化學(xué)生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)六(課堂PPT)

1、1,化學(xué)生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)六,指導(dǎo)教師：馬林 化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院,酪氨酸酶抑制及激活作用動(dòng)力學(xué)的分析,2,一、實(shí)驗(yàn)基本原理,酪氨酸酶(Tyraseosinase，Tyrase)又稱兒茶酚氧化酶(Ec.1.14.18.1)屬于多酚氧化酶（漆酶和二酚氧化酶）中的一種。它廣泛存在于紅薯、香蕉、蘋果、蘑菇、馬鈴薯及人體等動(dòng)植物中，也存在于微生物，特別是霉菌之中。,在動(dòng)植物體內(nèi)，酪氨酸酶對(duì)酪氨酸和其它酚類化合物的代謝以及黑色素的合成起重要的催化作用。酪氨酸酶可以催化兩類不同的反應(yīng)：?jiǎn)畏恿u基化形成鄰二酚和鄰苯二酚氧化成鄰醌，這兩類反應(yīng)都必須有氧分子的直接參與。,3,黑色素形成機(jī)制,對(duì)黑色素細(xì)胞內(nèi)的黑色素形成機(jī)

2、理的研究表明，黑色素的形成主要是由黑色素細(xì)胞內(nèi)的四種酶：酪氨酸酶多巴異構(gòu)酶、過氧化物酶、等酶單獨(dú)或協(xié)同作用的結(jié)果。 大量的研究表明，黑素細(xì)胞內(nèi)黑色素的生物合成是一個(gè)由酪氨酸酶催化體內(nèi)酪氨酸羥化而啟動(dòng)的一系列生化反應(yīng)：體內(nèi)酪氨酸在酪氨酸酶催化下生成 3,4-二羥基苯丙氨酸即多巴，多巴進(jìn)一步氧化生成多巴醌，多巴醌經(jīng)多聚化反應(yīng)與氧化反應(yīng)生成多巴色素，在多巴色素異構(gòu)酶 作用下, 多巴色素羥化為5,6-二羥基吲哚羧酸, 脫羧成 5,6-二羥基吲哚, 再在酪氨酸酶催化下氧化成 5,6-吲哚醌, 最后與其它中間產(chǎn)物結(jié)合形成真黑色素。脫黑色素的形成其前部分-由酪氨酸到多巴醌與真黑色素一致, 但在以后的反應(yīng)中有

3、半胱氨酸參加, 產(chǎn)生Cys-多巴和 Cys-多巴醌, 通過關(guān)環(huán)脫羧, 最后形成脫黑色素。,4,5,酪氨酸酶是皮膚黑素生物合成的關(guān)鍵酶，它不僅決定黑素合成的速率,還是黑素細(xì)胞分化成熟的特征性標(biāo)志，因此它給人體皮膚美白帶來困難。酪氨酸酶的活性與黑素合成量相關(guān)，控制其活力即可控制黑素生成量。因此，研究酪氨酸酶的抑制，對(duì)防止水果、蔬菜的褐變，化妝品中的皮膚增白，以及因酪氨酸酶催化產(chǎn)生黑色素引起的疾?。S褐斑、黑色素瘤等色素沉著性皮膚病等），具有非常重要的治療意義。 酪氨酸酶的底物結(jié)合部位，由于銅原子與氧的結(jié)合部位關(guān)系密切，故凡能與銅原子形成復(fù)合物的化學(xué)試劑均有可能是酶的有效抑制劑。苯甲酸、疊氮化物、氰

4、化物、苯硫脲和半胱氨酸等對(duì)O2與酶結(jié)合有競(jìng)爭(zhēng)作用；非酚類芳香族化合物對(duì)底物與酶結(jié)合有競(jìng)爭(zhēng)作用。近些年來，人們從植物中分離出多種酪氨酸酶抑制劑用于化妝品工業(yè)，如熊果苷、曲酸、根皮素等。,6,二、實(shí)驗(yàn)過程,酶抑制劑的高通量篩選可以通過酶標(biāo)儀進(jìn)行，但系統(tǒng)地、準(zhǔn)確地研究抑制劑的IC50以及抑制作用的動(dòng)力學(xué)必須通過精密儀器進(jìn)行檢測(cè)。 本實(shí)驗(yàn)將利用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)試幾種化合物對(duì)馬鈴薯多酚氧化酶（酪氨酸酶）的抑制和激活作用的動(dòng)力學(xué)。,實(shí)驗(yàn)材料： 馬鈴薯酪氨酸酶粗酶（前面實(shí)驗(yàn)提?。?抑制劑：硫酸亞鐵、六羥基二苯甲酮、2-萘酚 激活劑：1-萘酚、硫酸銅、二羥基二苯甲酮,7,實(shí)驗(yàn)儀器和條件,北京普析通用UV

5、-1901 紫外可見分光光度計(jì),實(shí)驗(yàn)條件： 緩沖液：0.1mol/LpH 6.8磷酸鹽緩沖液。 底物：25mol/L 鄰苯二酚 化合物溶液的配制： 1-萘酚和二羥基二苯甲酮用乙醇配成50mol/L。 2-萘酚和六羥基二苯甲酮用乙醇配成10mol/L。 硫酸亞鐵和硫酸銅用蒸餾水配成50mol/L。,8,實(shí)驗(yàn)安排,1，酶催化條件探索 由于每次實(shí)驗(yàn)得到的粗酶液酶催化活性不同，所以在測(cè)試過程中，需要探索實(shí)驗(yàn)中所使用的酶的劑量。 本實(shí)驗(yàn)要求測(cè)試的酶催化活性-每分鐘OD值變化在0.1-0.13范圍內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)采用調(diào)節(jié)酶液用量的方式。,2，測(cè)試體系 在總計(jì)1000L的測(cè)試體系中，加入920或930L 0.1m

6、ol/LpH 6.8磷酸鹽緩沖液，10L樣品溶液（以10 L緩沖液或乙醇做對(duì)照），10-20L粗酶液，室溫放置20分鐘，立即加入50L 25mol/L 鄰苯二酚溶液， 390nm進(jìn)行時(shí)間掃描，記錄1分鐘的OD值。,9,實(shí)驗(yàn)安排,3，抑制劑IC50的測(cè)試 改變樣品溶液的劑量，分別測(cè)試酶催化活性?？梢酝ㄟ^稀釋的方式改變樣品的濃度。 以沒有加入樣品的酶催化活性O(shè)D/min值為100%，用抑制百分?jǐn)?shù)(指被抑制而失去活力的百分?jǐn)?shù))表示不同濃度樣品對(duì)酶的抑制活性，作圖求出抑制50%時(shí)樣品的濃度。,10,實(shí)驗(yàn)安排,4，抑制劑動(dòng)力學(xué)的測(cè)試 適當(dāng)選擇2個(gè)不同的樣品濃度，以及沒加樣品三個(gè)系列，改變底物溶液的劑量，

7、分別測(cè)試酶催化活性。 以底物濃度（mol/L）倒數(shù)1/S對(duì)酶催化活性O(shè)D/min值的倒數(shù)1/V作圖，根據(jù)三條線的交點(diǎn)判斷抑制劑的類型。,11,實(shí)驗(yàn)安排,5，激活作用的測(cè)試 改變樣品溶液的劑量，分別測(cè)試酶催化活性?？梢酝ㄟ^稀釋的方式改變樣品的濃度。 以沒有加入樣品的酶催化活性O(shè)D/min值為100%，用激活百分?jǐn)?shù)(指被激活而增加活力的百分?jǐn)?shù))表示不同濃度樣品對(duì)酶的激活活性，作圖求出最大激活活性時(shí)樣品的濃度。,12,實(shí)驗(yàn)安排,6，激活劑動(dòng)力學(xué)的測(cè)試 適當(dāng)選擇2個(gè)不同的樣品濃度，以及沒加樣品三個(gè)系列，改變底物溶液的劑量，分別測(cè)試酶催化活性。 以底物濃度（mol/L）倒數(shù)1/S對(duì)酶催化活性O(shè)D/min值的倒數(shù)1/V作圖，根據(jù)三條線的交點(diǎn)判斷抑制劑的類型。,13,三、實(shí)驗(yàn)報(bào)告,兩名學(xué)生只對(duì)自己所做的實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果進(jìn)行分析，按照研究論文形式寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。,實(shí)驗(yàn)中盡可能了解其他同學(xué)的實(shí)驗(yàn)過程