常規(guī)反相分析方法開(kāi)發(fā)的流程（參考模板）

1、傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對(duì)您有幫助，可雙擊去除！1.回顧樣品信息樣品的分子量、pka、酸堿性流動(dòng)相需要緩沖鹽嗎？酸性、堿性化合物需要加緩沖鹽來(lái)控制流動(dòng)相pH樣品需要預(yù)處理嗎？有損壞色譜柱的、干擾檢測(cè)的成分則預(yù)處理2.明確分離目標(biāo)足夠的分離度、最短的分離時(shí)間、精確度等3.展開(kāi)起始的分離色譜柱： 100mm*4.6mm*3um，C18或者C8（或者其他大小和內(nèi)徑）流速：2ml/min柱溫： 30或35流動(dòng)相：樣品不含酸和堿： 乙腈和水流動(dòng)相：樣品含酸和堿：乙腈和（pH2.5-3.0）（10-25mmol/l）緩沖鹽根據(jù)樣品pka選擇流動(dòng)相的pH（流動(dòng)相的pH在樣品的pka1.5的外），根據(jù)流

2、動(dòng)相pH選擇緩沖液，盡量選擇pka與流動(dòng)相的pH相等的緩沖鹽，濃度經(jīng)常為5-50mmol/l。磷酸鹽、乙酸鹽、甲酸鹽都是在pH小于8時(shí)最常用的緩沖液。梯度：10分鐘內(nèi)5%100%B3.1.遇到的問(wèn)題：過(guò)早洗脫（說(shuō)明樣品的極性大，離子化的酸或堿）可以減少起始的%B或者使用起始梯度停留改變流動(dòng)相的pH增強(qiáng)他們的保留（減少分子的離子化）在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑使用正相色譜或者HILIC過(guò)遲洗脫（樣品的極性很?。┦褂糜H酯性較弱的色譜柱（降低H值，見(jiàn)附件1）使用正相色譜復(fù)雜的樣品（樣品大于15種成分）如果都是目標(biāo)化合物，可使用2D色譜幾個(gè)化合物是目標(biāo)成分：樣品先預(yù)處理4優(yōu)化梯度色保留因子k起始的分離條件

3、對(duì)于大多是小分子樣品（分子量1000）一般能使k值大約為55.優(yōu)化梯度選擇性梯度時(shí)間和柱溫是首選。建議第二個(gè)方法將梯度時(shí)間延長(zhǎng)2-3倍，在沒(méi)有分開(kāi)的情況下可以進(jìn)一步延長(zhǎng)時(shí)間獲證增加柱溫為505.1：加入步驟5的分離度2，或者需要增短時(shí)間用甲醇替代乙腈重復(fù)步驟1-4更換色譜柱重復(fù)步驟1-4考慮使用分段梯度6.調(diào)整梯度范圍和形狀A(yù):考慮最佳的起始和最終的%B值，從而在分離度Rs合理的前提下實(shí)現(xiàn)最短的實(shí)驗(yàn)時(shí)間B:對(duì)于“較臟的”的樣品，加入坡度較大的梯度分段至100%B（例如在5min至100%B，維持3-5min等）C:加入坡度較大的梯度分段來(lái)加速色譜圖后端的、間隔較寬的色譜圖峰的洗脫傳播優(yōu)秀Wor

4、d版文檔 ，希望對(duì)您有幫助，可雙擊去除！D:加入的等度度停留從而改善梯度前洗脫出來(lái)的色譜峰之間的分離度7.以步驟5、6中獲得的最佳的分離效果為基礎(chǔ)，平衡分離度和運(yùn)行時(shí)間改善色譜柱的條件色譜柱的大小、粒徑、流速、樣品的分子量運(yùn)能影響色譜柱的塔板數(shù)。粒徑和色譜柱的大小通常在方法建立之前已選好。增長(zhǎng)色譜柱的長(zhǎng)度通常能增加塔板數(shù)、分離度、實(shí)驗(yàn)時(shí)間。在梯度洗脫中，使tgF/L保持恒定，從而使保留因子K*保持恒定。保留因子K：tg:梯度時(shí)間 ；F：流速 ；Vm：死體積 ；：梯度范圍 ； S：分子量在100-500Da的樣品S值為4 。8.測(cè)量連續(xù)的陽(yáng)陽(yáng)機(jī)那樣之間，色譜柱的必要平衡時(shí)間以上面選好的實(shí)驗(yàn)條件開(kāi)展連續(xù)幾次同樣的分離，并同時(shí)改變進(jìn)樣之間的平衡時(shí)間；選擇能給出合理分離效果的的最短的平衡時(shí)間一般使用10個(gè)或者以上的色譜柱體積的其實(shí)流動(dòng)相