腫瘤藥物敏感實驗課件

1、腫瘤藥物敏感實驗1 腫瘤藥物敏感實驗腫瘤藥物敏感實驗 腫瘤藥物敏感實驗2 化療的重要性化療的重要性 自19461946年GillmanGillman和PhillipPhillip報道氮芥類 藥物治療造血系統(tǒng)腫瘤以來，化學治療巳取 得很大的進步。目前化學治療已使絨癌、惡 性淋巴瘤、睪丸精原細胞瘤、小細胞肺癌等 多種惡性腫瘤獲得治愈的機會，大多數(shù)惡性 腫瘤能得到緩解，化療在惡性腫瘤的治療中 具有不可替代的地位。 腫瘤藥物敏感實驗3 腫瘤化療的局限性腫瘤化療的局限性 腫瘤的化學治療在半個世紀 以來，雖然取得顯著進展，但臨 床抗腫瘤藥物治療的總有效率并 不高，阻礙化學治療取得更好療 效的原因眾多，主要

2、包括： 腫瘤藥物敏感實驗4 抗腫瘤藥物研究表明，即使是相同 組織學類型的腫瘤對同一抗腫瘤藥物 的反應也并不盡一致，對不同臟器或 不同組織學類型的腫瘤采用相同的用 藥方案，效果更是千差萬別。目前大 多數(shù)化療是采用的對某種臟器既定的 聯(lián)合方案,仍有一定的盲目性。 1.1. 現(xiàn)行化療的盲目性現(xiàn)行化療的盲目性 腫瘤藥物敏感實驗5 2.2.化學治療的抗藥性化學治療的抗藥性 有些腫瘤對某些藥物存在先 天耐藥,還有些腫瘤經(jīng)化療緩解， 腫瘤敏感株殺滅，耐藥株成為 復發(fā)的根源，而且對以后的化 療抵抗。 腫瘤藥物敏感實驗6 3. 抗癌藥物的毒性抗癌藥物的毒性 所有抗腫瘤藥物在殺傷腫瘤細胞 的同時，也殺傷正常的組織

3、細胞，尤 其是增殖旺盛的骨髓造血細胞和胃腸 道細胞。期望通過增大劑量、增加用 藥品種、縮短間隔時間的方法來提高 抗癌效果，則將進一步加重毒性作用。 腫瘤藥物敏感實驗7 如何解決這些問題？如何解決這些問題？ 腫瘤化療個體化腫瘤化療個體化: : 研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)藥敏 檢測結果指導選藥，有效率可在原來固定 化療方案的基礎上提高一倍以上，于是提 出了腫瘤化療個體化的概念(即預見性化 療)。根據(jù)個體腫瘤敏感性檢測的結果，選 用敏感的藥物的聯(lián)合方案，無疑將會大大 提高腫瘤的治療水平。 腫瘤藥物敏感實驗8 腫瘤藥敏的可行性腫瘤藥敏的可行性 七十年代細胞培養(yǎng)技術的突破，新型培 養(yǎng)材料、培養(yǎng)基的問世。 19831

4、983年MosmannMosmann建立了MTTMTT法，方法簡便， 設備要求不高，檢測時間短，便于在臨 床上廣泛開展。 新的抗癌藥不斷問世，同一種腫瘤有多 種聯(lián)合化療方案可供選擇。 腫瘤藥物敏感實驗9 腫瘤藥敏的方法學腫瘤藥敏的方法學 裸鼠皮下移植裸鼠皮下移植 裸鼠腎包膜下移植裸鼠腎包膜下移植 裸鼠原位移植裸鼠原位移植 腫腫 瘤瘤 細細 胞胞 藥藥 敏敏 體內(nèi)法體內(nèi)法 體外法體外法 l染料排斥法染料排斥法 l集落形成法集落形成法 l同位素法同位素法 l四唑藍比色法四唑藍比色法 腫瘤藥物敏感實驗10 裸鼠腎包膜下移植裸鼠腎包膜下移植 裸鼠腎包膜下移植實驗是腫瘤細 胞藥敏體內(nèi)實驗最常用的方法，

5、但由于裸鼠需要在無菌條件下飼 養(yǎng)，而且腎包膜下移植實驗操作 復雜，實驗周期長，不易在臨床 廣泛開展。 腫瘤藥物敏感實驗11 染料排斥實驗染料排斥實驗 原理是細胞死亡后膜通透性增加，染 料通過細胞膜而使細胞著色，故通過 計數(shù)未著色細胞可計算出藥物的殺傷 率。但由于某些受殺傷尚未死亡的細 胞也不易著色，故假陰性率較高。另 外在計數(shù)時主觀的因素會出現(xiàn)較大的 誤差，目前較少應用。 腫瘤藥物敏感實驗12 集落形成法集落形成法 集落法(Human Tumor Cell Cloning Assay, HTCA）腫瘤組織由增殖和非增殖細胞組 成，其中僅有 1具有旺盛的增殖能力， 是腫瘤浸潤擴散和復發(fā)的根源。

6、這種細 胞具有形成細胞集落的能力,故又稱為腫 瘤干細胞。 測定腫瘤干細胞對藥物的敏 感性符合臨床藥物治療的需要。 腫瘤藥物敏感實驗13 集落形成法方法學集落形成法方法學 雙層瓊酯法：底層 加入0.5% 0.5% 的瓊脂培 養(yǎng)液, 上層加含腫 瘤細胞懸液的0.3 % 0.3 % 瓊脂培養(yǎng)液。上層 培養(yǎng)液供腫瘤細胞 生長，下層防止細 胞貼壁及成纖維細 胞的過度生長。 玻璃毛細管法: 培養(yǎng) 基0.60.6mlml，瘤細胞懸液 0.10.1mlml,抗癌藥0.1 ml, 1瓊脂糖0.2ml加在 一起混勻后向玻璃毛 細管內(nèi)加入5050ll，冷 卻凝固后置37二氧 化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 腫瘤藥物敏感實驗14

7、 集落形成法的優(yōu)點集落形成法的優(yōu)點 抑制纖維母細胞的增殖，不受腫瘤細胞 以外的細胞的影響。 下層滋養(yǎng)層可加入各種輔助分子，更利 于腫瘤的生長。 直接測定藥物對腫瘤細胞中最活躍的成 分腫瘤干細胞的影響。 腫瘤藥物敏感實驗15 集落形成法的缺點集落形成法的缺點 高純度單細胞懸液的制備困難。 所形成的細胞集落并非都是腫瘤 細胞集落。 成功率低，有一定的難度。 培養(yǎng)周期長，需10天左右。 腫瘤藥物敏感實驗16 放射性同位素標記 的核苷酸容易摻入 DNA和RNA分子中 放射性同位素發(fā)靈 敏度高，重復性好。 時間短，可較快地 得到結果。 儀器設備要求高。 由于具有放射性，故 操作時需要一定的防 護措施。

8、廢料需特別處理。 放射同位素法放射同位素法 3 3H H的 的射線能量低，分辨率高，半衰期長達射線能量低，分辨率高，半衰期長達 1212年年, ,3 3H H標記胸腺嘧啶核苷標記胸腺嘧啶核苷( (3 3HTdR)HTdR)為最常用。為最常用。 腫瘤藥物敏感實驗17 3 3HTdR HTdR摻入法摻入法 用培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為用培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1 110105 5/ /mlml。將將 此濃度的細胞接種于微量培養(yǎng)板，每孔此濃度的細胞接種于微量培養(yǎng)板，每孔 100100ll，每每3 3孔為一組，加入孔為一組，加入100100ll含有化含有化 療藥的培養(yǎng)基，培養(yǎng)療藥的培養(yǎng)基，培養(yǎng)5252小時，加入

9、小時，加入2020l l 3 3HTdR, HTdR,實驗結束后，吸棄上清，加入實驗結束后，吸棄上清，加入0.30.3 胰蛋白酶消化細胞，用多頭細胞收集器收胰蛋白酶消化細胞，用多頭細胞收集器收 集細胞。最后用液體閃爍計數(shù)儀測定每分集細胞。最后用液體閃爍計數(shù)儀測定每分 鐘脈沖數(shù)（鐘脈沖數(shù)（CPMCPM）值。值。 腫瘤藥物敏感實驗18 四唑藍比色法（四唑藍比色法（MTTMTT法）法） 原理：活細胞內(nèi)線粒體脫氫酶能將四甲基偶氮唑原理：活細胞內(nèi)線粒體脫氫酶能將四甲基偶氮唑 鹽轉化為藍紫色結晶物鹽轉化為藍紫色結晶物( (formazan)formazan)，用二甲亞砜用二甲亞砜 （DMSODMSO）溶解

10、后，可在酶標儀上記錄吸光度。溶解后，可在酶標儀上記錄吸光度。 優(yōu)點優(yōu)點:1.:1.操作簡便，設備要求不高，時間短。操作簡便，設備要求不高，時間短。 2. 2.實驗精確，重復性好，而且無主觀人為實驗精確，重復性好，而且無主觀人為 因素影響，臨床符合率因素影響，臨床符合率8585。 3. 3.成功率高，約為成功率高，約為80809090 腫瘤藥物敏感實驗19 MTTMTT法操作方法法操作方法 用培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為用培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1 110105 5/ /mlml后接后接 種于微量培養(yǎng)板，每孔種于微量培養(yǎng)板，每孔100100，每組設三個平，每組設三個平 行孔，加入行孔，加入100100l l

11、 含有化療藥的培養(yǎng)基含有化療藥的培養(yǎng)基, ,置置 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6868小時，加入小時，加入2020l MTTl MTT后再后再 培養(yǎng)培養(yǎng)4 4小時小時, ,吸棄上清，每孔加二甲亞砜吸棄上清，每孔加二甲亞砜 200200l,l,用微量震蕩器震蕩用微量震蕩器震蕩, ,使結晶產(chǎn)物充分使結晶產(chǎn)物充分 溶解，在自動酶標儀上比色，測出波長溶解，在自動酶標儀上比色，測出波長 570570nmnm處的吸光度，最后計算細胞殺傷活性。處的吸光度，最后計算細胞殺傷活性。 腫瘤藥物敏感實驗20 MTTMTT法注意事項法注意事項 血供豐富的腫瘤組織在制取腫瘤單細胞懸血供豐富的腫瘤組織在制取腫瘤單細胞懸 液時，大量的紅細胞影響測定，可用紅細液時，大量的紅細胞影響測定，可用紅細 胞裂解液裂解紅