HBsAg免疫對(duì)小鼠 T、B細(xì)胞功能的影響.ppt

1、 實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 流流 程程 1W 1.雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) OVA+CFA加強(qiáng)免疫加強(qiáng)免疫 小鼠小鼠500 l 摘眼球取血摘眼球取血 無(wú)菌取脾和胸腺無(wú)菌取脾和胸腺 分離血清分離血清 2W 取脾和胸腺取脾和胸腺 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 生理鹽水加強(qiáng)免疫小生理鹽水加強(qiáng)免疫小 鼠鼠500 l 2W After 1W 對(duì)照組對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)組 抗體效價(jià)抗體效價(jià) 增殖功能增殖功能 免疫血清分離過(guò)程免疫血清分離過(guò)程 摘眼球取血 RT for 2hrs Rotation 3000rpm for 20min Transfer serum

2、to a new EP Double diffusion Store at 4 ELISA 1.5ml EP 1.1.小鼠脫臼處死，用酒精棉球擦拭皮毛消毒。小鼠脫臼處死，用酒精棉球擦拭皮毛消毒。 2.2.于超凈臺(tái)內(nèi)取出脾和胸腺組織于超凈臺(tái)內(nèi)取出脾和胸腺組織( (各各1/2)1/2)，分別放入預(yù)先盛有，分別放入預(yù)先盛有2 2ml ml IMDMIMDM培養(yǎng)液的平皿內(nèi)。培養(yǎng)液的平皿內(nèi)。 3.3.將將3-43-4層紗布覆蓋到組織上，用直頭鑷子固定組織，用彎頭鑷子輕層紗布覆蓋到組織上，用直頭鑷子固定組織，用彎頭鑷子輕 壓組織，將其搗碎。然后用壓組織，將其搗碎。然后用10001000l l加樣器隔著紗布

3、將細(xì)胞懸液吸加樣器隔著紗布將細(xì)胞懸液吸 出，放入出，放入1.51.5ml EPml EP管中。管中。 1.1.取上述制備好的細(xì)胞懸液混勻后取出取上述制備好的細(xì)胞懸液混勻后取出2020l l，加到盛有加到盛有980980l l計(jì)數(shù)液計(jì)數(shù)液 的的EPEP管中，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)方法見(jiàn)后。管中，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)方法見(jiàn)后。 2.2.調(diào)細(xì)胞濃度至調(diào)細(xì)胞濃度至1 110107 7/ /mlml，所需量為所需量為1.51.5mlml，設(shè)需要的細(xì)胞懸液體積設(shè)需要的細(xì)胞懸液體積 為為AmlAml, ,可按公式：可按公式：?/?/mlmlA=1.5A=1.51 110107 7 4 v細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)：

4、1.按圖所示加板。按圖所示加板。 2.2.將板做好標(biāo)記，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，然后放于將板做好標(biāo)記，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，然后放于37 5%C037 5%C02 2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱中， 培養(yǎng)培養(yǎng)4848小時(shí)。小時(shí)。 vMTT摻入：摻入：（隔一天（隔一天 下午下午2:00） 1.1.在終止培養(yǎng)前在終止培養(yǎng)前2 2小時(shí)，在顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況。小時(shí)，在顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況。 2.2.每孔內(nèi)加入每孔內(nèi)加入MTTMTT（5mg/ml) 105mg/ml) 10l l，加完后輕輕，加完后輕輕搕搕板，使板，使MTTMTT和細(xì)胞混勻。和細(xì)胞混勻。 3.3.在在37 5%C037 5%C02 2培

5、養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 2小時(shí)，然后離心小時(shí)，然后離心2000rpm2000rpm，5min5min，輕輕棄，輕輕棄 去上清，（注意不要將孔底部的顆粒物棄出）。去上清，（注意不要將孔底部的顆粒物棄出）。 4.4.加入加入100100l l 二甲亞砜（二甲亞砜（DMSO)DMSO)，將顆粒溶解，將顆粒溶解。 （隔一天（隔一天 下午下午4:004:00） v結(jié)果測(cè)定：結(jié)果測(cè)定： 1.1.結(jié)果測(cè)量：用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值：結(jié)果測(cè)量：用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值：A570nmA570nm（用空白孔調(diào)零），記錄結(jié)（用空白孔調(diào)零），記錄結(jié) 果。果。 2.2.結(jié)果判定：結(jié)果判定： SISI（刺激指數(shù)）（刺激

6、指數(shù)）=Con A=Con A刺激孔刺激孔 A A值值 / / 對(duì)照孔對(duì)照孔A A值值 v八個(gè)人一塊培養(yǎng)板，兩人加脾，兩人加胸腺八個(gè)人一塊培養(yǎng)板，兩人加脾，兩人加胸腺 v每孔加入每孔加入100 l調(diào)好的細(xì)胞懸液調(diào)好的細(xì)胞懸液 v1-3孔加入孔加入10%FCS-IMDM 培養(yǎng)液，培養(yǎng)液， 100 l v4-6孔加入孔加入2.5 g/ml的的Con A, 100 l v7-9孔加入孔加入5 g/ml的的Con A, 100 l v10-12孔加入孔加入10 g/ml的的Con A, 100 l NOTE:ConA用用10%FCS-IMDM培養(yǎng)液配制培養(yǎng)液配制 1-34-67-910-12 sple

7、en cell+ 10% IMDM spleen cell+ ConA 2.5g/ml spleen cell+ ConA 5g/ml spleen Cell+ ConA 10g/ml spleen cell+ 10% IMDM spleen cell+ ConA 2.5g/ml spleen cell+ ConA 5g/ml spleen Cell+ ConA 10g/ml thymus cell+ 10% IMDM thymus cell+ ConA 2.5g/ml thymus cell+ ConA 5g/ml thymus Cell+ ConA 10g/ml thymus cell+

8、10% IMDM thymus cell+ ConA 2.5g/ml thymus cell+ ConA 5g/ml thymus Cell+ ConA 10g/ml N.S. OVA N.S. OVA 返回返回 v八個(gè)人一塊培養(yǎng)板，兩人加脾，兩人加胸腺八個(gè)人一塊培養(yǎng)板，兩人加脾，兩人加胸腺 v每孔加入每孔加入100 l調(diào)好的細(xì)胞懸液調(diào)好的細(xì)胞懸液 v1-3孔加入孔加入10%FCS-IMDM 培養(yǎng)液，培養(yǎng)液， 100 l v4-6孔加入孔加入2.5 g/ml的的Con A, 100 l v7-9孔加入孔加入5 g/ml的的Con A, 100 l v10-12孔加入孔加入10 g/ml的的Con A, 100 l 1-34-67-910-12 spleen cell+ 10% IMDM spleen cell+ ConA 2.5g/ml spleen cell+ ConA 5g/ml spleen Cell+ ConA 10g/ml spleen cell+ 10% IMDM spleen cell+ ConA 2.5g/ml spleen cell+ ConA 5g/ml spleen Cell+ ConA 10g/ml thymus cell+ 10% IMDM thymus cell+ ConA 2.5g/ml thymus cell+ ConA 5g/m