博士生科研計劃書模板

1、博士研究生科研計劃書()姓 名：報考專業(yè)：計劃書題目：細胞角蛋白CK20對胃癌微轉移的預測價值及臨床意義2013年2月、立題依據(jù)重點介紹本項目的科學意義、國內外現(xiàn)狀，并附主要參考文獻胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，居消化道腫瘤發(fā)病率之首，多見于男性，男女發(fā)病率之比為2:1，死亡率居惡性腫瘤首位，平均死亡年齡為61.6歲。臨床上診斷的多為進展期胃癌患者，即使經(jīng)標準的根治性手術治療，其 5年生存率仍在40%左右，其中最重要的原因是胃癌患者術后了腹膜轉移。 近年來在臨床開展的術前輔助化療，也即新輔助化療(n eoadjuva ntchemotherapy, NACT)是指在惡性腫瘤局部治療、手術或放療前

2、給予的全身或局部化療，也稱術前化療(preoperative chemotherapy) 。新輔助化療是對腫瘤外科醫(yī)生及內科醫(yī)生觀念上的一個挑戰(zhàn)，其理論依據(jù)是：手術切除原發(fā)腫瘤可能會刺激剩余腫瘤細胞的生長；腫瘤周圍組織在術后血供改變影響化療藥物濃度及放療效果；新輔助化療、放療的組織病理學反應與預后呈正相關：可以達到預期的目的以提高手術切除率，減少術中播散可能性，降低腫瘤細胞活性；消除潛在的微轉移灶，降低術后轉移復發(fā)的可能；術前通過可測量病灶及術后標本準確判定臨 床緩解率和病理學有效率；新輔助治療可剔除不宜手術治療的患者。新輔助化療使進展期胃癌治療的效 果得到顯著改善，Wilke等1和Plukk

3、er 2的II期臨床試驗發(fā)現(xiàn)，NACT能夠使原剖腹探查無法切除的胃癌獲得30%-50%勺再切除率，這些再切除患者的中位生存期為24個月，遠高于原無法切除患者小于6個月的生存期。胃癌的腹膜轉移和復發(fā)占所有胃癌術后復發(fā)的半數(shù)以上，而腹膜轉移者的5年生存率低于20%臨床所遇腹膜轉移患者多數(shù)在已出現(xiàn)腹水、盆腔腫塊或腸梗阻時才得以確診，已失去治 療最好時機，故胃癌腹膜轉移的早期診斷和治療具有重要意義。腹膜轉移的關鍵因素是腹腔內脫落的 癌細胞和腹膜微轉移灶的存在。微轉移是指在手術治療時已經(jīng)存在的各種機體組織、及細胞移植物中 的腫瘤殘留，是用常規(guī)形態(tài)學診斷技術不能檢測出的、隱匿在原發(fā)灶以外的轉移。胃癌腹膜微

4、轉移指 術前或術中常規(guī)檢查難以發(fā)現(xiàn)的，單個癌細胞或一小簇癌細胞構成的種植于腹膜的微小轉移。胃癌腹膜轉移發(fā)生的途徑和步驟可能為:1.原發(fā)灶的腫瘤細胞穿透漿膜，脫落到腹腔內，形成高度生物活性的游離腫瘤細胞。2.在一些因子的介導下粘附在腹膜上。3.在基質消化酶和相關因子的作用下，腫瘤細胞向腹膜組織浸潤。4.腫瘤細胞不斷增值，形成種植結節(jié)3。前3個階段為微轉移階段，肉眼不可見，亦無法用影像學方法或常規(guī)HE染色診斷，須通過免疫組織化學或PCR等方法檢測腫瘤特異性標志物。第 4階段已經(jīng)形成肉眼或影像學檢查可見的轉移。近年來，組織化學和分子生物學技術 的迅速發(fā)展使得微轉移領域也有了較快的發(fā)展；隨著免疫組化和

5、(RT-PCR)方法的應用越來越趨向于成熟化和規(guī)范化，微轉移檢測領域日益受到重視，腫瘤微轉移的檢測可望成為腫瘤患者的常規(guī)檢查。目前對于胃癌腹膜微轉移診斷的研究多集中在對腹腔內脫落癌細胞（ECC）的研究，其中最簡便、常用的是腹腔灌洗液細胞學檢查印，但是PLC的陽性率低。隨著免疫細胞化學和逆轉錄一聚合酶鏈反應（reverse tran scriptio n-polymerase chain reacti on, RT-PCR）方法的發(fā)展和應用，ECC 的檢出率大大提高。但腹腔內脫落的癌細胞必須粘附于腹膜、著床并增殖方可形成微轉移灶和轉移灶。所以腹膜 組織內種植癌細胞的檢測，可以更直觀地證實胃癌腹膜

6、微轉移的存在。目前對于胃癌腹膜微轉移的研究已經(jīng)越來越多，但大多數(shù)都是針對腹腔沖洗液、腹腔脫落細 胞進行研究；術中取腹膜組織進行檢測的，較少報道，而像本試驗一樣，術中多處取材，取橫結腸系膜 前葉、網(wǎng)膜囊后壁近胰腺上緣處、胰腺被膜、盆底腹膜組織，檢測胃癌腹膜微轉移者，尚無報道。本 試驗證實免疫組化法檢測細胞角蛋白CK20能夠檢測胃癌腹膜微轉移，并為胃癌根治術術式的胃癌細胞比較容易通過脫落種植，淋巴轉移等途徑擴散到胃周系膜組織內。如果能在在胃癌根治術中對多處腹膜組織進行活檢，行免疫組化染色，檢測CK20,并與常規(guī)HE染色及PLC檢查結果相比較。結果表明，雖然常規(guī)HE染色檢查并不能發(fā)現(xiàn)，實際上橫結腸系

7、膜前葉、胰腺被膜和胰腺上方的網(wǎng)膜囊后壁等 處組織內確實已存在微轉移灶，以保障手術的徹底性腹腔化療是一操作簡單而行之有效的治療方法，能改善經(jīng)靜脈化療無法完成的腹腔內游離癌細胞陽性和鏡下腹膜轉移患者的抗腫瘤果，可治療進展期 胃癌術后腹腔殘存微小癌灶，并防止腹腔復發(fā)。可以通過術中腹腔內置化療藥物緩釋劑或術后通過留 置導管腹腔內給藥。腹腔化療目前尚無統(tǒng)一的用藥標準，正逐步由單一用藥向聯(lián)合用藥發(fā)展。腹腔化 療一般很少發(fā)生嚴重并發(fā)癥，與靜脈化療相比，其全身并發(fā)癥及副作用的發(fā)生率較低，但局部并發(fā)癥 的發(fā)生率較高，應注意預防（刑會軍）及早診斷胃癌腹膜微轉移，對于胃癌復發(fā)和預后的判斷及指導臨床治療有著極其重要的

8、意義。臨床所見的胃癌多為進展期胃癌，約50%勺患者術后可發(fā)生腹膜轉移 4。發(fā)生腹膜轉移的患者對靜脈輔助化療、放療等治療手段均不敏感，生存率較低。故及早現(xiàn)腹膜微轉移，早期治療，預防和阻 斷腹膜轉移的發(fā)生顯得尤為重要，而對于已發(fā)生腹膜轉移的患者，可通過減瘤手術配合腹腔化療，以 期延長患者的生存時間。1 Wilke H, Preusser P, Fi nk U, et al. Preoperative chemotherapy in locally adva need and non resectable gastric can cer:a phase II study with etoposide

9、, doxorubici n, and cisplatin J . J Clin Oncol,1989,7:1318-1326.2 Plukker JT, Mulder NH, Sleijfer DT, et al, Chemotherapy and surgery for locally advaneed cancer of the cardia and fun dus: phase II studywith methotrexate and 5-fluorouracill J .Br J Surg, 1991,78: 955-958.3 吳晴，程海霞，李兆申.疾病分冊.2005, 25 (

10、3):胃癌腹膜微轉移的基因研究進展J.國外醫(yī)學.消化139-143.4 TanakKumagai K,Shimizu K,et al. Peritonealmetastasis in gastric cancer with particularreference to lymphatic adva nceme nt ;extra no dal in vasi on is agni fica nt risk factor forperit on eal metastasis.J Surg On co1,2000,75:165-171.二、研究內容研究目標、研究內容、創(chuàng)新之處和擬解決的關鍵問題本研

11、究在胃癌根治術中對多處腹膜組織進行活檢，行免疫組化染色，檢測CK20,并與常規(guī)HE染色及PLC檢查結果相比較。雖然常規(guī)HE染色檢查并不能發(fā)現(xiàn)，胰腺被膜、橫結腸系膜前葉、和胰腺上方的網(wǎng)膜囊后壁等處組織內確實已存在微轉移灶，并且微轉移發(fā)生概率與腫瘤大小、侵透漿膜等因素相 關。因此對于進展期胃癌，尤其是腫瘤較大、侵透漿膜者，應該剝離橫結腸系膜前葉、胰腺被膜的網(wǎng) 膜囊后壁，爭取做到網(wǎng)膜囊完整切除，以保證手術的根治性。胃癌腹膜轉移發(fā)生的途徑和步驟可能為:1.原發(fā)灶的腫瘤細胞穿透漿膜，脫落到腹腔內，形成高度生物活性的游離腫瘤細胞。2.在一些相關因子的介導下粘附在腹膜上。3.在基質消化酶和相關因子的作用下，

12、腫瘤細胞向腹膜組織浸潤。4.腫瘤細胞不斷增值，形成種植結節(jié)。第4階段已經(jīng)形成肉眼或影像學檢查可見的轉移，并可由常規(guī)病理檢查確定。前3個階段為微轉移階段，肉眼不可見，亦無法用影像學方法或常規(guī) HE染色診斷，必須通過免疫組織化學或PCR等方法檢測腫瘤特異性標志物。近年來，組織化學和分子生物學技術的迅速發(fā)展使得微轉移領域也有了較快的發(fā)展；隨著免疫組化和逆轉錄一聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法的應用越來越趨向于成熟化和規(guī)范化，微轉移檢測領域日益受到重視， 腫瘤微轉移的檢測可望成為腫瘤患者的常規(guī)檢查。雖然取腹腔沖洗液檢查具有操作簡便、花費較少等優(yōu)點，但無論是細胞學檢查、化學發(fā)光酶聯(lián)免 疫法或RT-PCR

13、技術，僅僅只是確定游離癌細胞的存在，這些檢測方法通胃癌術中取腹膜組織檢測微轉移的研究國內外較少報道，是近年來比較新的研究領域。術中取材部位有直腸膀膚陷凹（直腸子宮陷凹）、橫結腸系膜、大網(wǎng)膜等，檢測方法主要有免疫組織化學方法和RT-PCR取腹膜組織檢測胃癌腹膜微轉移，其陽性率一般低于取腹腔灌洗液用同種方法檢測的結果。這是因為腹膜取材具有一定的局 限性，但不能確診腹膜微轉移游離的腫瘤細胞必須經(jīng)過粘附、降解腹膜細胞外基質、著床于腹膜間皮 組織并增殖才能形成腹膜微轉移另外脫落的腫瘤細胞必須經(jīng)過粘附、浸潤、增值等階段才能形成腹膜微轉移。因此，取腹膜組織檢測可以直觀地證實腹膜微轉移灶的存在。過確定游離癌細

14、胞的存在， 對腹膜轉移、復發(fā)有一定的預測價值本研究于胃癌根治術中自橫結腸系膜前葉、網(wǎng)膜囊后壁近胰腺上緣處、盆底腹膜處取活，用免疫 組化方法檢測細胞角蛋白CK20,研究胃癌患者腹膜微轉移的情況，胃癌根治手術經(jīng)過一個多世紀的發(fā)展已經(jīng)相當成熟，近年來在進展期胃癌根治術中，剝離橫結腸系膜前葉和胰腺被膜己逐漸成為常規(guī)， 并有學者提出了胃全系膜切除和胃癌根治術中網(wǎng)膜囊完整切除的概念，以求達到根治。胃全系膜切除 術是指完整切除胃腹側、背側系膜內所有的組織結構，包括胃及其血管和淋巴脂肪組織。網(wǎng)膜囊完整 切除是指將網(wǎng)膜囊的后壁與前壁及胃（包括周圍淋巴脂肪組織）。但胃周系膜內是否存胃癌微轉移灶分析腹膜微轉移與胃癌

15、大小、侵透膜與否、腫瘤分期、淋巴結轉移等臨床因素的關系，探討胃癌腹膜微 轉發(fā)生的因素和微轉移的規(guī)律，為手術方式選擇、判斷預后及建立個體化的術后治療方案提供更可靠 的依據(jù)。鑒于胃癌行淋巴結清掃一直缺乏較為可靠的理論依據(jù)，且剝離操作易進入錯誤分離層面，造成出 血、系膜剝離不全、術后淋巴漏、胰漏等，故對于進展期胃癌是否應該行此術式值得探討。胃周圍系 膜表面上無關聯(lián)，但在胚胎解剖學上具有高度的組織同源性。在胚胎時期，胃腹側系膜在前腸旋轉中 形成小網(wǎng)膜，胃背側系膜的前后兩層則廣泛覆蓋胃、脾、胰腺，衍化成為大網(wǎng)膜、胃脾韌帶、胰腺被 膜等。在胚胎時期前腸旋轉中，胃周圍系膜與系膜、系膜與臟器和后腹壁相互靠近并

16、貼在一起發(fā)生融 合，形成潛在的，分布廣泛的，充滿淋巴組織和疏松結締組織的間隙|，容許惡性病變沿其擴散、蔓延。胃癌細胞比較容易通過脫落種植，淋巴轉移等途徑擴散到胃周系膜組織內。如果能在在胃癌根治術中對多處腹膜組織進行活檢，行免疫組化染色，檢測CK20,并與常規(guī)HE染色及PLC僉查結果相比較。結果表明，雖然常規(guī) HE染色檢查并不能發(fā)現(xiàn)，實際上橫結腸系膜前葉、胰腺被膜和胰腺上方的 網(wǎng)膜囊后壁等處組織內確實已存在微轉移灶，并且微轉移發(fā)生概率與腫瘤大小、侵透漿膜等因素相關。 因此對于進展期胃癌，尤其是腫瘤較大、侵透漿膜者，應該剝離橫結腸系膜前葉、胰腺被膜和胰腺上 方的網(wǎng)膜囊后壁，爭取做到網(wǎng)膜囊完整切除，

17、以保證手術的根治性。另外淋巴轉移途徑在腹膜微轉移 中占有一定的地位，胃癌根治術中必須嚴格行D2淋巴結清掃。三、擬采取的研究方法、技術路線選取術前影像學檢查及手術中探查未發(fā)現(xiàn)周圍臟器侵犯（如：肝臟、胰腺、橫結腸及其系膜等）、遠處轉移的患者胃癌腫瘤標本?；颊咝g中為減少腹腔游離癌細胞和脫落種植轉移，均實行腹腔高溫灌 洗，術后進行常規(guī)病理學檢查以及脫落細胞學和腹腔灌洗液檢查，腹腔沖洗液細胞學檢查采用轉速控 制在1600轉/分的低速離心機，上清液去除，沉渣圖片行瑞氏染色，鏡下觀察。檢測到癌細胞即為陽 性。并去腹膜組織做 HE染色，標本來自橫結腸系膜、男性直腸膀胱陷凹（女性為直腸子宮陷凹）以及 網(wǎng)膜囊后壁

18、，采用免疫組化的方法（免疫組化染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化酶連接（sP）法）檢查CK20,與腹腔灌洗液體細胞學檢查做對比。CK20陽性者，視為轉移，所取不同部位的腹膜組織有一處陽性者即認為發(fā)生了腹膜微轉移。CK20存在于上皮來源的腫瘤之中，表達于細胞漿，以胞漿染為淡黃色到深棕黃色，染色強度明顯高于背景者為陽性。凡無黃色染色且顯色強度與背景無明顯差別者 為陰性（圖5）。本試驗中若HE染色陰性，而CK20陽性者，即視為該處腹膜組織發(fā)生了微轉移。同一病 人所取的橫結腸系膜前葉、網(wǎng)膜囊后壁近胰腺上緣處、直腸膀膚陷凹（直腸子宮陷凹）腹膜組織中有一處或一處以上發(fā)生微轉移者，視為發(fā)生了腹膜微轉移。比較免疫組化Ck20腹膜微轉移的陽性率與腹腔灌洗液細胞學檢查的陽性率。應用SPSS統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。是否發(fā)生腹膜微轉移與腫瘤侵漿膜與否，淋巴結轉移等臨床資料的分析采用卡方檢驗。四、考核指標預期成果隨著免疫組織學和分子生物學技術的不斷進步，胃癌微轉移的檢測手段也越來越可靠，這將為臨床工作中判斷預后、選擇術式、確定淋巴結清掃范圍、術后確立分期及建立個體化的化療方案提供更可靠的依據(jù)，在胃癌的診治中發(fā)揮更加重要的作用。由于大量文獻中所