蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究方法

1、 一個細胞或一個機體的基因所表達的全一個細胞或一個機體的基因所表達的全 部蛋白質(zhì)部蛋白質(zhì) 系系, ,揭示蛋白質(zhì)的功能與細胞生命活動揭示蛋白質(zhì)的功能與細胞生命活動 的規(guī)律的規(guī)律 的研究，的研究， 包括蛋白質(zhì)的功能及蛋白質(zhì)包括蛋白質(zhì)的功能及蛋白質(zhì) 間的相互作用。間的相互作用。 編輯ppt7 0.50nm 0.54nm 氫鍵 -碳原子 側(cè)鏈 反平行 俯視 側(cè)視 DNA mRNA 蛋白質(zhì) 轉(zhuǎn)錄 翻譯 基因 蛋白質(zhì) 細胞特 異性基 因表達 生理狀態(tài) 溫度 應(yīng)激 狀態(tài) 培養(yǎng)條件 藥物作用 數(shù)量有限 結(jié)構(gòu)相對 穩(wěn)定 復(fù)雜性 多變性 直接 反應(yīng) 生命 現(xiàn)象 復(fù) 雜 的 調(diào) 控 術(shù)術(shù), ,以及以及生物信息學(xué)生物

2、信息學(xué)( (Bioinformatics) ) 分析。分析。 Protein sample Image analysis Protein in gel Protein on membrane Protein in solution 2-D PAGE Excision Blotting Elution Partial degradation Peptide mixture Mass of protein N-terminal sequence MS Edman degradation Peptide mass fingerprint Peptide sequence MS/MS data Dat

3、abase searching Novel or previously studied protein Characterization of post-translocation modifications 蛋蛋 白 白 質(zhì) 質(zhì) 組 組 的 的 分 分 析 析 流流 程 程 蛋白質(zhì)的上樣量和檢測靈敏度。蛋白質(zhì)的上樣量和檢測靈敏度。 三三 第二相：第二相：SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 電泳電泳 根據(jù)蛋白質(zhì)分子量差根據(jù)蛋白質(zhì)分子量差 異異 基本原理 第一向在高壓電場下對蛋白質(zhì)進行等電聚焦第一向在高壓電場下對蛋白質(zhì)進行等電聚焦(IEF), 再在第再在第 一向垂直方向上進行第二向一向垂直

4、方向上進行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)。 IEF-focused proteins SDS-charged proteins in IPG strip SDS-charged proteins resolved according to sizes in SDS-PAGE gel 2-DE原理示意圖 蛋白質(zhì) 溶解 變性 還原 去除蛋白 質(zhì)雜志 利用不同 pK固定化 電解質(zhì)可 配置不同 pH范圍的 凝膠或利 用商業(yè)化 軟件設(shè)計 第一相電泳： IPGIFE 平衡 第二相電泳： SDSPAGE 考馬斯亮 藍染色、 銀染色、 銅染色 樣品制備IPG膠制備雙相

5、電泳 染色 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE SDS polyacrylamide gel electrophoresis SDSSDS帶負電荷，破壞蛋白質(zhì)的氫帶負電荷，破壞蛋白質(zhì)的氫 鍵、疏水鍵，使之形成單個亞基。鍵、疏水鍵，使之形成單個亞基。 SDS-SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物為雪茄形的蛋白質(zhì)復(fù)合物為雪茄形的 長橢圓棒長橢圓棒，消除或掩蓋了不同種消除或掩蓋了不同種 類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異。 SDSSDS - -蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳 中的中的遷移遷移率只是蛋白質(zhì)分子量的率只是蛋白質(zhì)分子量的 函數(shù)有關(guān)函數(shù)有關(guān)。 制膠：制膠

6、： 試劑試劑 分離膠（分離膠（ml） 濃縮膠（濃縮膠（ml） 1.5M Tris-HCl （pH 8.9） 2.50 30%單體單體 3.50 1.00 10%SDS 0.10 0.10 蒸餾水蒸餾水 3.84 6.34 0.5M Tris-HCl （pH 6.8） 2.50 10%過硫酸銨過硫酸銨AP 0.05 0.05 四甲基乙二胺四甲基乙二胺TEMED 0.01 0.01 樣品處理：樣品處理： Loading buffer 40%甘油甘油 溴酚蘭溴酚蘭 SDS -巰基乙醇巰基乙醇 0.5M Tris-HCl（pH 6.8） 50ul樣品樣品 50ul(2)Loading buffer M

7、ix 950C/5min 上電極緩沖液上電極緩沖液 下電極緩沖液下電極緩沖液 樣品槽樣品槽 上樣器上樣器 陰極陰極 陽極陽極 電泳電泳 方向方向 聚丙烯酰胺凝膠板聚丙烯酰胺凝膠板 蛋白質(zhì)點染色蛋白質(zhì)點染色, , 該法操作方便、重現(xiàn)該法操作方便、重現(xiàn) 性好性好, , 同銀染法一樣同銀染法一樣, , 質(zhì)譜測定時也質(zhì)譜測定時也 必須先脫色必須先脫色. . 2-DE獲得的蛋白質(zhì)圖譜 圖像采集 斑點檢測 背景消減 獲得蛋白質(zhì)相關(guān)信息 圖像內(nèi)及圖像間的比較 2-DE2-DE圖像分析軟件包操作過程：圖像分析軟件包操作過程： 丙烯酰胺有神經(jīng)毒作用。丙烯酰胺有神經(jīng)毒作用。 詢、鑒定蛋白質(zhì)。詢、鑒定蛋白質(zhì)。 多維色譜技術(shù)（多維色譜技術(shù)（LC/LC-MS/MS） 多維蛋白質(zhì)鑒定技