菌種擴(kuò)大培養(yǎng)

1、菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 第二章 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 第一節(jié)第一節(jié) 生產(chǎn)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)生產(chǎn)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) 發(fā)酵罐容積幾百立方米。 生產(chǎn)用種子是一個(gè)由實(shí)驗(yàn)室制備到車間生產(chǎn)的過程。 其生產(chǎn)方法與條件隨不同的生產(chǎn)品種和菌種種類而異。 如細(xì)菌、酵母菌、放線菌或霉菌生長的快慢；產(chǎn)孢子能 力的大?。粻I養(yǎng)、溫度、需氧等條件要求均有所不同。 種子擴(kuò)大培養(yǎng)應(yīng)根據(jù)菌種的生理特性，選擇合適的培 養(yǎng)條件來獲得代謝旺盛、數(shù)量足夠的種子。種子接入發(fā) 酵罐后，將使發(fā)酵生產(chǎn)周期縮短，設(shè)備利用率提高。種 子液質(zhì)量的優(yōu)劣對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)起著關(guān)鍵性的作用。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 種子擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)：是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于 休眠狀

2、態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，在經(jīng)過扁瓶或搖瓶 及種子罐逐級(jí)放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這 些純種培養(yǎng)物稱為種子。 發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)過程中的種子的必須滿足以下條件： （1）菌種細(xì)胞的生長活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長， 遲緩期短； （2）生理性狀穩(wěn)定； （3）菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求； （4）無雜菌污染； （5）保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 在發(fā)酵生產(chǎn)過程中，種子制備的過程大致可分為兩個(gè)階段： （1）實(shí)驗(yàn)室種子制備階段 （2）生產(chǎn)車間種子制備階段 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 一、實(shí)驗(yàn)室種子的制備一、實(shí)驗(yàn)室種子的制備 實(shí)驗(yàn)室種子的制備一般采用兩種方式： 產(chǎn)孢子能力強(qiáng)的及孢子發(fā)芽

3、、生長繁殖快的菌種可以采用 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣 操作簡便，不易污染雜菌。 產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種，可用液體培養(yǎng)法。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) （一）孢子的制備 1、細(xì)菌的制備 細(xì)菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富。 培養(yǎng)溫度一般為37。細(xì)菌菌體培養(yǎng)時(shí)間12d，產(chǎn)芽孢的 細(xì)菌培養(yǎng)510d。 2、霉菌的制備 霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等 天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。培養(yǎng)的溫度一般為25-28。培養(yǎng)時(shí) 間一般為414d。 3、放線菌的制備 放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含 有適合產(chǎn)孢子的營養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和無 機(jī)鹽等

4、。培養(yǎng)溫度一般為28。培養(yǎng)時(shí)間5-14d。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) （二）液體種子制備 1、好氧培養(yǎng) 對(duì)于產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰 色鏈霉菌（S. griseus）可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入 含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種 子。其過程如下： 試管三角瓶搖床種子罐 2、厭氧培養(yǎng) 酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）其種子的制備過程如下： 試管三角瓶卡式罐種子罐 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 例如例如: 生產(chǎn)啤酒的酵母菌一般保存在麥芽汁瓊脂或MYPG培養(yǎng)基 （培養(yǎng)基配制：3g麥芽浸出物，3g酵母浸出物，5g蛋白胨，10g 葡萄糖和20g瓊脂于1L水中）的斜面上，于4冰箱內(nèi)保藏

5、。每 年移種3-4次。 將保存的酵母菌種接入含10ml麥芽汁的500-1000ml三角 瓶中，再于25培養(yǎng)2-3d。 再擴(kuò)大至含有250-500ml麥芽汁的500-1000ml三角瓶中， 再于25培養(yǎng)2d. 移種至含有5-10L麥芽汁的卡氏培養(yǎng)罐中，于15-20培 養(yǎng)3-5d即可作100L麥芽汁的發(fā)酵罐種子。從三角瓶到卡氏培養(yǎng) 罐培養(yǎng)期間，均需定時(shí)搖動(dòng)或通氣，使酵母菌液與空氣接觸， 以有利與酵母菌的增殖。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 二、生產(chǎn)車間種子制備二、生產(chǎn)車間種子制備 種子罐的培養(yǎng)基因不同菌種而異，但其原則為采用易被菌 利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等， 需氧菌，還需供給足夠的無菌空氣，并不斷攪拌

6、，使菌（ 絲）體在培養(yǎng)液中均勻分布。 1、種子罐的作用 使孢子發(fā)芽，生長繁殖成菌（絲）體，接入發(fā)酵罐能迅速 生長，達(dá)到一定的菌體量，以利于產(chǎn)物的合成。 2、種子罐級(jí)數(shù)的確定 種子罐級(jí)數(shù)種子罐級(jí)數(shù)：是指制備種子需逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)，取決 于： （1）菌種生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度； （2）所采用發(fā)酵罐的容積。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 比如： 細(xì)菌細(xì)菌：生長快，種子用量比例少，級(jí)數(shù)也較少，二級(jí)發(fā)酵。 茄子瓶種子罐發(fā)酵罐 霉菌霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級(jí)發(fā)酵 孢子懸浮液一級(jí)種子罐（27,40h孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌 絲 ）二級(jí)種子罐（27，10-24h，菌體迅速繁殖，粗壯菌 絲體）發(fā)酵罐 放線菌放線菌：生長

7、更慢，采用四級(jí)發(fā)酵 酵母酵母：比細(xì)菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級(jí)種子 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 3、確定種子罐級(jí)數(shù)需注意的問題 （1）種子級(jí)數(shù)越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機(jī)會(huì) （2）種子級(jí)數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時(shí)間延長，降低發(fā)酵罐 的生產(chǎn)率，增加染菌機(jī)會(huì) （3）雖然種子罐級(jí)數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。但也與 所選用工藝條件有關(guān)。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子 發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級(jí)數(shù)。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 第二節(jié)第二節(jié) 種子質(zhì)量的控制種子質(zhì)量的控制 一一、影響種子質(zhì)量的因素及控制、影響種子質(zhì)量的因素及控制 影響種子質(zhì)量的因素通常有：培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間 和冷藏時(shí)間等。

8、 1、培養(yǎng)基 種子質(zhì)量不穩(wěn)定的主要原因是原材料質(zhì)量波動(dòng)。 例如：在四環(huán)素、土霉素生產(chǎn)中，配制產(chǎn)孢子斜面培養(yǎng)基用 的麩皮，因小麥產(chǎn)地、品種、加工方法及用量的不同對(duì)孢子質(zhì) 量的影響也不同。 蛋白胨加工原料不同如魚胨或骨胨對(duì)孢子影響不同。 原材料質(zhì)量的波動(dòng)，也會(huì)影響孢子質(zhì)量。如微量元素Mg2+ 、 Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也會(huì)影響孢子 的質(zhì)量。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 水質(zhì)的影響：地區(qū)不同、季節(jié)變化和水源污染，均可 造成水質(zhì)波動(dòng)，影響種子質(zhì)量。 菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現(xiàn)多種不同代謝類型的菌落， 氮源品種越多，出現(xiàn)的菌落類型也越多，不利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。 解決措施解決措施： （1）培養(yǎng)

9、基所用原料要經(jīng)過發(fā)酵試驗(yàn)合格才可使用； （2）嚴(yán)格控制滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量； （3）斜面培養(yǎng)基使用前，需在適當(dāng)溫度下放置一定時(shí)間； （4）供生產(chǎn)用的孢子培養(yǎng)基要用比較單一的氮源，作為選 種或分離用的培養(yǎng)基則采用較復(fù)雜的有機(jī)氮源。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 2、培養(yǎng)條件 （1）溫度 如土霉素生產(chǎn)菌種在高于37培養(yǎng)時(shí)，孢子接入發(fā)酵罐后 出現(xiàn)糖代謝變慢，氨基氮回升提前，菌絲過早自溶，效價(jià)降低 等現(xiàn)象。一般要嚴(yán)格控制孢子子斜面的培養(yǎng)溫度。 （2）濕度 制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對(duì)孢子數(shù)量和質(zhì)量有較大影響。 例如土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌孢子制備時(shí)發(fā)現(xiàn)：氣候干燥 地區(qū)孢子斜面長得較快，在含有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下 部

10、孢子長得較好，斜面上部由于水分迅速蒸發(fā)呈干疤狀，孢子 稀少。 在氣溫高含濕度大的地區(qū)，斜面孢子長得慢，主要由于試管 下部冷凝水多而不利于孢子的形成。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 表2-1不同相對(duì)濕度對(duì)龜裂鏈霉菌斜面生長的影響 相對(duì)濕度 （%） 斜面外觀活孢子計(jì)數(shù) （億/支） 16.519 2536 4045 上部稀薄下部稠略黃 上部薄中部均勻發(fā)白 一片白，孢子豐富， 稍皺 1.2 2.3 5.7 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 3、培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)間 （1）培養(yǎng)時(shí)間 一般來說，衰老的孢子不如年輕的孢子，因?yàn)樗ダ系逆咦右?在逐步進(jìn)入發(fā)芽階段，核物質(zhì)趨于分化狀態(tài)。過于衰老的孢子 會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)能力的下降。 解決措施解決措施： 孢子培

11、養(yǎng)的時(shí)間應(yīng)該控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量 正常的階段終止培養(yǎng)。 （2）冷藏時(shí)間 斜面冷藏對(duì)孢子質(zhì)量影響與孢子成熟程度有關(guān)。如土霉素生 產(chǎn)菌種孢子斜面培養(yǎng)4d左右即于4冰箱保存，發(fā)現(xiàn)冷藏7-8d菌 體細(xì)胞開始自溶。而培養(yǎng)5d以后冷藏，20d未發(fā)現(xiàn)自溶。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 冷藏時(shí)間對(duì)孢子生產(chǎn)能力也有影響。例如在鏈霉素生 產(chǎn)中，斜面孢子在6冷藏兩個(gè)月后發(fā)酵單位比冷藏一個(gè)月降 低18%，冷藏3個(gè)月后降低35%。 4、接種量 接種量大小影響到培養(yǎng)基中孢子的數(shù)量，進(jìn)而影響菌體 的生理狀況。也影響到菌種的適應(yīng)期。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 二、影響種子質(zhì)量的因素及控制 生產(chǎn)過程中影響種子質(zhì)量的因素通常有：孢子的質(zhì)量、

12、培養(yǎng) 基、培養(yǎng)條件、種齡、接種量。 1、培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基要滿足以下要求： （1）營養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要 （2）選擇有利于孢子發(fā)芽和菌體生長的培養(yǎng)基； （3）營養(yǎng)上要易于被菌體直接吸收和利用； （4）營養(yǎng)成分要適當(dāng)豐富和完全，氮源和維生素含量要高 （5）營養(yǎng)成分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 2、培養(yǎng)條件 （1）溫度 （2）通氣量 在種子罐中培養(yǎng)的種子除保證供給易被利用的培養(yǎng)基外，有 足夠的通氣量可以提高種子質(zhì)量。例如，青霉素的生產(chǎn)菌種在 制備過程中將通氣充足和不足兩種情況下得到的種子分別接入 發(fā)酵罐內(nèi)，它們的發(fā)酵單位可相差1倍。但也有例外，例如土霉 素生產(chǎn)菌，一級(jí)種子罐的通氣量

13、小對(duì)發(fā)酵有利。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 3、種齡 種齡種齡：是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培 養(yǎng)時(shí)間。 通常種齡是以處于生命力極旺盛的對(duì)數(shù)生長期，菌體量還未達(dá)到最大值時(shí) 的培養(yǎng)時(shí)間較為合適。時(shí)間太長，菌種趨于老化，生產(chǎn)能力下降，菌體自溶 ；種齡太短，造成發(fā)酵前期生長緩慢。 不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不一樣的，一般需經(jīng)過多種 實(shí)驗(yàn)來確定。如嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶，12小時(shí)最好（見下圖）。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 4、接種量 接種量接種量：是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。 接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度，采用較大的 接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌

14、絲繁殖達(dá)到高峰的時(shí)間，使產(chǎn)物的形成提前到來 ，并可減少雜菌的生長機(jī)會(huì)。但接種量過大或者過小，均會(huì)影響發(fā)酵。過大 會(huì)引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成；而且會(huì)過多移入代謝廢物，也不經(jīng)濟(jì)；過 小會(huì)延長培養(yǎng)時(shí)間，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。通常接種量，細(xì)菌15%，酵母菌 510%，霉菌715%，有時(shí)2025% 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 三、種子質(zhì)量的控制措施三、種子質(zhì)量的控制措施 種子質(zhì)量的最終指標(biāo)是考察其在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來的生產(chǎn) 能力。因此首先必須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性，其次是提供種子 培養(yǎng)的適宜環(huán)境保證無雜菌侵入，以獲得優(yōu)良種子。因此在生 產(chǎn)過程中通常進(jìn)行以下兩項(xiàng)檢查。 （1）菌種穩(wěn)定性的檢查 （2）無（雜菌）檢查 菌種擴(kuò)

15、大培養(yǎng) 四、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)四、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1、細(xì)胞或菌體 菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液外觀（色素、顆粒等） 單細(xì)胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一 定的排列或形態(tài)； 霉菌、放線菌：菌絲粗壯、對(duì)某些染料著色力強(qiáng)、生長旺盛 、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況好。 2、生化指標(biāo) 種子液的糖、氮、磷的含量和pH變化。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 3、產(chǎn)物生成量 在抗生素發(fā)酵中，產(chǎn)物生成量是考察種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，因 為種子液中產(chǎn)物生成量的多少間接反映種子的生產(chǎn)能力和成熟程 度。 4、酶活力 種子液中某種酶的活力，與目的產(chǎn)物的產(chǎn)量有一定的關(guān)聯(lián)。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 五、種子異常分析五、種子異常分析 菌種生長速度，過快或

16、過慢 菌絲結(jié)團(tuán) 菌絲粘壁 感染噬菌體 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 第四節(jié)第四節(jié) 實(shí)例實(shí)例 一、谷氨酸發(fā)酵的菌種擴(kuò)大培養(yǎng)一、谷氨酸發(fā)酵的菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 斜面菌種一級(jí)種子培養(yǎng)二級(jí)種子培養(yǎng)發(fā)酵罐 1、斜面菌種的培養(yǎng) 菌種的斜面培養(yǎng)必須有利于菌種生長而不產(chǎn)酸，并要求斜面 菌種絕對(duì)純，不得混有任何雜菌和噬菌體，培養(yǎng)條件應(yīng)有利于 菌種繁殖，培養(yǎng)基以多含有機(jī)氮而不含或少含糖為原則。 (1)斜面培養(yǎng)基組成 葡萄糖0.1%，蛋白胨1.0%，牛肉膏1.0%，氯化鈉0.5%，瓊 脂2.02.5%，pH7.07.2（傳代和保藏斜面不加葡萄糖）。 (2)培養(yǎng)條件 3334，培養(yǎng)1824h。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 2、一級(jí)種子培養(yǎng) 一級(jí)種子培養(yǎng)

17、的目的在于大量繁殖活力強(qiáng)的菌體，培養(yǎng)基組 成應(yīng)以少含糖分，多含有機(jī)氮為主，培養(yǎng)條件從有利于長菌考 慮。 (1)培養(yǎng)基組成 葡萄糖2.5%，尿素0.5%，硫酸鎂0.04%，磷酸氫二鉀0.1% ，玉米漿2.53.5%(按質(zhì)增減)，硫酸亞鐵、硫酸錳各2ppm， pH7.0。 (2)培養(yǎng)條件 用1000mL三角瓶裝入培養(yǎng)基200mI，滅菌后置于沖程7.6cm、 頻率96次/min的往復(fù)式搖床上振蕩培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度3334 。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) (3)一級(jí)種子質(zhì)量要求 種齡：12h，pH值：6.40.1 光密度：凈增OD值0.5以上 殘?zhí)牵?.5以下無菌檢查：(-) 噬菌體檢查：(-) 鏡檢：菌體生長均

18、勻、粗壯，排列整齊 革蘭氏陽性反應(yīng)。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 3、二級(jí)種子培養(yǎng) 為了獲得發(fā)酵所需要的足夠數(shù)量的菌體，在一級(jí)種子培養(yǎng)的 基礎(chǔ)上進(jìn)而擴(kuò)大到種子罐的二級(jí)種子培養(yǎng)。種子罐容積大小取 決于發(fā)酵罐大小和種量比例。 (1)培養(yǎng)基組成 培養(yǎng)基組成 （%） T6-13B9T738AS1.2 99 水解糖 玉米漿 磷酸氫二鉀 硫酸鎂 尿素 Fe+（ppm） Mn+（ppm） pH 2.5 2.5- 3.5 0.15 0.04 0.4 2 2 6.8- 7.0 2.5 2.5- 3.5 0.15 0.04 0.4 2 2 6.8- 7.0 2.5 2.5- 3.5 0.2 0.05 0.5 2 2 7.0 2

19、.5 2.5 0.1 0.04 0.5 2 2 6.5- 6.8 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) (2)培養(yǎng)條件 接種量：0.81.0 培養(yǎng)溫度：3234 培養(yǎng)時(shí)間：78h 通風(fēng)量： 50L種子罐1:0.5 攪拌轉(zhuǎn)速340rmin； 250L種子罐1:0.3 攪拌轉(zhuǎn)速300rmin 500L種子罐1:0.25 攪拌轉(zhuǎn)速230rmin 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) (3)二級(jí)種子的質(zhì)量要求 種齡：78h pH：7.2左右 OD值凈增0.5左右 無菌檢查(-) 噬菌體檢查(-) 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 二、啤酒酵母的擴(kuò)大培養(yǎng)二、啤酒酵母的擴(kuò)大培養(yǎng) 一般可采用三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)大倍數(shù)：第1級(jí)到第2級(jí)為8-10 倍，第2級(jí)到第3級(jí)為4-6倍。 1

20、、實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)大培養(yǎng) 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 三、三、 生產(chǎn)發(fā)酵罐的無菌接種生產(chǎn)發(fā)酵罐的無菌接種 生產(chǎn)規(guī)模發(fā)酵罐的接種，包括兩個(gè)方面：從實(shí)驗(yàn)室搖瓶或 孢子懸浮液容器中移種入一個(gè)種子罐；從一個(gè)種子罐移入另 一個(gè)生產(chǎn)發(fā)酵罐中。 （1）從實(shí)驗(yàn)室搖瓶或孢子懸浮液容器接種 通常有兩種方式 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 由于微生物傳代過程中不斷產(chǎn)生變異，即遺由于微生物傳代過程中不斷產(chǎn)生變異，即遺 傳變異是絕對(duì)的，而穩(wěn)定是相對(duì)的。菌株的優(yōu)良傳變異是絕對(duì)的，而穩(wěn)定是相對(duì)的。菌株的優(yōu)良 性狀不可能永久保持下去，即發(fā)生衰退（或退性狀不可能永久保持下去，即發(fā)生衰退（或退 化）。這就需要通過

21、創(chuàng)造適宜的環(huán)境來限制退化化）。這就需要通過創(chuàng)造適宜的環(huán)境來限制退化 速度，并且要掌握如何讓退化的菌種恢復(fù)其原來速度，并且要掌握如何讓退化的菌種恢復(fù)其原來 的優(yōu)良性狀（復(fù)壯）的方法。的優(yōu)良性狀（復(fù)壯）的方法。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) u衰退（退化）：衰退（退化）： 由于菌種的自發(fā)突變使其由于菌種的自發(fā)突變使其 典型性狀，特別是產(chǎn)量性狀發(fā)典型性狀，特別是產(chǎn)量性狀發(fā) 生負(fù)變的現(xiàn)象。生負(fù)變的現(xiàn)象。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) u引起菌種退化變異的因素：引起菌種退化變異的因素： v遺傳基因型的分離遺傳基因型的分離 v絲狀真菌、多細(xì)胞組成、有的單核、有的多核，遺傳絲狀真菌、多細(xì)胞組成、有的單核、有的多核，遺傳 物質(zhì)基礎(chǔ)有多樣性的

22、復(fù)雜性，為群體繁殖，往往出現(xiàn)物質(zhì)基礎(chǔ)有多樣性的復(fù)雜性，為群體繁殖，往往出現(xiàn) 遺傳基因型的分離，這是數(shù)量遺傳的自體調(diào)節(jié)現(xiàn)象。遺傳基因型的分離，這是數(shù)量遺傳的自體調(diào)節(jié)現(xiàn)象。 v自發(fā)變異的產(chǎn)生：負(fù)向變異為多數(shù)，結(jié)果：目的代謝自發(fā)變異的產(chǎn)生：負(fù)向變異為多數(shù)，結(jié)果：目的代謝 產(chǎn)物產(chǎn)量下降，生長逐步變?nèi)踝兟?，孢子形成能力低產(chǎn)物產(chǎn)量下降，生長逐步變?nèi)踝兟?，孢子形成能力?下等。下等。 v原因可能有：長期保藏；頻繁傳代（例：斜面保藏；原因可能有：長期保藏；頻繁傳代（例：斜面保藏； 發(fā)酵廠種子制備）；菌體在代謝過程中產(chǎn)生具有誘變發(fā)酵廠種子制備）；菌體在代謝過程中產(chǎn)生具有誘變 作用的物質(zhì)；存在增變作用的物質(zhì)；存在

23、增變 v人工誘變導(dǎo)致的退化變異人工誘變導(dǎo)致的退化變異 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) u衰退的防止：衰退的防止： v 控制傳代次數(shù)：不超過控制傳代次數(shù)：不超過7 7代，易變異的不過代，易變異的不過5 5代代 v 砂土管、凍干管保藏的原種，開啟不能超過砂土管、凍干管保藏的原種，開啟不能超過3 3次，以防次，以防 污染。污染。 v 選擇良好的保藏方法：保證菌不死、不衰、保存活性及選擇良好的保藏方法：保證菌不死、不衰、保存活性及 原有典型性狀原有典型性狀 v 良好的培養(yǎng)條件：注意斜面菌株的培養(yǎng)條件。（保藏培良好的培養(yǎng)條件：注意斜面菌株的培養(yǎng)條件。（保藏培 養(yǎng)基、活化培養(yǎng)基）養(yǎng)基、活化培養(yǎng)基） v 采用不同類型的細(xì)胞進(jìn)

24、行接種采用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行接種 v產(chǎn)孢子霉菌產(chǎn)孢子霉菌 v細(xì)菌細(xì)菌 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) v 復(fù)壯復(fù)壯： 廣義廣義是指在菌種的生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有是指在菌種的生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有 意識(shí)的進(jìn)行純種分離和生產(chǎn)性能的測定，從而使菌種的生意識(shí)的進(jìn)行純種分離和生產(chǎn)性能的測定，從而使菌種的生 產(chǎn)性能逐步提高的一種措施。產(chǎn)性能逐步提高的一種措施。 狹義狹義指菌種已經(jīng)發(fā)生衰退后，再通過純種分離和指菌種已經(jīng)發(fā)生衰退后，再通過純種分離和 性能測定的辦法從衰退的群體中找出尚未衰退的個(gè)體，性能測定的辦法從衰退的群體中找出尚未衰退的個(gè)體， 以達(dá)到保持該菌種原有典型性狀的一種措施。以達(dá)到保持該菌種原有典型性狀的

25、一種措施。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 復(fù)壯的方法通常有兩種 純種分離 淘汰已衰退的個(gè)體 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) v菌落純；用稀釋平板法或平板劃線法，取得單細(xì)胞菌菌落純；用稀釋平板法或平板劃線法，取得單細(xì)胞菌 落，再通過菌落的和菌的特征分析和性能測定，獲得落，再通過菌落的和菌的特征分析和性能測定，獲得 具有原來性狀或性狀更好的菌株。具有原來性狀或性狀更好的菌株。 v菌株純（細(xì)胞純）菌株純（細(xì)胞純）: : v只有菌絲的，在顯微鏡下用毛細(xì)管挑取只有一個(gè)核的菌；只有菌絲的，在顯微鏡下用毛細(xì)管挑取只有一個(gè)核的菌； v有孢子的，在顯微鏡下用毛細(xì)管挑取單個(gè)孢子。有孢子的，在顯微鏡下用毛細(xì)管挑取單個(gè)孢子。 v一般只要求達(dá)到菌落純的

26、水平一般只要求達(dá)到菌落純的水平用于退化不太嚴(yán)重的情況。用于退化不太嚴(yán)重的情況。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) v可通過物理、化學(xué)方法處理菌體（或孢子），使大部可通過物理、化學(xué)方法處理菌體（或孢子），使大部 分死亡（分死亡（80%80%以上），存活的菌多為生長健壯者，從以上），存活的菌多為生長健壯者，從 中選出優(yōu)良菌株。中選出優(yōu)良菌株。 v用用10%10%酒精處理，能耐之的一般為原菌株（啤酒酵母）。酒精處理，能耐之的一般為原菌株（啤酒酵母）。 v在培養(yǎng)基內(nèi)加青霉素，抗藥性較強(qiáng)的細(xì)菌一般為原菌株（產(chǎn)在培養(yǎng)基內(nèi)加青霉素，抗藥性較強(qiáng)的細(xì)菌一般為原菌株（產(chǎn) 抗生素）?？股兀?。 v適當(dāng)提高培養(yǎng)溫度適當(dāng)提高培養(yǎng)溫度 v加

27、乳酸，淘汰酸奶菌種中的衰退個(gè)體。加乳酸，淘汰酸奶菌種中的衰退個(gè)體。 一般可將單菌落分離與培養(yǎng)條件綜合進(jìn)行復(fù)壯，一般可將單菌落分離與培養(yǎng)條件綜合進(jìn)行復(fù)壯， 效果更好效果更好 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) v根本目的根本目的是保持原有典型形狀，防止退化、死亡是保持原有典型形狀，防止退化、死亡 及雜菌污染及雜菌污染 v途徑途徑：挑取其休眠體（分生孢子、芽孢），在其：挑取其休眠體（分生孢子、芽孢），在其 休眠后停止生長的條件下保藏。即缺乏營養(yǎng)、缺休眠后停止生長的條件下保藏。即缺乏營養(yǎng)、缺 水、缺氧、低溫等。水、缺氧、低溫等。 v重要因素重要因素：低溫：低溫 v要求不損傷要求不損傷cellcell，緩慢冷凍易使，緩慢冷

28、凍易使cell死亡，快速不死亡，快速不 易死亡。易死亡。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) v適于適于98%98%以上各類別的微生物，但不適于不產(chǎn)孢子以上各類別的微生物，但不適于不產(chǎn)孢子 的絲狀真菌的菌絲體的絲狀真菌的菌絲體 v原理原理: :在低溫下快速將細(xì)胞凍結(jié)，然后在真空條件下干在低溫下快速將細(xì)胞凍結(jié)，然后在真空條件下干 燥，使微生物的生長和酶活動(dòng)停止，為防止冷凍和水燥，使微生物的生長和酶活動(dòng)停止，為防止冷凍和水 分升華中對(duì)細(xì)胞的損害，采用保護(hù)劑代替干燥中丟失分升華中對(duì)細(xì)胞的損害，采用保護(hù)劑代替干燥中丟失 的結(jié)合水而穩(wěn)定細(xì)胞的構(gòu)型。防止細(xì)胞膜因凍結(jié)而破的結(jié)合水而穩(wěn)定細(xì)胞的構(gòu)型。防止細(xì)胞膜因凍結(jié)而破 壞，還可以

29、起支撐作用，使微生物疏松的固定在上面。壞，還可以起支撐作用，使微生物疏松的固定在上面。 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 步驟：步驟： v 安瓿管準(zhǔn)備安瓿管準(zhǔn)備 v D=8mmD=8mm，H=100mmH=100mm的中性安瓿管，用的中性安瓿管，用2%HCL2%HCL浸泡浸泡2424小時(shí)小時(shí)自來水沖自來水沖 凈凈蒸餾水洗蒸餾水洗1-21-2次次烘干烘干管口塞上棉塞管口塞上棉塞121121，3030分鐘分鐘 v 保護(hù)劑制備：保護(hù)劑制備： v脫脂牛乳或血清、乳糖、葡萄糖等（不含抗生素），脫脂牛乳或血清、乳糖、葡萄糖等（不含抗生素）， 蒸餾水配成蒸餾水配成17%-20%17%-20%的脫脂乳（在無菌的干燥三角瓶中）的脫

30、脂乳（在無菌的干燥三角瓶中） 121,5min or 108,15min 121,5min or 108,15min 殺菌（血清等用過濾殺菌（血清等用過濾 除菌）除菌） 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) v菌種準(zhǔn)備及分裝菌種準(zhǔn)備及分裝 菌懸液的制備：菌懸液的制備： v斜面（穩(wěn)定期）斜面（穩(wěn)定期） v 孢子孢子（新鮮成熟）（新鮮成熟）每個(gè)斜面加每個(gè)斜面加2-3ml2-3ml滅菌保護(hù)劑滅菌保護(hù)劑用用 接種環(huán)將菌苔刮起（若液體培養(yǎng)，則應(yīng)離心收集菌體，接種環(huán)將菌苔刮起（若液體培養(yǎng)，則應(yīng)離心收集菌體， 并經(jīng)滅菌生理鹽水洗滌，收集的菌體用保護(hù)劑制成菌并經(jīng)滅菌生理鹽水洗滌，收集的菌體用保護(hù)劑制成菌 懸液）制成懸液）制成菌懸液菌懸液（10109 9-10-1010 10CFU/mL CFU/mL）用滅菌的滴管用滅菌的滴管 將菌懸液滴加至將菌懸液滴加至安瓿管安瓿管底部，裝量一般為球體的底部，裝量一般為球體的2/32/3左左