細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及課件

1、細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,1,細胞培養(yǎng)基本技術,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,2,內 容,細胞培養(yǎng)的理論背景 設備與器材準備、溶液配制 無菌技術 原代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng) 細胞計數(shù)與生長曲線 凍存、復蘇與運送 常見問題及對策,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,3,細胞培養(yǎng)的概念,20世紀初才創(chuàng)立的一種研究動物細胞行為的方法。 細胞培養(yǎng)是指從體內組織取出細胞模擬體內出現(xiàn)環(huán)境，在無菌、適當溫度及酸堿度和一定營養(yǎng)條件下，使其生長繁殖，并維持其結構和功能的一種培養(yǎng)技術。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,4,細胞培養(yǎng)的應用,1. 藥物研究與開發(fā) (1) 新藥篩選 (2) 疫苗研究與開發(fā) (3) 基因工程藥物研究

2、與開發(fā) (4) 細胞工程藥物研究與開發(fā) 2. 基礎研究 (1) 藥物作用機理 (2) 基因功能 (3) 疾病發(fā)生機理 3. 生物制藥 (1) 疫苗生產(chǎn) (2) 基因工程藥物生產(chǎn) (3) 診斷用和藥用單克隆抗體生產(chǎn) (4) 細胞工程藥物生產(chǎn),細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,5,細胞培養(yǎng)的應用,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,6,細胞培養(yǎng)的優(yōu)點,1.活細胞：能長時間、直接觀察、研究活細胞的形態(tài)、結構、生命活動2.可控制：可選擇特定的研究細胞種類、性質、階段 可控制調節(jié)條件：物理、化學、生物等因素 可采用各種研究技術、記錄方法： 倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細胞術、激光共焦顯微鏡、免疫組

3、織化學、原位雜交、同位素標記等。 3. 樣品均一性：來源于同一組織同一種細胞。 4.經(jīng)濟、規(guī)模和機械化,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,7,細胞培養(yǎng)的局限性,人工模擬體內環(huán)境的技術已經(jīng)很高, 但人工所模擬的條件與體內實際情況仍不完全相同。缺乏體內的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調節(jié)和細胞相互間的影響。 當細胞被置于體外培養(yǎng)后, 生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中，必然發(fā)生變化。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,8,概念：原代與傳代,原代培養(yǎng) 取自體內新鮮組織并置于體外條件下生長的細胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。 傳代： 細胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,9,

4、細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,10,培養(yǎng)細胞的生長方式,貼壁生長： 必須貼附于支持物表面才能生長。見于各種實體組織來源細胞、上皮細胞。 懸浮生長： 于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細胞。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,11,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,12,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,13,貼壁細胞,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,14,貼壁細胞,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,15,貼壁細胞,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,16,貼壁細胞,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,17,懸浮細胞,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,18,細胞培養(yǎng)的環(huán)境,1、無污染環(huán)境：化學污染

5、、微生物污染 2、溫度環(huán)境：37。偏離這一溫度范圍，細胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。培養(yǎng)細胞對低溫的耐受力較對高溫強， 3、氣體環(huán)境： 95%空氣加5%二氧化碳 4、酸度環(huán)境：大多數(shù)細胞的適宜PH 為7.2-7.4，細胞耐酸性比耐堿性大一些。 5、 細胞培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,19,細胞培養(yǎng)成功的關鍵,1. 實驗材料的清洗、滅菌。 2. 無菌操作 3. 勤勞,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,20,內 容,細胞培養(yǎng)的理論背景 設備與器材準備、溶液配制 無菌技術 原代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng) 細胞計數(shù)與生長曲線 凍存、復蘇與運送 常見問題及對策,細胞培養(yǎng)基本技術全面

6、知識普及,21,實驗設備與器材,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,22,CO2培養(yǎng)箱 超凈工作臺,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,23,倒置顯微鏡,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,24,濾 器,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,25,電動移液器 超純水儀,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,26,液氮罐,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,27,培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,28,實驗器材的清洗和滅菌,清洗的重要性 1. 除化學污染：鹽、油污、蛋白質、重金屬等 2. 使培養(yǎng)瓶內表面帶負電荷，供細胞附著。 不要讓污染了的器皿變干！ 滅菌的重要性 除去微生物污染,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,29,酸液配

7、方,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,30,新的玻璃器皿的清洗滅菌,自來水刷洗，除去灰塵。 烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入5稀鹽酸中12小時以除去臟物、鉛、砷等物。 刷洗、烘干：泡鹽酸12小時后立即用自來水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來水沖干凈后用烤箱烘干。 泡酸、清洗：用酸液浸泡12小時，然后從酸缸內撈出器皿用自來水沖洗10次，最后蒸餾水沖洗3-5次。 烘干、包裝：移液管和滴管的尾端 要塞入棉花。 高壓滅菌 烘干備用,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,31,使用后的玻璃器皿的清洗滅菌,刷洗、烘干：使用過的玻璃器皿立即用清水刷洗干凈 自來水浸泡過夜，泡酸前用自來水沖洗干凈，烘干。 泡酸、清洗：烘干后

8、泡入酸液，12小時后從酸缸內撈出器皿立即用自來水沖洗10次（避免蛋白質干涸后粘附于玻璃上難以清洗），過蒸餾水3次。 烘干、包裝 高壓滅菌 烘干備用,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,32,金屬器皿,金屬器皿不能泡酸，洗消時可先用洗滌劑刷洗，后用自來水沖干凈，然后用75酒精擦拭，再用自來水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內包裝好，高壓滅菌，再烘干備用。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,33,橡膠和塑料,刷洗、烘干：使用后立即用清水刷洗干凈 自來水浸泡過夜，泡酸前用自來水沖洗干凈烘干。 泡入5鹽酸過夜。 自來水沖洗10次，過蒸餾水3次 烘干 高壓蒸汽滅菌 烘干備用 滴管膠頭可用75酒精

9、浸泡5分鐘，紫外線照射消毒。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,34,水、溶液、培養(yǎng)基,水：超純水。 至少為三蒸水或去離子水。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,35,需配制的溶液,平衡鹽溶液（PBS或D-Hanks等） 胰酶 培養(yǎng)基,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,36,溶液除菌方式,高壓蒸汽滅菌：平衡鹽溶液 過濾除菌：不能高壓的溶液，如培養(yǎng)基、胰酶等,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,37,培養(yǎng)基,培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。 天然培養(yǎng)基： 天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。 優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好 缺點：來源受限。 成分復雜

10、，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結果的分析。 易發(fā)生支原體污染,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,38,合成培養(yǎng)基,合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞生存所需物質的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設計出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質。 優(yōu)點：標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。 成本低 缺點： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,39,人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及

11、,40,血清中含有： 多種蛋白質（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等） 多種金屬離子 ； 激素； 促貼附物質，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。 各種生長因子 轉移蛋白 不明成分,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,41,血清質量好壞是實驗成敗的關鍵。 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質量最好。 優(yōu)質血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。 血清的滅活（消除補體活性）：56 ，30 分鐘 血清的除菌：購買高質量的無菌血清。不要自己試圖對血清除菌。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,42,常用培養(yǎng)基配制要領,購買合成培養(yǎng)基干粉。 仔細閱讀說明書，確定配制

12、方法，是否需要添加其他成分，如NaHCO3、HEPES、谷氨酸鹽等。 確保所有的成分完全溶解 確保水足夠純（包括調節(jié)pH值用液）。 過濾除菌后取10ml置于干凈的培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱內培養(yǎng)三天，如培養(yǎng)基無改變，方可繼續(xù)使用。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,43,培養(yǎng)基配制方法（Gibico DMEM為例）,拆開包裝，將包裝中粉末倒入一個1L燒杯中。 用水將包裝內壁的粉末沖洗入燒杯中。 加入3.7g 碳酸氫鈉。 加水至900ml。 調pH值至7.4 定容至一升 過濾除菌 過濾最后取10ml置于干凈的培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱內培養(yǎng)三天，如培養(yǎng)基無改變，則可繼續(xù)使用。 臨用前加10牛血清。,細胞培養(yǎng)基本

13、技術全面知識普及,44,培養(yǎng)基過濾除菌裝置,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,45,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,46,培養(yǎng)基過濾裝置使用方法,用自來水徹底清洗裝置。 用蒸餾水漂洗兩次。 烘干（塑料濾器烘干溫度不可超過60度） 正確安裝好濾膜和整個裝置，包裝。 高壓滅菌。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,47,其他試劑,胰蛋白酶液： 0.25胰蛋白酶0.02EDTA，用平衡鹽溶液溶解，過濾除菌。 平衡鹽：高壓滅菌。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,48,內 容,細胞培養(yǎng)的理論背景 設備與器材準備、溶液配制 無菌技術 原代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng) 細胞計數(shù)與生長曲線 凍存、復蘇與運送 常見問題及對策,細胞培養(yǎng)基本

14、技術全面知識普及,49,無 菌 技 術,微生物污染一直是細胞培養(yǎng)的主要問題。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,50,無菌技術總原則,任何時候都要毫不動搖的在每一個操作環(huán)節(jié)都堅持高標準的無菌技術！ 預防為主！ 不要讓無菌程度低的物品沾染無菌程度高的物品！,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,51,無菌程度梯度示意圖,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,52,培養(yǎng)室的滅菌,定期打掃培養(yǎng)室室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3來蘇爾或者新潔爾滅或者0.5過氧乙酸擦拭。 CO2培養(yǎng)箱滅菌：先用3新潔爾滅擦拭，然后用75酒精擦拭或者0.5過氧乙酸，再用紫外燈照射。保持培養(yǎng)箱內空氣干凈，定期消

15、毒。定期更換蒸餾水。 實驗前滅菌：打開紫外燈20-30分鐘 實驗后滅菌：用75酒精（3新潔爾滅）擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺，打開紫外線照射20-30min,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,53,實驗人員的無菌準備：,肥皂洗手。 穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、穿好拖鞋 戴乳膠手套，75酒精擦手。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,54,工作面無菌原則,保持工作面干凈。 使用前用75乙醇充分擦洗工作面，打開紫外燈照射30分鐘。 盡量少放物品：帶入必須的，移走不必要的。 工作臺面內物品整齊有序。 實驗完畢后移走所有物品，并徹底擦洗工作面，開紫外燈照射30分鐘。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,55

16、,正確的工作臺面布局,物品在工作臺中部潔凈區(qū)圍成新月狀，酒精燈位于中央。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,56,保持臺面整齊,Good！,Bad！,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,57,無菌操作,凡是帶入超凈工作臺內的酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面 靠近酒精燈火焰操作。 玻璃器具（滴管、移液管等）使用前必須過火滅菌 打開和蓋上蓋子前后灼燒瓶頸和蓋口附近。 無菌級別高的物品不能觸碰無菌級別低的物品。手不能從敞開的瓶口上方經(jīng)過 各種操作要靠近酒精燈，動作要輕、準確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。 吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管，防止交叉污染。 手握試管、滴管

17、、移液管時盡量遠離工作端。 盡可能移走不需要的物品，在操作中經(jīng)常用酒精擦拭臺面。 盡可能減少開蓋時間。 隨時擦去任何溢出物。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,58,無菌操作,任何時候都不要把液體從一個無菌容器倒入另一個無菌容器。 傾倒廢液時防止濺起和瓶口回流。 在視野范圍內工作。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,59,無菌技術,每人準備一套實驗材料（器皿、溶液等），不可混用。 無菌的思想貫穿到細胞培養(yǎng)的任何操作步驟。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,60,內 容,細胞培養(yǎng)的理論背景 設備與器材準備、溶液配制 無菌技術 原代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng) 細胞計數(shù)與生長曲線 凍存、復蘇與運送 常見問題及對策,細胞培養(yǎng)

18、基本技術全面知識普及,61,原代培養(yǎng),細胞分離之后至第一次傳代之前的細胞培養(yǎng)階段。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,62,原代培養(yǎng)策略,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,63,原代培養(yǎng)分離小鼠胚胎,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,64,原代培養(yǎng)分離雞胚,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,65,原代培養(yǎng)酶解組織,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,66,內 容,細胞培養(yǎng)的理論背景 設備與器材準備、溶液配制 無菌技術 原代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng) 細胞計數(shù)與生長曲線 凍存、復蘇與運送 常見問題及對策,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,67,概念“代”,細胞分裂一次？ 錯！ 培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內，

19、再進行培養(yǎng)。這個過程就稱為傳代（passage）或者再培養(yǎng)（subculture）。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,68,傳代培養(yǎng)的要訣（一）,該出手時就出手！ 該換液時就要換液，該傳代時就要傳代！ 否則，細胞就不是那個細胞 細胞會衰退、分化、生長緩慢，多數(shù)情況下很難扭轉和補救。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,69,傳代培養(yǎng)的要訣（二）,勤觀察 每天肉眼觀察培養(yǎng)基顏色是否異常，有無混濁 觀察培養(yǎng)基顏色變化速度是否異常：變化過慢意味著細胞生長過于緩慢；變化過快而細胞密度并不大，表明有污染的可能性。 鏡下觀察細胞形態(tài)、生長速度。 觀察培養(yǎng)箱水盤中的水是否干凈。 觀察CO2壓力表。 觀察液氮罐內液氮

20、體積,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,70,傳代培養(yǎng)的要訣（三）,嚴格無菌操作 輕柔：避免機械力損傷細胞，重懸細胞時盡量用50ml離心管，通過晃動離心管分散細胞，盡量避免過力吹打。離心力不可超過300g（普通臺式離心機水平轉子1000rpm）。 快速：防止因過分小心導致操作時間過長，增加污染概率。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,71,每代貼附生長細胞的生長過程,游離期 貼壁期 潛伏期 對數(shù)生長期 平臺期,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,72,每代貼附生長細胞的生長過程,游離期：細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮 狀態(tài)也稱懸浮期。此時細胞質回縮，胞體呈圓球形。10分鐘一4小時 貼壁期：血清中有促使細胞貼壁的

21、冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質（化學合成的功能基團） 潛伏期：此時細胞有生長話動，而無細胞分裂。細胞株潛伏期一般為624小時。 對數(shù)生長期：細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。 停止期（平臺期）細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂。 機制：接觸抑制、密度抑制。盡量避免細胞進入平臺期。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,73,何時換液？,H降低。培養(yǎng)基顏色由紅變橙要警惕，變成黃色之前一定要換液。pH降至6.5時，細胞停止生長；降至6.0，細胞失去活性。無

22、法挽救。 發(fā)現(xiàn)細胞出現(xiàn)形態(tài)衰退時須勤換液 若培養(yǎng)物密度過低或者生長緩慢，則更換一半培養(yǎng)基。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,74,貼壁細胞換液的操作,吸出或倒出舊培養(yǎng)基。 加入同體積新培養(yǎng)基。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,75,懸浮細胞換液操作,將培養(yǎng)液移入離心管中 1000rpm5min 離心 棄上清 加入新培養(yǎng)基重懸細胞。 移入培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,76,何時傳代？,在對數(shù)生長末期傳代 不可在潛伏期傳代,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,77,貼壁細胞何時傳代？,細胞密度，90匯合度。若繼續(xù)放置超過24h，細胞將脫離細胞周期，再接種需要很長時間才能恢復。 須頻繁更換

23、培養(yǎng)基時。 理想的傳代頻率：1:21:4傳代，接種密度104105/ml， 每7天傳代一次。 常規(guī)傳代最好依據(jù)嚴格的時間表進行。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,78,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,79,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,80,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,81,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,82,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,83,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,84,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,85,貼壁生長細胞傳代方法（一）,吸盡培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液。 用PBS（或Hanks）洗滌細胞兩次，吸光緩沖液。 加入0.25的胰蛋白酶液（0.1ml/cm2）到培養(yǎng)瓶細胞面對側。 翻轉培養(yǎng)瓶

24、，使胰酶完全覆蓋細胞層，靜置2-10 min（室溫或37度，顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測，至細胞變圓隆起）。 加入含血清培養(yǎng)基以終止消化反應。 用吸管吸取瓶內培養(yǎng)基，反復吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液。 收集細胞懸液于離心管內，1000rpm5min離心，棄上清。 加入培養(yǎng)基重懸細胞。 吸取適量細胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內。 加適量新鮮培養(yǎng)基于接種了細胞懸液的新培養(yǎng)瓶內。 將新培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,86,貼壁生長細胞傳代方法（一）,國內廣泛使用的方法。 缺點： 1. 消化時，瓶內液體較多，液體振蕩的機械力會使細胞成片脫落，難以形成單細胞懸液。 2. 培養(yǎng)基消耗較多。 3. 耗

25、時長。 4. 須將細胞液移入離心管操作，增大污染的概率。 5. 兩次吹打，對細胞機械損傷較大。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,87,貼壁生長細胞傳代方法（二）,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,88,傳代步驟,1. 細胞生長至高密度時，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中，一般稀釋比例為1:3 至1:6，依細胞種類而異。 2. 材料： 2.1. PBS, 2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)： 以10 ml 分裝于15 ml 無菌離心管中，保存于20，使用前放在37 水槽回溫 2.3. 新鮮培

26、養(yǎng)基 2.4. 無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶 3. 步驟： 3.1. 吸掉舊培養(yǎng)液。 3.2. 用D-PBS 洗滌細胞一至二次。 3.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37 作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA 溶液。(若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA 作用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin 作用，離心后再吸掉上清液。) 3.4. 輕拍培養(yǎng)瓶使細胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細胞團塊，混和均勻后，依稀釋比例轉移至新的培養(yǎng)

27、瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,89,傳代操作要點,消化溫度：室溫或37 均可。 消化時間，不可太長（不超過10min），不可太短（須形成單細胞懸液）。 防止細胞成片滑落。4消化，延長消化時間較容易獲得單細胞懸液。 輕柔吹打，防止機械損傷。 盡量避免刮傷培養(yǎng)瓶細胞貼附面（尤其是塑料培養(yǎng)瓶），否則影響觀察，且細胞貼壁不均勻。 按時換液和傳代，不可拖延。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,90,懸浮細胞傳代,細胞密度：超過1106/ml，需要頻繁更換培養(yǎng)基時。 離心法傳代：離心（1000rpm5min）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后混勻傳代。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,91,

28、細胞傳代，什么最難？,做一件好事不難，難的是做一輩子好事。 傳一兩代細胞不難，難的是持續(xù)穩(wěn)定的傳十幾代、幾十代細胞，難的是持續(xù)穩(wěn)定的傳幾個月、幾年細胞。 材料準備、溶液配制、無菌操作、培養(yǎng)條件、傳代時機、傳代頻率、消化程度、吹打力度、接種密度 均要正確而穩(wěn)定。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,92,建 議,正式開始實驗前，練習細胞傳代培養(yǎng) 至少2個月。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,93,內 容,細胞培養(yǎng)的理論背景 設備與器材準備、溶液配制 無菌技術 原代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng) 細胞計數(shù)與生長曲線 凍存、復蘇與運送 常見問題及對策,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,94,電子細胞計數(shù)器,細胞培養(yǎng)基本技術全面

29、知識普及,95,細胞計數(shù)板,深度1mm，每個大方格是0.1mm3,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,96,細胞計數(shù)操作,制備單細胞懸液，吹打均勻后，轉移一小部分樣本（500ul）至1.5mlEP管中，加入等體積0.4臺盼藍染液。 75酒精清洗計數(shù)板表面，注意不要劃傷計數(shù)表面。 將已染色待測細胞懸液吹打均勻，然后用移液器吸取20ul細胞懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，液體剛好流到計數(shù)板凹槽邊緣。注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。 將計數(shù)板平放在顯微鏡載物臺上計數(shù)。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,97,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,98,統(tǒng)計角上四個大格 的活細胞數(shù)。 對于

30、壓線細胞的處理： 數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右 細胞團按照一個細胞計。 結果計算： （細胞懸液的細胞數(shù)）/ml （ 四個大格子細胞數(shù)之和/4) 1042,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,99,細胞計數(shù)的注意事項,制備單細胞懸液。不可有較多成團細胞。 取樣均勻。 多次取樣計數(shù)取平均值。 細胞密度：每mm2細胞數(shù)100，一般100300。若須精確定量，則應在5001000個。如細胞濃度不足，則離心后重懸于更小體積培養(yǎng)基中再重新計數(shù)。 計算時注意稀釋倍數(shù)。 避免樣品在槍頭中停留時間過長。 將細胞注入計數(shù)池中時，注入的量不可過多，不可過少，不可產(chǎn)生氣泡。 臺盼藍染色時間不可超過30分鐘。,細胞培養(yǎng)基本技術全面

31、知識普及,100,生長曲線的繪制,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,101,生長曲線的繪制方法（略）,取樣均勻。 多次測量取平均值。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,102,生長曲線的分析,重要參數(shù) 1. 潛伏期時間 2. 倍增時間 3. 平臺期密度,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,103,生長曲線的分析,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,104,生長曲線的分析,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,105,內 容,細胞培養(yǎng)的理論背景 設備與器材準備、溶液配制 無菌技術 原代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng) 細胞計數(shù)與生長曲線 凍存、復蘇與運送 常見問題及對策,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,106,細胞凍存,細胞低溫冷凍貯存是細胞

32、室的常規(guī)工作。細胞凍存與細胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費，減少污染，減少細胞生物學特性變化。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,107,細胞凍存和復蘇過程中，對細胞最大傷害的是細胞內水形成的冰晶。所以最重要的就是要減少冰晶的形成。 1. 慢凍快融 2. 加入細胞保護劑（DMSO、甘油等）,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,108,凍存和復蘇的原則：慢凍快融,當細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結晶就大，大結晶會造成細胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大

33、冰晶，即冰晶的重結晶。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,109,細胞保護劑DMSO,常用的低溫保護劑是二甲基亞砜（DMSO），它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。 有毒！強滲透性?？梢詽B入乳膠手套。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,110,細胞保護劑DMSO,使用濃度：510，一般用10。 復蘇時需1:20稀釋，從10稀釋到0.5。 如果進出細胞速度過快，會對細胞產(chǎn)生滲透性損傷。所以凍存和復蘇時要盡量降低細胞內外DMSO的濃度差。 DMSO與細胞混合后室溫下不能

34、放置超過30分鐘 溶于水時放熱，對細胞損害大。不能將純DMSO直接加入細胞懸液。 少數(shù)細胞系對DMSO敏感，凍存時改用甘油。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,111,滿足凍存標準的細胞,形態(tài)學健康 生長良好 處于對數(shù)生長晚期 無污染。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,112,凍存液體條件,細胞濃度至少1106/ml，最好1107/ml。 溶液成分：40血清10DMSO50合成培養(yǎng)基。 血清含量越高，對細胞保護越好。含量最高可提高到90。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,113,細胞凍存懸液的制備（一）,預先配制凍存液： 含10%血清培養(yǎng)基10% DMSO 取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存

35、液, 用吸管吹打制成細胞懸液（1106 1 107/ml) 1ml分裝于凍存管中，密封后標記。 按照冷凍程序凍存。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,114,細胞凍存懸液的制備（二）,預先配制2凍存液：含80%血清培養(yǎng)基20% DMSO 制備單細胞懸液，細胞密度2106 2 107/ml 將細胞懸液預2凍存液按1:1稀釋（直接稀釋即可。最佳方法：用槍吸取2凍存液緩慢滴加入細胞懸液中，邊加邊搖動離心管）。 1ml分裝于凍存管中，密封后標記。 按照冷凍程序凍存。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,115,細胞凍存懸液的制備（錯誤方法）,制備單細胞懸液 將1/10體積純DMSO加入細胞懸液中，混勻。 1ml

36、分裝入凍存管，凍存。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,116,慢凍程序,平均冷度速率：1/min 最大冷度速率1.9 /min,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,117,冷凍方法（一）,將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降12 cm的速度，在40分鐘內降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,118,冷凍方法（二）,先將凍存管放入4冰箱，約30min 接著置于-20冰箱，約30-60min 置于-80 超低溫冰箱中放置過夜 置于液氮罐中長期保存 20 放置時間不可過長，否則細胞存活率低。可略去這一步，

37、4 30min后直接放入-80 超低溫冰箱,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,119,冷凍方法（三）,將凍存管捆綁在一起，外層裹以厚層棉花，置于80 超低溫冰箱中放置過夜。 置于液氮罐中長期保存,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,120,冷凍方法（四）,將凍存管放于程序降溫盒中。 將程序降溫盒置于80 超低溫冰箱中放置過夜。 置于液氮罐中長期保存。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,121,冷凍方法（五）,程控冷凍柜,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,122,細胞凍存的注意事項,經(jīng)常檢查液氮灌中液氮的量。 從-80度冰箱轉移到液氮灌中要非常迅速，如溫度超過-50度會顯著影響細胞活性。 做好標記和記錄非常重要！

38、,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,123,凍存細胞的管理,1. 新到細胞為第一代，傳第二代時盡量多傳幾瓶、多凍幾管作為種子儲備（Seeding stock），留一瓶繼續(xù)傳代和使用。 2.傳代和使用中也可以凍存一些低次代的細胞作為使用者儲備（User stock）。 3. 傳代次數(shù)較多之后細胞可能已經(jīng)發(fā)生變化。盡量少用種子儲備。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及,124,細胞的復蘇方法,從液氮中取出冷凍管，迅速放入3738 水浴中，使其融化（1分鐘左右），水面不可沒過蓋子，防止水污染細胞。注意，凍存管可能爆炸！ 培養(yǎng)液稀釋至原體積的20倍。滴加，10ml/2分鐘，先慢后快，邊加邊搖晃培養(yǎng)瓶。防止DMSO滲透性損傷。,細胞培養(yǎng)基本技術全面知識普及