核心蛋白聚糖對(duì)HuH7細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制

1、DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減核心蛋白聚糖對(duì)HuH7細(xì)胞增殖的影響 及機(jī)制（作者：?jiǎn)挝唬亨]編：）作者：上官建營(yíng) 竇科峰 李霄 胡小軍，張福琴，雍召生， 遆振宇【摘要】 目的：探討核心蛋白聚糖（decorin, DCN對(duì)HuH7細(xì)胞系體 外增殖的影響及機(jī)制。方法：加入不同濃度（0、25、50、75、100、 125、150、200卩g/L）的DCN培養(yǎng)HuH7細(xì)胞系不同時(shí)間（12、24、 48、72 h和2周）,用二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽（MTT）法及克隆實(shí) 驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖速度和活力，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期和凋亡情況。 結(jié)果:DCN濃度增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖速度減慢、活力減 低，G1

2、期細(xì)胞增多，凋亡增加。結(jié)論：DCN可能為一種負(fù)性調(diào)控蛋白， 可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，抑制肝癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。【關(guān)鍵詞】 核心蛋白聚糖；HuH7;細(xì)胞周期；凋亡Abstract AIM: To inv estigate the effects and mecha nismof decorin（DCN） on the proliferationof HuH7 hepatomacarcinoma cell line in vitro. METHODSHepatomacarcinoma cells was cultured with DCN in different concentration (

3、0, 25, 50,75, 100, 125, 150, 200 卩 g/L) for different time(12, 24, 48,72 h and 2 weeks). Cell activities were studied by MTTand clone test. The changes of cell cycle and apoptosis were analyzed by Flow cytometry. RESULTSThe proliferation of HuH7cells could be in hibited by DCNn vitro and the in hibi

4、ti oneffect was thetime and dose depe ndent relati on ship. DCN could block cell cycle at G1 phase. Apoptosis of hepatocarcinoma cells could be efficie ntly in duced by DCN in a time/dosejtidepe ndent manner.CONCLUSIONDCNmaybe a negative regulatory protein inhibiting hepatoma carcinoma cell prolifer

5、ationthrough inhibitingcellcycle and in duc ing apoptosis of cell in vitro.Keywordsdecori n; HuH7; cell cycle; apoptosis核心蛋白聚糖(decorin, DCN)是富含亮氨酸的小分子的蛋白聚糖家 族中的一員，主要由結(jié)締組織產(chǎn)生，是一種多效性分子1。有許多 資料表明DCN是一種抗增殖因子，能夠抑制多種細(xì)胞增殖，極可能 是一種腫瘤抑制物，使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和腫瘤靜止2,這提示DCN有可 能成為新的抗腫瘤藥物。本實(shí)驗(yàn)旨在探討DCN對(duì)人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影 響及其作用機(jī)制，為肝癌的防治提供新的思

6、路。1材料和方法1.1材料 人類(lèi)肝癌細(xì)胞HuH7細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室提供。RPMI 1640 培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco公司，按說(shuō)明以雙蒸水溶解，濾膜過(guò)濾除菌，分 裝，-20 C凍存?zhèn)溆?。新生牛血清為杭州四季青生物工程材料公司產(chǎn) 品，經(jīng)56C 30 min水浴滅活后，-20 C凍存?zhèn)溆谩?6孔、6孔細(xì)胞 培養(yǎng)板為 Corning 擬Costar 公司產(chǎn)品。Recombinant Human Decorin（Catalog Number: 43擬DE）購(gòu)自美國(guó) RD公司，用 PBS稀釋濃 度為 1 000 卩 g/L, -20 C凍存?zhèn)溆谩EPlass100 CO2孵箱為 Thermo 公司產(chǎn)品，CKX4

7、1熒光倒置顯微鏡為日本 Olympus公司產(chǎn)品，流式細(xì) 胞儀為Beckman Coulter公司產(chǎn)品。1.2方法1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HuH7細(xì)胞培養(yǎng)于100 mL/L新生牛血清 RPMI1640培養(yǎng)液中，含105 U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素，培養(yǎng)條 件為37C、50 mL/L CO2、飽和濕度。培養(yǎng)的細(xì)胞均為上皮樣貼壁 生長(zhǎng)，細(xì)胞密度（0.11） x 109/L,每34 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。1.2.2細(xì)胞處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞調(diào)整密度至1X 109/L,接種 于96孔板，100卩L/孑L。接種24 h后換液，分別加入含0、25、50、 75、100、150、200

8、卩g/L DCN的培養(yǎng)液，分別以PBS為空白對(duì) 照、不含DCN培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，每孔設(shè)4個(gè)復(fù)孔，分別于12、24、 48、72 h用MTT法檢測(cè)吸光度（A490值）,并繪制曲線(xiàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 期細(xì)胞接種于6孔板，200個(gè)細(xì)胞/孔。接種24 h后換液，分別加入 含 0、25、50、75、100、125、150 卩 g/L DCN 的培養(yǎng)液，分 別以PBS為空白對(duì)照、 不含DCN培養(yǎng)液為陰性對(duì)照培養(yǎng)2周，當(dāng)培 養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，甲醇固定，吉姆薩染色 后計(jì)克隆數(shù)，計(jì)算克隆率，并繪制曲線(xiàn)。123流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡 收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HUH7 細(xì)胞,配成單細(xì)胞懸液（1 X 10

9、9/L）,與濃度為0、25、50、75、100、 150卩g/L的DCN共同孵育96 h, PBS清洗，標(biāo)本用胰蛋白酶消化成 細(xì)胞懸液，其中一份標(biāo)本用PBS洗滌2次并將細(xì)胞密度調(diào)整為109/L。 首先用微量移液槍移取20 L細(xì)胞懸液，然后細(xì)胞懸液中加入Annexin擬.V并避光靜置15 min后，將PI染料加入并靜置30 min,上 機(jī)檢測(cè)。另一份標(biāo)本加無(wú)水乙醇固定。PBS洗滌乙醇，取細(xì)胞懸液2 mL, 以1 500 r/min離心5 min,棄上清，輕輕搖動(dòng)，加入PI去污染液（含 10 mL/L Trit on X擬100）2 mL,避光染色10 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè),每 份標(biāo)本測(cè)定20

10、000個(gè)細(xì)胞，測(cè)量速率為150200個(gè)細(xì)胞/s。用 MultiCycle for Win dows軟件分析被采集資料。1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)用x 士 s表示，應(yīng)用SPSS15.0軟件包進(jìn) 行統(tǒng)計(jì)分析，不同時(shí)間及濃度DCN對(duì)細(xì)胞增殖情況、細(xì)胞周期及凋 亡率影響的比較采用SNK；q檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)取a =0.05。2結(jié)果2.1 DCN不同濃度及時(shí)間對(duì)HuH7細(xì)胞增殖的影響HuH7細(xì)胞經(jīng) Dcr作用不同時(shí)間，其吸光度在同一時(shí)間點(diǎn)隨作用濃度增加而逐漸降 低，說(shuō)明細(xì)胞增殖隨DCNt度增加而逐漸減弱；同一濃度DCN作用， 隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度增加速度逐漸減慢，說(shuō)明較對(duì)照組細(xì) 胞增殖活力減低（圖1,

11、 P0.052.2 DCN作用濃度對(duì)HuH7細(xì)胞增殖的影響將不同濃度DCN乍用 HuH7細(xì)胞96 h后吸光度（A490值）結(jié)果做統(tǒng)計(jì)分析（表1）。顯示不同 濃度DCNA值與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P0.05或P0.01）, 表明不同濃度DCN對(duì)細(xì)胞增殖的影響不同，且隨濃度增加，抑制效 果逐漸增強(qiáng)。2.3克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果HuH7細(xì)胞以不同濃度DCN培養(yǎng)2周， 出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)克隆，處理后計(jì)數(shù)并計(jì)算克隆率（Clone Rate）, 結(jié)果 顯示，隨著DCN濃度增加，細(xì)胞克隆率呈下降趨勢(shì)，這表明DCN對(duì) HuH7增殖有一定抑制作用（圖2）。表1不同濃度DCN乍用HuH7細(xì)胞 96 h A 值2.4

12、DCN寸HuH7細(xì)胞周期和凋亡率的影響 隨著DCr濃度的增加， HuH7的 G1期細(xì)胞數(shù)明顯增多，S期細(xì)胞數(shù)明顯減少，G2期細(xì)胞數(shù)則 無(wú)明顯變化規(guī)律，同時(shí)凋亡細(xì)胞率逐漸升高（圖3、4）。3討論DCN是在細(xì)胞外基質(zhì)中存在的小分子蛋白聚糖，與腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展密切相關(guān)。Santra等3將DCNCDNA急定轉(zhuǎn)染人乳腺癌 MDA；453 細(xì)胞，這些被成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆表現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)抑制，細(xì)胞克隆在軟瓊脂上不形成集落，在scid小鼠中不形成腫瘤，并且G1期細(xì)胞 增加。此外，Nash等4研究發(fā)現(xiàn)直接加入人DCN能夠抑制卵巢癌細(xì) 胞系SKOV和2774細(xì)胞的增長(zhǎng)，并且與抗腫瘤藥物卡鉑有協(xié)同作用。 Konin

13、ger等5研究發(fā)現(xiàn)直接加入人DCN能夠抑制胰腺癌細(xì)胞系的增 殖，Tralh崔o等 進(jìn)一步報(bào)道腺病毒介導(dǎo)的 DCN cDNA勺表達(dá)能夠 使腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)凋亡并且可以抑制對(duì)側(cè)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且這種抑制還是特異性的，正常組織細(xì)胞卻不發(fā)生凋亡和生長(zhǎng)抑制本研究顯示DCN可抑制體外培養(yǎng)HuH7細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢 測(cè)GO期細(xì)胞顯著增多，G1期細(xì)胞周期阻滯，G0/G1期的腫瘤細(xì)胞比 率越高，表明DCN可以延緩腫瘤細(xì)胞由G1期向S期的過(guò)渡，使S期 和G2期細(xì)胞明顯降低，提示DCN可能影響細(xì)胞周期細(xì)胞，使HuH7細(xì) 胞多數(shù)停滯于DNA合成前期，DNA合成障礙，使腫瘤細(xì)胞的倍增時(shí)間 延長(zhǎng)7。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)

14、DCN乍用后的HuH7細(xì)胞凋亡率顯著地增高， 提示誘導(dǎo)凋亡亦可能是 DCN抑制肝癌細(xì)胞的機(jī)制之一。國(guó)內(nèi)外有關(guān) DCN文獻(xiàn)報(bào)道其有效工作濃度基本上都是在mg/L水平，本實(shí)驗(yàn)將重組人DCN用 PBS稀釋成1 000卩g/L, -20 C凍存?zhèn)溆?。在預(yù)實(shí)驗(yàn)及 實(shí)驗(yàn)時(shí)均得出理想的結(jié)果，而且隨劑量增大及時(shí)間的延長(zhǎng)抑制效果 明顯增加。在肝癌細(xì)胞體外培養(yǎng)小劑量DCN未見(jiàn)到刺激細(xì)胞增殖作用， 這可能早期國(guó)內(nèi)報(bào)道 DCN對(duì)正常肝細(xì)胞及肝星形細(xì)胞有雙重調(diào)節(jié)作 用不同，即0.01 mg/L DCN可刺激正常肝細(xì)胞及肝星形細(xì)胞的增殖； 5、10 mg/L DCN則具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，這可能提示DCN在肝 癌中的作

15、用不同于正常肝細(xì)胞，小劑量DCN對(duì)肝癌細(xì)胞系HuH7即有 明顯抑制效果可能也與其本身生長(zhǎng)特性也有一定關(guān)系。國(guó)外報(bào)道DCN最高濃度用到500 mg/L,且發(fā)現(xiàn)增加到一定劑量后，細(xì)胞抑制效果 不再增加4。本實(shí)驗(yàn)所用小劑量有明顯抑制作用，但由于劑量普遍 偏小，未發(fā)現(xiàn)抑制效應(yīng)平臺(tái)期，DCN對(duì)于肝癌細(xì)胞系進(jìn)一步作用效果 有待于深入研究。目前對(duì)肝癌治療尚沒(méi)有理想的藥物，DCN的發(fā)現(xiàn)為防治肝癌開(kāi)辟 了新的途徑。DCN是機(jī)體本身所有的細(xì)胞外基質(zhì)的成份，從組織中提 取天然的DC有廣泛的來(lái)源和技術(shù)上的可行性，基因克隆技術(shù)也已成 功獲得DCN,使得DCN在肝癌的防治中具有良好的應(yīng)用前景。我們觀 察了不同濃度DCN乍

16、用不同時(shí)間對(duì)人肝癌細(xì)胞株 HuH7細(xì)胞體外生長(zhǎng) 的影響，結(jié)果顯示，DCN能夠抑制HuH7細(xì)胞的體外增殖，抑制G1/S 期轉(zhuǎn)換，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，具有抗腫瘤作用和腫瘤組織的分化 調(diào)節(jié)作用，且這種增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用呈劑量依賴(lài)性和時(shí)間依 賴(lài)性，隨著DCN濃度的增加，作用逐漸呈上升趨勢(shì)。這提示我們?nèi)绻?DCr用于臨床抗肝癌治療時(shí)，必需有足夠用藥計(jì)量和用藥時(shí)間，從而 維持有效濃度，才能更好的發(fā)揮抗腫瘤作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Dodge GR, Diaz A, Sanz擬Rodriguez C, et al.Effects of i nterfero n扌!)；gamma and tumor n ec

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