酸類化合物維甲酸類化合物(Retinoic acids)在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等生命活動(dòng)中起重要作用。其在體內(nèi)的生理活性代謝產(chǎn)物包括全反式維甲酸(ATRA)、13-順維甲酸(13-cis-RA)和9-順維甲酸(9-cis-RA)，它們可通過(guò)核維甲酸受體(RAR)結(jié)合于DNA應(yīng)答元件，從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),19,抗腫瘤藥物治療與發(fā)展抗腫瘤新藥,6. 基因調(diào)節(jié)藥物,1）反義藥物: 反義寡核苷酸藥物（AODNs） 2）Decoy核酸:雙鏈寡聚核酸

9、3）RNA干擾: (RNAinterference，RNAi)是將與mRNA對(duì)應(yīng)的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默。這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制被稱為RNA干擾（RNAi,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),20,反義寡核苷酸藥物（AODNs,反義藥物又稱反義寡核苷酸藥物（AODNs） ，是指人工合成長(zhǎng)度為1030個(gè)堿 基的DNA分子及其類似物。根據(jù)核苷酸雜交原理，反義藥物能與特定的 基因雜交，在基因水平上干擾致病蛋白質(zhì)的產(chǎn)生過(guò)程,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),21,反義藥物又稱反義寡核苷酸藥物（AODNs） ，是指人工合成長(zhǎng)度為1030個(gè)堿 基的DNA分子及

10、其類似物。根據(jù)核苷酸雜交原理，反義藥物能與特定的 基因雜交，在基因水平上干擾致病蛋白質(zhì)的產(chǎn)生過(guò)程。 AODNs 可以與其靶RNA鏈互補(bǔ)結(jié)合，形成RNA-DNA雜交雙鏈。形成的雜交雙鏈可以被RNA酶H識(shí)別并消化RNA鏈，由此釋放出的 AODN可以繼續(xù)與靶RNA鏈結(jié)合，最終導(dǎo)致編碼基因沉默。由此可推RNA酶H過(guò)多表達(dá)可增強(qiáng)各種AODNs效應(yīng)，反之RNA酶H受抑則降低其作用。有些AODNs 并不能激活RNA酶H，相反與翻譯元件競(jìng)爭(zhēng)空間因此可抑制RNA翻譯。另外，AODNs 如果和mRNA結(jié)合可作用于內(nèi)含子外顯子接合處以中斷其拼接過(guò)程。AODNs還可以占領(lǐng)校正RNA細(xì)胞內(nèi)定位的蛋白R(shí)NA作用序列，從而

11、擾亂RNA運(yùn)輸 藥物：Vitravene,a、反義藥物,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),22,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),23,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),24,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),25,抗腫瘤藥物治療與發(fā)展藥物分類,7、單克隆抗體藥物: 代表藥物:曲妥珠單抗（trastuzumab， Herceptin ） 單克隆抗體(單抗)藥物就是通過(guò)淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)或基因工程技術(shù)制備的抗體。 治療腫瘤的優(yōu)越性： （1）單抗藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用 （2）單抗藥物具有更高的療效 （3）單抗藥物對(duì)腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)的特異性作用 將抗體與化學(xué)藥物、酶、放射性核素、毒素和生物誘導(dǎo)劑等耦聯(lián)后直接殺傷腫瘤或者

12、利用抗體促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤血管生成，用于腫瘤，病毒感染，心血管疾病等方面,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),26,抗腫瘤新藥發(fā)現(xiàn),新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),27,Mathematical model,Cell Biology,Target selection,Drug design,Pre)clinical testing,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),28,抗腫瘤新藥研究策略,藥物藥效發(fā)現(xiàn),作用部位,作用機(jī)制,藥 物 靶 點(diǎn),藥物結(jié)合,新藥發(fā)現(xiàn),多靶點(diǎn)機(jī)制,藥效作用,新藥發(fā)現(xiàn),抗腫瘤藥物研究方法,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),29,抗腫瘤藥物研究方法,動(dòng)物腫瘤體內(nèi)篩選法 腫瘤細(xì)胞體外篩選法

13、抗腫瘤藥作用機(jī)制研究方法 抗腫瘤藥耐藥性實(shí)驗(yàn)方法 腫瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)法 抗腫瘤血管生成的實(shí)驗(yàn)法,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),30,動(dòng)物腫瘤體內(nèi)篩選法,動(dòng)物移植性腫瘤實(shí)驗(yàn)法（最通用） 誘發(fā)性動(dòng)物腫瘤實(shí)驗(yàn)法 自發(fā)性動(dòng)物腫瘤實(shí)驗(yàn)法,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),31,動(dòng)物腫瘤體內(nèi)篩選法,動(dòng)物移植性腫瘤實(shí)驗(yàn)法（最通用,確定用何種動(dòng)物 確定用何種腫瘤模型 確定給藥設(shè)計(jì)、分組 確定藥物劑量、給藥途徑 確定藥效學(xué)觀察指標(biāo) 一般指標(biāo) 腫瘤評(píng)價(jià)指標(biāo) 血液生化指標(biāo),新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),32,動(dòng)物腫瘤體內(nèi)篩選法,動(dòng)物移植性腫瘤實(shí)驗(yàn)法（最通用） 動(dòng)物的選擇,選用解剖生理特點(diǎn)符合實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊蟮膶?shí)驗(yàn)動(dòng)物做試驗(yàn)，是保

14、證試驗(yàn)成功的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有的某些解剖生理特點(diǎn)，為實(shí)驗(yàn)所要觀察的器官或組織等提供了很多便利條件,在抗腫瘤研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，最常用的動(dòng)物是小鼠,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),33,常用小鼠品系,1. BALB/c-nu/nu 2. NOD-SCID 3. BALB/c 4. C57BL/6J 5. DBA/2 6. ICR 7. NIH 8. KM,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),34,常用小鼠品系近交系,C57BL/6,BALB/c,DBA,129,C3H,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),35,突變系小鼠,SCID小鼠,裸小鼠,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),36,封閉群小鼠,KM,NIH,昆明小鼠,長(zhǎng)爪

15、沙鼠（蒙古沙土鼠,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),37,早期荷瘤昆明種小鼠 中期荷瘤小鼠,中晚期荷瘤小鼠 中晚期荷瘤小鼠 晚期荷瘤小鼠,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),38,動(dòng)物腫瘤體內(nèi)篩選法,動(dòng)物移植性腫瘤實(shí)驗(yàn)法（最通用） 動(dòng)物的選擇 腫瘤的移植,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),39,接種一定數(shù)量的腫瘤細(xì)胞(皮下、腹腔、靜脈、顱內(nèi)等)，或無(wú)細(xì)胞濾液(病毒性腫瘤)于動(dòng)物體內(nèi)。 優(yōu)點(diǎn)：1.使一群動(dòng)物在幾乎相同的時(shí)間內(nèi)患同樣的腫瘤，其成功率接近100。 2.腫瘤形態(tài)、生長(zhǎng)率、對(duì)藥物的敏感性、死亡時(shí)間等非常相近，個(gè)體差異較小。 3.對(duì)宿主的影響也類似,易于客觀判斷療效, 易于人為操作及施加干擾因素 4.可以同種

16、或同品系動(dòng)物中連續(xù)移植,長(zhǎng)期保留供試驗(yàn)之用,試驗(yàn)周期一般較短,動(dòng)物移植性腫瘤模型 -作為藥物篩選的模型非常合適,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),40,全世界保種的瘤株有500種以上 常用于篩選及藥效學(xué)試驗(yàn)的大概只有40種左右 其中大多數(shù)是小鼠腫瘤，少數(shù)為大鼠或倉(cāng)鼠的腫瘤 如：小鼠白血病P388和L1210(宿主為DBA/2小鼠)，Lewis肺癌及B16黑色素瘤(宿主為C57BLC/6小鼠)、結(jié)腸癌Colon26、Colon38(宿主為BALB/c小鼠)以及Erlish腹水癌、肉瘤180(S180)、白血病L5170、Friend白血病、腺癌755、Ridaway骨肉瘤、小鼠肝癌2HAC、肉瘤37、

17、腦瘤22、小鼠宮頸癌、白血病615以及大鼠的腫瘤W256、吉田肉瘤等,動(dòng)物移植性腫瘤模型,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),41,可移植腫瘤的基本條件是: (1)能準(zhǔn)確重現(xiàn)所移植的腫瘤; (2)有足夠的體積和荷瘤時(shí)間供研究者使用;(3)便于推廣應(yīng)用。 缺點(diǎn)： 1.這類腫瘤生長(zhǎng)速度快,增殖比率高,體積倍增時(shí)間短,這些都是與人體腫瘤的顯著不同點(diǎn),特別是與人的實(shí)體瘤差別更大。許多國(guó)家篩抗癌藥物中選用移植瘤株經(jīng)常改變,主要原因可能也與此有關(guān)。 2.不能用于病因?qū)W、癌前病變和癌變的研究,動(dòng)物移植性腫瘤模型,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),42,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心 清潔級(jí)準(zhǔn)備室,清潔級(jí)走廊 小鼠飼養(yǎng)室,新藥理 抗腫瘤藥研

18、究與開發(fā),43,動(dòng)物腫瘤體內(nèi)篩選法,動(dòng)物移植性腫瘤實(shí)驗(yàn)法（最通用） 動(dòng)物的選擇 腫瘤的移植 移植性動(dòng)物腫瘤的質(zhì)量鑒定 待篩樣品的制備,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),44,待篩樣品的制備,合成藥的制備 抗菌藥濾液的制備 中草藥樣品的制備,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),45,動(dòng)物腫瘤體內(nèi)篩選法,動(dòng)物移植性腫瘤實(shí)驗(yàn)法（最通用） 動(dòng)物的選擇 腫瘤的移植 移植性動(dòng)物腫瘤的質(zhì)量鑒定 待篩樣品的制備 待篩藥物的給藥途徑 劑量的選擇及分組動(dòng)物的確定,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),46,劑量的選擇及分組動(dòng)物的確定,對(duì)照組鼠數(shù)試驗(yàn)組鼠數(shù)組數(shù),新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),47,動(dòng)物腫瘤體內(nèi)篩選法,動(dòng)物移植性腫瘤實(shí)驗(yàn)法（最

19、通用） 動(dòng)物的選擇 腫瘤的移植 移植性動(dòng)物腫瘤的質(zhì)量鑒定 待篩樣品的制備 待篩藥物的給藥途徑 劑量的選擇及分組動(dòng)物的確定 療效評(píng)價(jià),新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),48,療效評(píng)價(jià),實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià) 瘤重抑制率T/C100% 或瘤重抑制率（1-T/C）100% （T：給藥組平均瘤重；C：對(duì)照組平均瘤重,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),49,Human lung cancer NCI-H460 xenografted in nude mice without treatment,Human lung cancer NCI-H460 xenografted in nude mice with Compound

20、 C treatment,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),50,療效評(píng)價(jià),實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià) 瘤重抑制率T/C100% 或瘤重抑制率（1-T/C）100% （T：給藥組平均瘤重；C：對(duì)照組平均瘤重） 腹水型腫瘤療效評(píng)價(jià)（懸浮腫瘤細(xì)胞） 生命延長(zhǎng)率（T/C-1）100% 或生命延長(zhǎng)率T/C100% （T：給藥組平均生存時(shí)間；C：對(duì)照組平均生存時(shí)間,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),51,一般指標(biāo)：體重、進(jìn)食、動(dòng)物一般狀態(tài)等,腫瘤評(píng)價(jià)指標(biāo)：瘤重，相關(guān)瘤基因的表達(dá)，抑癌率，腫瘤細(xì)胞學(xué)指標(biāo),血液生化指標(biāo)：與腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移有關(guān)的血清學(xué)指標(biāo)以及對(duì)免疫、造血系統(tǒng)、肝腎功能的影響等,其他指標(biāo),新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),5

21、2,動(dòng)物腫瘤體內(nèi)篩選法,動(dòng)物移植性腫瘤實(shí)驗(yàn)法（最通用） 誘發(fā)性動(dòng)物腫瘤實(shí)驗(yàn)法 自發(fā)性動(dòng)物腫瘤實(shí)驗(yàn)法,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),53,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,動(dòng)物腫瘤體內(nèi)篩選法 腫瘤細(xì)胞體外篩選法 抗腫瘤藥作用機(jī)制研究方法 抗腫瘤藥耐藥性實(shí)驗(yàn)方法 腫瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)法 抗腫瘤血管生成的實(shí)驗(yàn)法,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),54,腫瘤細(xì)胞體外篩選法,目的： 對(duì)候選化合物進(jìn)行初步篩選； 了解候選化合物的抗瘤譜； 為隨后進(jìn)行的體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)提供參考， 如劑量范圍、腫瘤類別等,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),55,腫瘤細(xì)胞體外篩選法,體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞系 體外抗癌藥物篩選方法,1.細(xì)胞種類：人肝癌細(xì)胞株2.培養(yǎng)天數(shù)

22、：傳代后第1天；3.放大倍數(shù)：倒置顯微鏡 X40；4.培養(yǎng)基種類：1640+ 10% 胎牛血清5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),1.食管癌細(xì)胞株表達(dá)MMP2 2.培養(yǎng)的天數(shù)：2d;細(xì)胞倍增時(shí)間-24h左右；3.放大倍速：倒置熒光顯微鏡，100倍；4.培養(yǎng)基種類：1640+10%胎牛血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述:細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)；6.目的：鑒定食管癌細(xì)胞表達(dá)MMP-2，胞漿中綠色熒光為MMP-2，細(xì)胞核紅色熒光為PI復(fù)染,1.細(xì)胞種類：人胃腫瘤細(xì)胞SGC7901細(xì)胞2.培養(yǎng)的天數(shù)：2天；3.放大倍速：倒置顯微鏡 X10；4.培養(yǎng)基種類：DMEM+10%小牛血清（杭州四季青）；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)

23、述:細(xì)胞呈梭型貼壁生長(zhǎng),1.人成骨肉瘤細(xì)胞Saos-2細(xì)胞2.細(xì)胞來(lái)源：美國(guó)ATCC3.培養(yǎng)天數(shù)：傳代后24h4.放大倍數(shù)：熒光顯微鏡40*5.培養(yǎng)基：85% McCoys 5A + 15% FBS6.染色方法：AO7.描述：細(xì)胞多角形，貼壁良好，鋪展面積大,1.細(xì)胞種類：BNHL(非何杰金淋巴瘤細(xì)胞株): Daudi細(xì)胞；2.培養(yǎng)的天數(shù)：2d；3.放大倍數(shù)：熒光顯微鏡顯微鏡 X40；Hoechst 33258 染色4.培養(yǎng)基種類：1640+10%胎牛血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述:細(xì)胞呈圓形，成團(tuán)生長(zhǎng),1.細(xì)胞種類：小鼠骨髓瘤細(xì)胞;sp2/0 2.培養(yǎng)的天數(shù)：復(fù)蘇后12小時(shí)；3.放大倍速：倒置

24、顯微鏡 X20；4.培養(yǎng)基種類：DMEM+6%FBS；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述:細(xì)胞呈圓型或橢圓形，貼壁生長(zhǎng),1.細(xì)胞種類：人纖維肉瘤細(xì)胞2.培養(yǎng)的天數(shù)：5天；3.放大倍速：倒置顯微鏡 X10；4.培養(yǎng)基種類：1640+10%小牛血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述:細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),1.細(xì)胞種類：人口腔皮樣癌KB細(xì)胞株；2.培養(yǎng)的天數(shù)：3d3.放大倍數(shù)：倒置顯微鏡高倍鏡 放大40倍；4.培養(yǎng)基種類：1640+10%小牛血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述:貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，呈不規(guī)則形狀,BGC823：人胃腺癌細(xì)胞培養(yǎng)條件：DMEM高糖10FBS2mML-Glu,1.K562：人白血病細(xì)胞2.形態(tài)：懸浮細(xì)胞、規(guī)則、圓形

25、3.培養(yǎng)條件：IMDM10FBS4mML-Glu4.每2到3天換一次液，5.大約1x105cells/ml,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),66,腫瘤細(xì)胞體外篩選法,體外試驗(yàn)常用方法有： 染料排斥法 四氮唑鹽還原法（MTT法） 阿拉馬藍(lán)法 磺酰羅丹明染色法 集落形成法 生長(zhǎng)曲線測(cè)定法,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),67,腫瘤細(xì)胞體外篩選法,藥物與細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)間一般為48-72 小時(shí)，貼壁細(xì)胞需先貼壁24小時(shí)后再給藥。試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陽(yáng)性及陰性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照用一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗腫瘤藥，陰性對(duì)照為溶媒對(duì)照,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),68,Human NCI-H460 lung cancer cell with

26、out treatment,Human NCI-H460 lung cancer cell With Compound A treatment,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),69,腫瘤細(xì)胞體外篩選法,以MTT法為例： 試驗(yàn)原理：四氮唑(MTT)是一種能接受氫原子的染料?；罴?xì)胞線粒體中與NADP相關(guān)的脫氫酶在細(xì)胞內(nèi)可將黃色的MTT轉(zhuǎn)化成不溶性的藍(lán)紫色的甲臜(formazan)，而死的細(xì)胞則無(wú)此功能。用二甲基亞諷(DMSO)溶解甲臜后，在一定波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值，即可定量測(cè)出細(xì)胞的存活率。 方法要點(diǎn)：受試樣品處理細(xì)胞結(jié)束后，加入5mg/ml MTT液20微升/孔，繼續(xù)培養(yǎng)四小時(shí)。再加三聯(lián)液并培

27、養(yǎng)過(guò)夜。在酶標(biāo)儀上于570nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值。 觀測(cè)指標(biāo) 直接指標(biāo)為96孔板上各被測(cè)孔的OD值；然后按公式（對(duì)照組OD值-治療組OD值）/對(duì)照組OD值100%計(jì)算出相應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率；并進(jìn)一步采用Logit法計(jì)算50%生長(zhǎng)抑制濃度IC50值,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),70,抗腫瘤藥物研究方法,動(dòng)物腫瘤體內(nèi)篩選法 腫瘤細(xì)胞體外篩選法 抗腫瘤藥作用機(jī)制研究方法,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),71,抗腫瘤藥作用機(jī)制研究方法,抗微管藥物試驗(yàn)方法 抗癌藥對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶作用的實(shí)驗(yàn)法 對(duì)型拓?fù)洚悩?gòu)酶作用 對(duì)I型拓?fù)洚悩?gòu)酶作用 反義寡核苷酸藥物研究 （ASON：可進(jìn)行人工大量合成,新藥理 抗腫瘤藥研究

28、與開發(fā),72,抗腫瘤藥物的研究進(jìn)展及發(fā)展方向 腫瘤組織十分復(fù)雜，包含有各群、各期和各型的腫瘤細(xì)胞 。 各群： 腫瘤由增殖細(xì)胞群（干細(xì)胞），非增殖細(xì)胞群（Go期細(xì)胞）和 無(wú)增殖能力細(xì)胞群組成；此外還有化療后產(chǎn)生的耐藥細(xì)胞群。 各期: 增殖細(xì)胞群（干細(xì)胞）由G1期（DNA合成前期）、S期（DNA 合成期）、G2期（細(xì)胞分裂前期）和M 期（細(xì)胞分裂期）。 各型： 惡性腫瘤由包含不同遺傳突變的各種細(xì)胞混雜構(gòu)成， 而每一 種突變細(xì)胞都將造成不同的癥狀。有的突變可形成腫瘤；有的會(huì) 生成新的毛細(xì)血管，供給新生腫瘤營(yíng)養(yǎng)，促使腫瘤迅速增殖； 有的則浸潤(rùn)，侵襲正常組織致擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，形成全身多灶性分布。 所以，很難用

29、一種藥物來(lái)抑制和殺滅腫瘤。 這是聯(lián)合用藥和綜合治療的依據(jù),新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),73,癌癥的臨床特點(diǎn) 及 抗癌藥的研究及發(fā)展方向 1.難早發(fā)現(xiàn) 發(fā)展方向：由治癌向 防癌 （早期診斷試劑）方向發(fā)展。 2.增殖迅速 傳統(tǒng)抗癌藥能有效地抑制迅速增長(zhǎng)的腫瘤組織，但特異 性較差，毒副作用大。 研究方向：高效低毒、高特異性的抗癌藥 例如： 抗體介導(dǎo)酶前體藥物（ADEP） 腫瘤血管生成抑制劑 (TAI) PD-1/PD-L1免疫療法,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),74,2.1 ADEP（抗體介導(dǎo)的酶前體藥物） 前藥是一類本身無(wú)活性或活性很低，但在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為活性物質(zhì)的藥物。利用抗體作為載體攜帶前藥的專一

30、性活化酶，可以選擇性地結(jié)合于腫瘤部位，使前藥可以區(qū)域特異性地在腫瘤組織內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性細(xì)胞毒分子。自1987年Bagshawe提出ADEPT這一概念,已引起了人們廣泛的關(guān)注,它克服了以往化學(xué)免疫偶聯(lián)物和免疫毒素存在的許多問(wèn)題。 2.2 TAI（腫瘤血管生成抑制劑） 體內(nèi)直徑超過(guò)2mm實(shí)體瘤，瘤體內(nèi)無(wú)一例外都有新生血管的形成。新生血管的生成是腫瘤發(fā)展轉(zhuǎn)移的重要條件，也是所有癌癥的共性。所以抑制新生血管生成可以阻斷腫營(yíng)養(yǎng)供給，達(dá)到抑制腫瘤和抗轉(zhuǎn)移的目的,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),75,PD-1(programmed death 1)程序性死亡受體1，是一種重要的免疫抑制分子。為CD28超家族成員,其

31、最初是從凋亡的小鼠T細(xì)胞雜交瘤2B4.11克隆出來(lái)。以PD-1為靶點(diǎn)的免疫調(diào)節(jié)對(duì)抗,2.3 PD-1/PD-L1免疫療法,腫瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意義。其配體PD-L1也可作為靶點(diǎn)，相應(yīng)的抗體也可以起到相同的作用,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),76,PD-1/PD-L1免疫療法（immunotherapy）是當(dāng)前全世界備受矚目、廣為研究的新一類抗癌免疫療法，旨在充分利用人體自身的免疫系統(tǒng)抵御、抗擊癌癥，通過(guò)阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路使癌細(xì)胞死亡，具有治療多種類型腫瘤的潛力，有望實(shí)質(zhì)性改善患者總生存期。如此誘人的醫(yī)療價(jià)值和商業(yè)前景，各大制藥巨頭自然絕不放過(guò)，競(jìng)

32、賽空前的激烈！包括默沙東、百時(shí)美施貴寶、阿斯利康、羅氏。黑色素瘤則是首選被關(guān)注的適應(yīng)癥。百時(shí)美施貴寶的PD-1抑制劑Opdivo（nivolumab）于2014年7月在日本獲得批準(zhǔn)，成為全球批準(zhǔn)的首個(gè)PD-1抑制劑；而默沙東的Keytruda于2014年9月初獲FDA批準(zhǔn)，是美國(guó)批準(zhǔn)的首個(gè)PD-1抑制劑。阿斯利康和羅氏的PD-L1抑制劑也已處于III期臨床。PD-1/PD-L1免疫療法可用于其它更大范圍的腫瘤，如肺癌。單藥療法和組合療法的臨床試驗(yàn)緊鑼密鼓地進(jìn)行，以徹底發(fā)掘該類神奇藥物的最大臨床潛力和價(jià)值,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),77,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),78,新藥理 抗腫瘤藥研究與

33、開發(fā),79,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),80,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),81,癌癥的臨床特點(diǎn)及抗癌藥研究發(fā)展方向 3.癌細(xì)胞易產(chǎn)生耐藥性（化療難點(diǎn)） 增強(qiáng)療效或者降低 毒性 抗癌藥的聯(lián)合應(yīng)用 （綜合化療） 易產(chǎn)生耐藥性 化療失敗（主要原因） MDR（多藥耐藥）： 癌細(xì)胞一旦對(duì)某種抗癌藥產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)對(duì)其他結(jié)構(gòu)上無(wú) 甚相同至作用機(jī)理也各異的藥物產(chǎn)生交叉耐藥性。是導(dǎo)致腫 瘤化療失敗的最重要的原因，是腫瘤化療中的一大難點(diǎn)。 研究方向：MDR逆轉(zhuǎn)劑,新藥理 抗腫瘤藥研究與開發(fā),82,癌癥的臨床特點(diǎn)及抗癌藥研究發(fā)展方向 4.易轉(zhuǎn)移擴(kuò)散 臨床診斷的腫瘤患者大約有50%以上的已經(jīng)發(fā)了轉(zhuǎn)移，而大部分癌癥患者最后都死于轉(zhuǎn)移。 研究方向： 抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥。 （1）腫瘤轉(zhuǎn)移多肽抑制劑， （2）腫瘤細(xì)胞水解酶抑制劑如：MMP抑制劑。 發(fā)展方向：體內(nèi)作用時(shí)間長(zhǎng)、可口服的偽肽類抗轉(zhuǎn)移藥。 5.易復(fù)發(fā) 方向：殺滅對(duì)傳統(tǒng)抗癌藥不敏感的非增殖期的腫瘤細(xì)胞； 現(xiàn)殺