實(shí)驗(yàn)一 氨基酸薄層層析剖析

1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn),溫州醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室,毛孫忠,7A211 86689978,氨,基,酸,薄,層,層,析,Thin Layer Chromatography,Of,Amino Acid,層,析,層析原理,待分離物質(zhì)（流動(dòng)相）經(jīng)過(guò)一個(gè)固態(tài)物質(zhì)（固,定相）時(shí)，根據(jù)溶液中待分離物質(zhì)各組分顆粒,大小、電荷多少及親和力等，使待分離物質(zhì)中,各組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng),固定相而達(dá)到分離混合物的目的,層析概念,層析為實(shí)驗(yàn)室一類分離技術(shù)的總稱,層,析,分,類,按流動(dòng)相,氣相層析,液相層析,按固定相形狀,柱層析,薄層層析,紙層析,層,析,分,類,類別,分離原理,基質(zhì)或載體,吸附層析,化學(xué)、物理吸附,

2、硅膠、氧化鋁,羥基磷酸,分配層析,兩溶劑相中的溶解效應(yīng),纖維素、硅藻土,硅膠,凝膠過(guò)濾,分子篩效應(yīng)的排阻效應(yīng),瓊脂糖、葡聚糖,離子交換層析,離子基團(tuán)的交換反應(yīng),離子交換樹(shù)脂,纖維素,葡聚糖,親和層析,分離物與配體之間有,帶配基的瓊脂糖,特殊親和力,或葡聚糖,原,理,薄層層析由一平鋪固定于玻璃板或塑料板的固定相,及一由有機(jī)溶劑構(gòu)成的流動(dòng)相組成。樣品點(diǎn)在固定,相，由于樣品中不同的成分被固定相吸附劑吸附的,牢固程度不同及在有機(jī)溶劑中溶解性質(zhì)不同，當(dāng)有,機(jī)溶劑因?yàn)槊?xì)管作用沿吸附劑上升時(shí)，不同的成,分而被分開(kāi)。當(dāng)與一標(biāo)準(zhǔn)物同時(shí)層析時(shí)，可鑒定未,知樣品中的不同成分,操,作,制板,點(diǎn)樣,展層,染色,R,f

3、,Retention factor,計(jì)算,1,點(diǎn),樣,2cm,鉛筆劃線,小、均勻,2,展,層,30,30,板要端正,劃線端朝上,下,先吹干,3,染,色,標(biāo)記溶劑前沿,吹干,噴茚三酮,吹干,4,測(cè)量并計(jì)算,R,f,AA,斑點(diǎn)中心到底線距離,溶劑前沿到底線距離,Arginine,Leucine,Alanine,Mixture,前,沿,三種氨基酸,R,f,的計(jì)算,實(shí)驗(yàn)室規(guī)則,自覺(jué)遵守學(xué)習(xí)紀(jì)律，保持實(shí)驗(yàn)室肅靜，不得,喧嘩吵鬧、遲到、早退、缺席。每次實(shí)驗(yàn)都要穿白,大褂、禁止穿拖鞋,愛(ài)護(hù)儀器，厲行節(jié)約。取用試劑時(shí)，應(yīng)仔,細(xì)辨明標(biāo)簽，以免取錯(cuò)。取完試劑后，應(yīng)及時(shí)蓋好,瓶蓋，放回原處，切忌亂拿亂放、“張冠李戴

4、,3,注意安全、對(duì)于有毒、腐蝕的試劑更應(yīng)注,意，應(yīng)避免其直接接觸人體及衣物,4,注意實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生、整潔。廢棄液體應(yīng)倒入,水槽，放水沖走。實(shí)驗(yàn)用過(guò)的和棉花、廢紙、沉淀,廢渣及其他廢棄物品等均應(yīng)放入指定容器，不得隨,意亂扔或丟進(jìn)水槽。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)將實(shí)驗(yàn)臺(tái)整理好,并清掃、整理實(shí)驗(yàn)室。關(guān)好水、電、門、窗,一、層析技術(shù),1,層析技術(shù)概念,2,層析技術(shù)分類,3,常用層析技術(shù)原理,色譜起源,色譜,組分,色素,石油醚,碳酸鈣顆粒,用色彩,chroma,和圖譜,graphs,組成色譜,一詞,Chromatography,是,1903,年俄國(guó)植物學(xué)家,Michael Tswett,發(fā)現(xiàn)并命名的,層析：是一種物理的分

5、離方法，利用混合物中各,組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程,度分布在兩相中，其中一相為,固定相,另一相流,過(guò)此相稱作,流動(dòng)相,并使各組分以不同速度移動(dòng),從而達(dá)到分離的目的,1,層析技術(shù)概念,2,層析技術(shù)分類,名稱,操作方式,固定相,流動(dòng)相,分離依據(jù),吸附層析,吸附薄層層析,氣體吸附層析,固體,固體,液體,氣體,吸附力,分配層析,紙層析,液體,液體,溶解度,離子交換層析,離子交換柱層析,固體,液體,帶電性,靜電引力,凝膠層析,凝膠過(guò)濾,固體,液體,分子大小,親合層析,酶與底物,抗原與抗體,固體,液體,配體專一性,1,吸附層析,原理：當(dāng)氣體或液體中某組分的分子在運(yùn)動(dòng)中碰到一個(gè)固,體表面時(shí)，

6、分子會(huì)貼在固體表面上并停留一定時(shí)間然后才,離開(kāi)，此為吸附現(xiàn)象,由此產(chǎn)生,吸附,脫離,再吸附,再脫離,的現(xiàn)象,吸附劑,硅膠、氧化鋁,活性炭；纖維素、淀粉、聚酰胺,滑石、陶土、粘土,3,常用的層析原理,2,分配層析,紙層析,原理：溶質(zhì)在互不相溶的兩相中溶解度不同,在終點(diǎn)時(shí)達(dá)到一種平衡，其比值為一個(gè)常數(shù),即分配系數(shù),固定相內(nèi)溶質(zhì)的濃度,流動(dòng)相內(nèi)溶質(zhì)的濃度,固定相：濾紙上吸附的水,流動(dòng)相：有機(jī)溶劑（正丁醇,3,離子交換層析,原理：將能與周圍介質(zhì)進(jìn)行離子交換的不穩(wěn)定離子固定于,惰性基質(zhì)上，從而分離介質(zhì)中的組分,常用的惰性基質(zhì)：人工合成樹(shù)脂（單體：苯乙烯、交聯(lián)劑,二乙烯苯,陽(yáng)離子交換劑：磺酸甲基、羧甲基、

7、磷酸基,陰離子交換劑：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基,可交換離子：陽(yáng)離子,Na,H,陰離子,Cl,OH,帶,正,電荷多,蛋白緊密結(jié)合,帶,負(fù),電荷多,蛋白流過(guò)層析,柱,陽(yáng),離,子,交,換,樹(shù),脂,工,作,示,意,圖,陽(yáng),離,子,交,換,樹(shù),脂,4,凝膠過(guò)濾,原理,被分離物質(zhì)因分子大小不同，在凝膠中向下移動(dòng)的,速度不同,物質(zhì)進(jìn)入凝膠柱之后有兩種運(yùn)動(dòng)方式,垂直向下移動(dòng)和無(wú)定向,的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。大分子物質(zhì)直徑大無(wú)法進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)，只能分,布于顆粒間隙中向下移動(dòng)快，而小分子物質(zhì)可擴(kuò)散到凝膠顆粒,內(nèi)，因此向下移動(dòng)慢,凝膠物質(zhì),馬鈴薯淀粉凝膠、瓊脂、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰,胺凝膠、葡聚糖凝膠,5,親和層析,原理,利用分子間具有專一親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù),專一親和力分子對(duì),酶與底物、特異性抗原與抗,體,DNA,和,RNA,激素和其受體,載體,使親和物固相化的水不溶性化合物。如：纖維,素、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、聚苯乙烯、乙烯,多孔玻璃,品名,規(guī)格,數(shù)量