分子病毒學-第l2六章-病毒裝配成熟釋放

1、Molecular Virology,分子病毒學,目錄,第一章 概論 第二章 病毒的形態(tài)結構 第三章 病毒吸附宿主及內化過程 第四章 病毒的基因組復制 第五章 病毒基因的表達 第六章 病毒裝配和釋放 第七章 病毒感染與機體抗病毒免疫 第八章 病毒感染的病理與治療,Basic process of viral assemble and release,2-capsid formation,3-genome packaged into capsid,4-acqure envelope,1- structural unit formation,6-maturation,5-release,病毒的組裝

2、 Assembly,裝配：在宿主內，合成一個完整的病毒粒子需要的各個組分按照一定一定方式進行組裝形成一個新的病毒粒子的過程； 2. 裝配過程中，結構蛋白首先形成一個結構單元（structural unit）；然后多個結構單元再組裝成不成熟的前衣殼，經(jīng)過一定修飾，形成成熟的衣殼。 3. 裝配位置因病毒不同而異，主要取決于病毒在胞內復制位點和釋放機制: 胞質中裝配：picornaviruses, poxviruses & reoviruses 核中裝配：adenoviruses, polyomaviruses & parvoviruses it 胞膜位置裝配：HIV,病毒的自組裝和輔助組裝Self

3、-Assembly and Assisted Assembly,VP1 pentamers in SV40,1-有的病毒蛋白一級結構序列含有足夠的自組裝信息。 比如，VP1在 E-coli表達, 分離出來的VP1 就是五聚體，在體外就可組成類-衣殼的結構 2-盡管對病毒結構蛋而言，自組裝是基本機制，但還需要病毒的或細胞的其他組分參與組裝，起輔助作用。,參與病毒組裝的輔助成分,病毒成分： - 基因組 RNA （ 作為裝配時的支架（scaffold）- ssRNA viruses and Retrovirus assembly). 或與結構蛋白互作）-. 細胞成分 - 胞膜 結構蛋白與細胞膜發(fā)生關

4、聯(lián)（association ），對某些蛋白衣殼裝配是必需的,- Cellular and Viral proteins,參與病毒組裝的輔助成分,- Cellular and Viral proteins,參與病毒組裝的細胞輔助成分,分子伴侶,- Cellular and Viral proteins,參與病毒組裝的病毒輔助成分,分子伴侶,支架蛋白,病毒支架蛋白Scaffolding Protein,是病毒裝配必須成分 支架蛋白：參與核衣殼或衣殼的裝配，但后來又被移除，所以這類蛋白稱為支架蛋白。 舉例 -VP22a , HSV-1 - L1 52/55-kDa, Adenovirus,Herpe

5、s virus,1 結構單元（structural unit)的組裝-機制 -由單一蛋白（individual proteins） -或長肽多聚蛋白（polyprotein）組裝 - 由細胞或病毒的分子伴侶（Viral Chaperone or Cellular Chaperone）協(xié)助,第一步 蛋白衣殼的裝配,SV40病毒衣殼五聚體的組裝 -來自單個蛋白,表達,組裝,腺病毒II型 衣殼五聚體的組裝 -來自單個蛋白,脊髓灰質炎病毒衣殼結構單元組裝 -來自于長肽寡聚蛋白-,腺病毒II型 衣殼六聚體的組裝 -分子伴侶輔助,第二步：形成衣殼或核衣殼,Bacteriophage T4 ,鞘機基盤的組裝

6、,頭部組裝,尾絲組裝,Bacteriophage T4 progressively more complex structures are formed in a stepwise mechanism,對許多病毒而言，衣殼結構中間體很難分離或,第三步：包裝基因組和其它病毒成分,- sequence at the 5 end of Retrovirus is the major packaging signal.,反轉錄病毒RNA基因組上的包裝信號,螺旋對稱桿狀衣殼的裝配 （helical capsids）,以TMV為例： 衣殼的裝配圍繞基因組進行 1. 衣殼蛋白首先形成一個盤狀結構,由17個亞

7、單位（ subunits，capsomers，衣殼粒）組成 2. 合成好的基因組RNA被捕獲到盤狀結構的中心，掛在盤子的“內壁”上（基因組內部的一個位點與內壁結合）； 以盤狀結構為中心，向兩個方向延伸，堆積結構單元，延長桿狀結構 延長過程中，RNA基因組從上下兩個方向分別不斷被拉伸進入螺旋結構的內壁,5,3,盤狀結構（起始結構）,合成好的基因組RNA,上,下,衣殼向兩個方向延伸 基因組的兩端也貼著衣殼內壁，向兩個方向延伸，嵌合在衣殼內壁中,特定序列,TMV assembly,二十面體球狀衣殼和基因組的組裝,外殼先裝配，基因組再插入 結構單元（ capsomer subunits）圍繞著支架蛋白

8、（ scaffolding protein）進行初級組裝成前衣殼（ procapsid） 支架蛋白被從衣殼中移除（再利用），形成一個中空衣殼。 基因組塞入中空衣殼 。這個過程需要能量和衣殼一定的構象的變化。,某些病毒蛋白（核酸酶活性）可以識別基因組的包裝信號序列，并與之結合形成復合體；再與空衣殼的門戶蛋白發(fā)生相互作用，把基因組拉伸進入衣殼；當一倍長度的基因組拉伸進入衣殼時，在復合體中核酸酶切割下其余部分；門戶蛋白被帽蛋白取代，核衣殼組裝完畢,Fig.p72,前衣殼到變成成熟的衣殼需要一定病毒編碼的蛋白水解酶（成熟蛋白酶）的參與，將一些前衣殼中的蛋白進行酶切，會導致衣殼結構發(fā)生微小的改變或穩(wěn)定性

9、發(fā)生微弱改變，這個過程中伴隨著基因組的進入。,支架蛋白,門戶蛋白,單純皰疹病毒DNA基因組的包裝,長獨特區(qū),短獨特區(qū),重復序列中含有包裝信號序列（ pac1, pac2 ）, 重復序列在基因組上由多個拷貝（短獨特區(qū)US只有一個拷貝）,單純皰疹病毒基因組復制是形成多拷貝的基因組頭尾相連的多連體DNA 基因組包裝信號（ pac1, pac2 ）位于基因組末端重復序列中。兩側還有正向重復序列（DR）是切割位點,Step 1-2 是基因組被包裝的過程啟動：先有幾個病毒蛋白（UL15，UL32,UL28，末端酶，或稱包裝蛋白，具有核酸切割活性）結合在基因組上的包裝信號序列位置形成一個復合體，與衣殼上的門

10、戶蛋白portal 發(fā)生相互作用，接下來，基因組的一個正向重復序列處（DR）發(fā)生第一次切割，由復合體中的包裝蛋白切下?；蚪M被拉入衣殼中； Step 3是在多連體基因組上一個全基因組位置被拖至入衣殼中后，由復合體中的包裝蛋白在另一個正向重復序列處（DR）進行第二次切割。 Step 4 是由病毒編碼的帽蛋白塞住衣殼出口。,單純皰疹病毒DNA基因組的包裝,病毒其它組分（酶或蛋白）進入衣殼,1:有些病毒蛋白本身是結構蛋白，同時參與病毒在宿主內的復制過程。Some of these proteins are also structural proteins of the virion - 單純皰疹病毒

11、的VP16 protein： a major component of the virion tegument and the activator of transcription of viral immediate-early genes. 2:它們包裝進入衣殼需要特定機制： （-）RNA病毒的轉錄酶RNA-dependent RNA polymerase必須以非共價鍵與基因組或結構蛋白相互作用被包裝進去，進入宿主后才可獨立發(fā)揮作用,(-) strand RNA viruses,1. 有的病毒（如 皰疹病毒）是在細胞核中進行裝配，所以它們出核膜時就會獲得一層包膜； 2. 其它包膜病毒衣殼裝

12、配可以發(fā)生在胞質中，有的如HIV發(fā)生在包膜上，所以可以從內質網(wǎng)膜或細胞膜上獲得包膜結構. 注意：,這些脂膜上必須有病毒編碼的糖蛋白后期表達蛋白，在高爾基體上修飾后，隨著液泡系運輸?shù)侥は抵?第四步 獲得包膜,跨膜蛋白是在粗面內質網(wǎng)上合成：當在核糖體上合成出來就插入到內質網(wǎng)中，在內內質網(wǎng)中糖基化。轉移到高爾基體進行進一步修飾和折疊，然后轉運到細胞膜上,病毒包膜中的糖蛋白的形成和轉運,HSV：Herpesviruses在核內包裝,冠狀病毒E1在內質網(wǎng)上包裝,機制一: 大多數(shù)包膜病毒，包裝和獲得衣殼是在時空上是分開的過程,e.g. Influenza virus/VSV,第四步 獲得包膜,機制二：反轉

13、錄病毒，裝配和獲得衣殼及出芽在時空上是同時的（coincident）.,第四步 獲得包膜,反轉錄病毒裝配和包膜的獲得及出芽釋放,衣殼,囊膜,基因組,膜上的跨膜糖蛋白,除植物病毒要設法突破植物細胞壁的障礙外，其它病毒從宿主中釋放一般采用的機制有： -裂解細胞： (most non-enveloped viruses), 宿主細胞完全破裂，病毒出來（噬菌體）-嗜菌斑 細胞空斑 -出芽：(Enveloped viruses）-病毒粒子釋放時在細胞膜胞質側向外頂出形成芽狀（細胞膜包裹著病毒粒子），離開細胞時就可以 獲得相應的囊膜， -運輸泡: 病毒在釋放前先進入一個胞外運輸泡（intracellula

14、r vesicle ），再通過細胞運輸泡系統(tǒng)運出到胞外。,第五步 病毒釋放,空斑形成,機制一 裂解細胞釋放,第五步 病毒釋放,包膜病毒出芽釋放- pull- or push-機制,第五步 病毒釋放,出芽點：病毒糖蛋白插入包膜，產生拖的力量，把包膜拖出一個芽結構 內部病毒結構蛋白粘附與出芽點，產生一個推的力量,機制二,反轉錄病毒出芽釋放,衣殼,囊膜,基因組,膜上的跨膜糖蛋白,包膜病毒在內膜系統(tǒng)上出芽,第五步 病毒釋放,在核膜，內質網(wǎng)膜上， 高爾基體膜上插入病毒糖蛋白，病毒出芽獲得包膜結構， 進入運輸系統(tǒng)（膜泡運輸） 優(yōu)點：避開對宿主細胞胞質膜的糖蛋白修飾，減少免疫系統(tǒng)監(jiān)視 內膜沒有細胞骨架附著，

15、出芽更方便 具有獨特的脂成分,第五步 病毒釋放,裸病毒,SV40 機制三： 病毒進入轉運小泡-transport vesicles ，與膜融合釋放出來,Release of Enveloped Viruses,HSV：Herpesviruses在核內包裝，穿過核膜時的出芽（在核膜上獲得包膜），在內質網(wǎng)上和高爾基體形成運輸泡（A)，還可能是從核膜上獲得包膜又被溶解，經(jīng)過高爾基體時獲得包膜，被運輸泡運出去。,流感病毒釋放時包膜上的神經(jīng)氨酸酶的作用,神經(jīng)氨酸酶（NA 蛋白）具有酶的活性，作為唾液酸糖苷酶，清除病毒顆粒表面糖蛋白上及感染細胞表面的唾液酸，防止病毒粒子的聚集，以及有助于病毒粒子的釋放 N

16、A與HA（血凝素）是流感病毒亞型分型的重要指標,NA 是一種糖苷外切酶 ,可以從糖苷鍵上除去唾液酸殘基,流感病毒釋放時，新病毒顆粒移向細胞表面，仍通過血凝素-唾液酸鍵進行結合。唾液酸神經(jīng)氨酸酶的主要作用是催化裂解存在于唾液酸末端、N-乙?；窠?jīng)氨酸及相鄰糖基間的酮苷連接橋，從而促進病毒在呼吸道的傳播 ,因為該鍵的斷裂使病毒從感染的細胞中釋出，并阻止病毒從宿主細胞釋出后的聚集。 神經(jīng)氨酸酶還可通過裂解呼吸道黏膜中的唾液酸 ,滅活呼吸道黏液的黏液素(能抑制血凝素活性) ,使呼吸道黏液的活性減除 ,阻止病毒滅活 ,有助于病毒顆粒移向靶細胞 ,防止游離的病毒顆粒凝集在一起 ,促進病毒滲入呼吸道上皮細胞

17、及其在呼吸系統(tǒng)的擴散。通過這種方式 ,感染在體內擴散。神經(jīng)氨酸酶對流感病毒致病性也有作用 ,它能改變另一種表面糖蛋白血凝素的糖基部分 ,從而增強一些菌株的毒力。,藥物作用靶標-尋找NA的抑制劑，通過阻斷NA ,可使病毒顆粒聚集在一起 ,黏著于細胞表面 ,不能感染其他細胞。由于 NA 的活性可被特異性的抑制物或抗體所抑制 ,從而使 NA 喪失吸附融合復制裝配和出芽等功能 ,因此根據(jù)這一特點 ,國內外研究出許多抗流感藥物,第六步 病毒成熟,包裝好的病毒顆粒如果沒有感染性，稱為 未成熟的病毒體 若變成有感染力的病毒毒體，則需要蛋白水解處理 蛋白水解過程涉及到病毒蛋白水解酶的作用,病毒粒子成熟 Mat

18、uration,1. 成熟過程常常涉及病毒粒子結構的改變（對前衣殼進行特定位點的切割）或構象的變化. 2. 這種變化可以導致衣殼發(fā)生一些可以檢測到的變化：比如成熟前后，抗原性（antigenicity）或核蛋白與基因組的聚集（condensation）性質會發(fā)生變化； 3. 病毒成熟過程中主要使用病毒編碼的蛋白酶，有時也需要病毒或宿主的其他組分來參與這個過程,第五章 復習要點,1 病毒衣殼包裝需要的步驟有哪些？舉例說明衣殼蛋白自組裝過程需要哪些輔助組分？ 2 病毒釋放的機制有哪幾種？ 3 病毒成熟過程需要什么成分的參與？ 4 描述TMV和球狀衣殼和基因組的包裝過程是怎樣的？ 5 描述單純皰疹病

19、毒如何利用基因組上包裝信號進行基因組的包裝 6 描述HIV的包裝和釋放過程 7 病毒獲得包膜的過程 8 病流感病毒包膜上的神經(jīng)氨酸酶對病毒釋放傳播是至關重要的，為什么？,第五章 結束,The replication of adenovirus,Review based on the contents of Chapter II -chapter IV and literatures you can find Summarize the taxonomy, structure, genome organization , infectious cycles of animal virus lis

20、ted below: SV40 virus, adenovirus, herpes virus , hepadnavirus, poliovirus, human Influenza A virus, HIV , rhabdovirus and poxvirus,Release of Enveloped Viruses,1 Budding at plasma membrane: Release of enveloped virus particles from the plasma membrane is a complex process that comprises induction of membrane curvature by viral components