實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究

1、 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究 來源：中國論文下載中心10-12-15 16:23:00 作者：袁繼紅 加 |g|g|gl| 摘要 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在普通PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上 發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)， 已廣泛應(yīng)用于不同研究領(lǐng)域。論述了熒光定量PCR技術(shù)的基本原理、主要類型和定量實(shí)驗(yàn) 方法，探討了實(shí)驗(yàn)條件的控制、影響因素和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方法。 關(guān)鍵詞 熒光定量PCR技術(shù);原理;主要類型；定量方法；優(yōu)化 Abstract Real-time fluoresce nt qua ntitative PCR is a new ki nd of n ucleic acid qua ntitat

2、ive tech niq ue,which deve lops in the PCR qualitative tech nique base. It has bee n widely used in differe nt research fields. In the pap er,the exp erime nt principl es,the main types and qua ntitative methods of this tech no logy were described. The con trol of exp erime ntal con diti on s,affect

3、 ing factors and op timizati on of exp erime ntal results were discussed. Key words real-time fluoresce nt qua ntitative PCR;principl e;ma in typ es;qua ntitative method; op timiz ing 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn) 了 PCR從定性到定量的飛躍，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性強(qiáng)、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自 動(dòng)化程度高、無污染性、具實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)

4、1。目前,該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于分子生物 學(xué)、醫(yī)學(xué)等學(xué)科和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，特別是在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因作物的定性檢測、品系鑒定、轉(zhuǎn) 基因成分含量的檢測中發(fā)揮著重要作用2。 1熒光定量PCR技術(shù)的原理 熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè) PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法3。由于常規(guī)PCR無法對擴(kuò)增 反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測，需借助凝膠電泳等手段對擴(kuò)增終產(chǎn)物進(jìn)行定性和半定量分析，不僅費(fèi)時(shí)、 費(fèi)事、易污染，且無法對起始模板準(zhǔn)確定量。熒光定量PCR技術(shù)是在反應(yīng)體系中加入熒光基 團(tuán)，熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)隨著反應(yīng)進(jìn)程而變化，每經(jīng)過一個(gè)PCR循環(huán)反應(yīng)，定量

5、PCR儀收 集1個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，通過熒光強(qiáng)度變化檢測產(chǎn)物量的變化，從而得到1條熒光擴(kuò)增曲線，熒光 擴(kuò)增曲線一般由基線、指數(shù)擴(kuò)增期和平臺(tái)期組成4。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn) 物熒光信號(hào)的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性對應(yīng)關(guān)系，才可以在這個(gè)階段進(jìn)行定量分 析。為了便于對所檢測樣本進(jìn)行比較，在熒光定量PCR反應(yīng)的指數(shù)期，需要設(shè)定1個(gè)熒光信 號(hào)的閾值(threshold)。熒光閾值是熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，熒光閾值的缺省設(shè)置是 315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，用它可以定義樣本的循環(huán)閾值(Cycle Threshold,Ct)。Ct值是PCR擴(kuò)增過程中，反應(yīng)管的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)

6、定閾值時(shí)的循環(huán)次數(shù)?？?見,Ct值取決于閾值。經(jīng)數(shù)學(xué)證明5,每個(gè)模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)與Ct值存在線性關(guān)系。起 始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要獲得未知樣品 的Ct值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上 計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù) 2熒光疋量 PCR技術(shù)的主要類型 ,即熒光染料和熒光探針。熒光染料 熒光探針包括TaqMan、分子信標(biāo)、 熒光定量 PCR所使用的熒光化學(xué)材料可分為兩大類 以SYBR Green I為主要代表，是非特異性熒光化學(xué)材料。 熒光標(biāo)記引物、雜交探針等，屬于特異性熒光材料。 2.1 SYBR Green I SYBR Green I是一種能夠與雙鏈 DNA

7、小溝結(jié)合的染料。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I 發(fā)出微弱的熒光，但是一旦與雙鏈DNA結(jié)合，其熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)。因此，一個(gè)反應(yīng)發(fā)出的全 部熒光信號(hào)與出現(xiàn)的雙鏈DNA量成正比，可以根據(jù)熒光信號(hào)檢測出PCR體系中的雙鏈DNA 的數(shù)量7。其優(yōu)點(diǎn)是檢測方法簡單，通用性好，價(jià)格相對較低，是許多實(shí)驗(yàn)室開展熒光定量實(shí)驗(yàn) 的首選。SYBR Green I的缺點(diǎn)在于它能夠和所有的雙鏈DNA相結(jié)合，因此由引物二聚體、 單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)、非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物引起的熒光信號(hào)會(huì)影響定量的準(zhǔn)確性。但可以通過優(yōu)化 PCR的反應(yīng)條件、選擇設(shè)計(jì)良好的引物，來減少或去除引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生；另 外，也可以通過對擴(kuò)增產(chǎn)物的

8、溶解曲線進(jìn)行分析來判斷熒光信號(hào)的真實(shí)性。 擴(kuò)增加入一對引物的同時(shí)加入 酸,它設(shè)計(jì)為與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對 標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。當(dāng)探針保持完整時(shí),3端淬滅基團(tuán)抑制了 PCR擴(kuò)增中，模板變性后低溫退火，引物與探針同時(shí)與模板結(jié)合 2.2 TaqMan 探針 TaqMan探針技術(shù)是有美國 Perkin Elmer(PE)公司研制的一種實(shí)時(shí) PCR定量技術(shù)，在PCR 1個(gè)特異性的熒光探針，此熒光探針為一個(gè) 3045 bp的寡核苷 ,其5端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán),3端 5端發(fā)射基團(tuán)的熒光發(fā)射。但在 ，在引物的介導(dǎo)下，沿模板向前 延伸至探針結(jié)合處，發(fā)生鏈的置換,Taq DNA聚合酶的57外切酶活

9、性將探針 5端連接的熒 光發(fā)射基團(tuán)從探針上切割下來 ，游離于反應(yīng)體系中，從而脫離3端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，接受 光刺激發(fā)出熒光信號(hào)。由于被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和PCR產(chǎn)物數(shù)量是相對應(yīng)關(guān)系，且熒光強(qiáng) 8。TaqMan ，因 度同被釋放的熒光基團(tuán)的數(shù)目也是正比關(guān)系，因此該技術(shù)可對模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量 探針技術(shù)特異性好、準(zhǔn)確性高、假陽性低、重復(fù)性比較好。但是需要設(shè)計(jì)特異性的探針 此成本較高9。 2.3分子信標(biāo) 分子信標(biāo)技術(shù)是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)狀雙標(biāo)記寡核苷酸探針，環(huán)部與靶DNA序列互 補(bǔ)，為1535 bp;莖部是由互相配對的堿基組成，但與靶DNA無序列同源性，約8 bp。在探針的 5端和3端分別標(biāo)記熒光發(fā)

10、射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。當(dāng)溶液中的模板與分子信標(biāo)結(jié)合配對時(shí)， 分子信標(biāo)的構(gòu)象改變成鏈狀使得熒光發(fā)射基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開，當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時(shí)，就發(fā)出 熒光信號(hào)。與探針互補(bǔ)的靶分子數(shù)量越多，熒光信號(hào)也就越強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)了對目的基因的定量 檢測。分子信標(biāo)的方法優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，熒光背景低。其缺點(diǎn)是設(shè)計(jì)困難，雜交探針不能完全 與模板結(jié)合，穩(wěn)定性較差，價(jià)格高10。 轉(zhuǎn)貼于中國論文下載中心htt P： /WWW. 3熒光定量 PCR技術(shù)的定量方法 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是DNA定量技術(shù)的一次飛躍。 運(yùn)用該技術(shù)，可以對DNA、RNA 樣品進(jìn)行定量和定性分析。定量方法包括絕對定量和相對定量。前者可以得到某個(gè)樣本中基

11、因的拷貝數(shù)和濃度；后者可以對不同方式處理的2個(gè)樣本中的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較。 3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線法的絕對定量法 用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)， 以測得的Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相同條件下檢測未知樣品的Ct值，從而根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲 線計(jì)算出未知樣品的濃度(拷貝數(shù))。制作1個(gè)好的標(biāo)準(zhǔn)曲線對定量結(jié)果至關(guān)重要，在制作標(biāo)準(zhǔn) 曲線時(shí)，應(yīng)至少選擇5個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，涵蓋待測樣本中目的基因量可能出現(xiàn)的全部濃度范 圍,最好與目的基因有較高的同源性；絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品通?？梢允羌兓馁|(zhì)粒dsDNA,體外轉(zhuǎn) 錄的RNA,或者是體外合成的ssDNA、標(biāo)準(zhǔn)品的量可根據(jù) 260

12、 nm的吸光度值并用 DNA或 RNA的分子量轉(zhuǎn)換成其拷貝數(shù)來確定。 3.2雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對定量法 在某些不需要對基因進(jìn)行絕對定量、只需要確定基因相對表達(dá)差異的情況下，如某基因 在經(jīng)過某種處理后表達(dá)量是增加了還是減少了，用相對定量的方法就可以得到結(jié)果。雙標(biāo)準(zhǔn) 曲線法是指在測定目的基因的同時(shí)測定某一內(nèi)源性管家基因，并用目的基因和管家基因的標(biāo) 準(zhǔn)品分別作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，處理與未處理樣品同時(shí)擴(kuò)增目的基因和管家基因，獲得Ct值,然后從 各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出初始模板量，經(jīng)管家基因均一化處理后，求出目的基因的相對含量。定 量的表達(dá)是相對于某個(gè)參照物的量而言的，因此相對定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線就比較容易制備，對所用 的

13、標(biāo)準(zhǔn)品不需要知道絕對拷貝數(shù)，只要知道其相對稀釋度即可。通常選用的管家基因有 GAPDH、lactin、B-微球蛋白和rRNA。此方法在擴(kuò)增效率較低、目標(biāo)基因與管家基因擴(kuò) 增效率有差異時(shí)適用，且需要很精確的結(jié)果計(jì)算。 3.3比較Ct法的相對定量法 如果反應(yīng)條件控制較好，擴(kuò)增效率較高，目的基因和管家基因的擴(kuò)增效率基本一致，這時(shí) 就不需要作標(biāo)準(zhǔn)曲線，而是通過與管家基因Ct值之間的相差來計(jì)算目的基因的表達(dá)差異。比 較Ct法運(yùn)用了數(shù)學(xué)公式來計(jì)算相對量，前提是假設(shè)每個(gè)循環(huán)增加1倍的產(chǎn)物量，根據(jù)數(shù)學(xué)推導(dǎo) 得出： 目的基因的量=2-AA C t 在該公式中，AA Ct=（C目的基因-Ct管家基因）實(shí)驗(yàn)組-（C

14、t目的基因-Ct管家基因）對照組。 因此，2-AA Ct表示的是實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對于對照組的變化倍數(shù)，使用這一方法可以 直接得到的目的基因相對于管家基因的定量，而不必制作標(biāo)準(zhǔn)曲線11。 4熒光定量 PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化 定量PCR技術(shù)已經(jīng)在生物學(xué)研究中得到了廣泛的應(yīng)用，技術(shù)也日臻完善，并且敏感度極 高,特異性強(qiáng)；正因?yàn)槊舾卸雀?很容易受其他因素的影響，因此要得到準(zhǔn)確可靠的反應(yīng)結(jié)果，必 須根據(jù)不同的反應(yīng)類型優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，如特異性探針及引物的設(shè)計(jì)、選擇合適的Mg2+濃度、 引物和探針濃度、循環(huán)數(shù)等，規(guī)范操作步驟，并仔細(xì)配制PCR反應(yīng)體系。 4.1引物及探針 一是設(shè)計(jì)要求。引物設(shè)計(jì)是實(shí)時(shí)定

15、量PCR中最重要的一步，擴(kuò)增片段長度根據(jù)技術(shù)的不 同有所區(qū)別：SYBR greenl技術(shù)要求擴(kuò)增片段不大于500 bp,Taq Man探針技術(shù)要求擴(kuò)增片段 長度在50150 bp。引物序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段并具有特異性，長度一般為1824 bp, 避免引物自身或與引物之間形成4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)配對，引物自身不能形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)， 熔解溫度Tm值在5565 C ,GC含量在40%60%,上、下游引物之間的 Tm值相差不要超 過4 Co在Taqman探針的設(shè)計(jì)上要求絕對保守長度為3045 bp,Tm值在6870 C，探針的 5端不能為G和避免多個(gè)堿基同時(shí)出現(xiàn)，探針應(yīng)盡可能靠近上游引物。二是濃度

16、。引物和探 針的濃度也會(huì)影響反應(yīng)的特異性，引物濃度太低會(huì)致使反應(yīng)不完全，引物濃度太高會(huì)導(dǎo)致非特 異性產(chǎn)物擴(kuò)增。最佳的引物濃度一般在0.10.6卩moL/L探針的濃度在 0.050.30卩moL/L,可 以在這個(gè)基礎(chǔ)上再進(jìn)一步優(yōu)化，以達(dá)到引物探針整體的最佳濃度。三是穩(wěn)定性。一般從生物 技術(shù)公司定制引物是以干粉形式運(yùn)輸?shù)?，使用時(shí)最好用 TE溶液溶解，使其最終濃度為100 moL/L-20 C保存。純度咼、標(biāo)記效率咼的探針不僅熒光值咼，且保存時(shí)間可以長達(dá) 1年以 上。由于反復(fù)凍融易導(dǎo)致探針降解，在確認(rèn)探針質(zhì)量好的情況下，最好稀釋成2 1 moL/L（10X ）, 作為工作濃度分裝多支，避光保存。四是

17、退火溫度。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm值低5Co 在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火；同時(shí)還要足夠高，以減少非 特異性結(jié)合。合理的退火溫度一般為5570 Co 4.2模板質(zhì)量與濃度 模板的質(zhì)量會(huì)影響 PCR擴(kuò)增的效率。模板應(yīng)在-20 C保存，避免反復(fù)凍融。用 TE溶液 溶解和稀釋模板，這能大大延長保質(zhì)期。模板濃度應(yīng)根據(jù) Ct值選擇，使Ct值位于1530個(gè)循環(huán)比較合適若Ct值大于30,則應(yīng)提高的模板濃度；如果小于15,則應(yīng)降低的模板濃度。 4.3鎂離子濃度 Mg2+是影響Taq酶活性的關(guān)鍵因素。 Mg2+的濃度過高，會(huì)增加非特異性擴(kuò)增，降低忠實(shí) 性;Mg2+的濃度過低影響

18、 Taq酶發(fā)揮最佳活性。一般來說,對以DNA或cDNA為模板的PCR 反應(yīng),應(yīng)選擇25 mmoL/L濃度的Mg2+。 4.4循環(huán)數(shù) 一般的實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)只需2530個(gè)循環(huán)便可獲得滿意的結(jié)果 ，但是對于那些極微 量的待測樣本而言，適當(dāng)增加循環(huán)數(shù)可以提高反應(yīng)的檢出底限 ，建議循環(huán)數(shù)為40個(gè)，但是并非 循環(huán)數(shù)增加的越多，其敏感性就會(huì)越高。實(shí)際上 ，當(dāng)循環(huán)數(shù)增加到某一值時(shí)，敏感性便不再升 咼。 4.5重復(fù)實(shí)驗(yàn)和陰性、陽性對照 定量實(shí)驗(yàn)，誤差是不可避免的，設(shè)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，可以將誤差降低到最 小,因此定量實(shí)驗(yàn)的每個(gè)樣本至少要重復(fù)3次以上。為了增加PCR擴(kuò)增反應(yīng)的可信度，在擴(kuò)增 的同

19、時(shí)，需進(jìn)行陰性、陽性對照反應(yīng)。陰性反應(yīng)中不加模板DNA,而以水或緩沖液代替，用于 檢驗(yàn)是否存在PCR污染。陽性對照則用于檢驗(yàn) PCR試劑和實(shí)驗(yàn)操作上可能出現(xiàn)的問題。相 對來說，儀器、PCR試劑、SYBR Green I染料是很穩(wěn)定的，而操作和模板是薄弱環(huán)節(jié)，模板的 加入量一定要準(zhǔn)確，為確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的有效性，每個(gè)樣品至少平行做 3次重復(fù)。使用微量移液 器時(shí)，如果不仔細(xì)，就會(huì)產(chǎn)生較大的用量誤差甚至錯(cuò)誤。在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)當(dāng)避免室溫下混合各 種試劑，應(yīng)在冰上進(jìn)行，避免所配體系產(chǎn)生氣泡，并且在一經(jīng)混合后立即開始進(jìn)行擴(kuò)增。 ,并優(yōu)化反應(yīng)體系和控制反應(yīng)條件，可以成功 特異的熒光定量 PCR檢測方法，實(shí)現(xiàn)大樣本

20、同時(shí)檢測，節(jié)省大量的時(shí)間和 科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，熒光定量PCR技術(shù)將會(huì)深入和拓展，在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中得到 5結(jié)語 通過設(shè)計(jì)針對目的基因的特異性引物和探針 地建立快速、靈敏、 反應(yīng)成本。隨著基因 更廣泛的應(yīng)用。 6參考文獻(xiàn) K A,JOSE M A,MARTIN B,et al.The real-time polymerase chain 1 MIKAEL reactio nJ.MoLecular Asp ects of Medici ne,2006(27):95-125. 2 LERAT S,VINCENT M L.Real-time polymerase chain reaction qua n-ti

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