原代細(xì)胞的培養(yǎng)和建系

1、 第四章第四章 原代細(xì)胞的培養(yǎng)和建系原代細(xì)胞的培養(yǎng)和建系 凡是來源于胚胎、組織器官及外周凡是來源于胚胎、組織器官及外周 血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原 初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞。初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞。 凡是經(jīng)傳代方式進(jìn)行再次培養(yǎng)的細(xì)凡是經(jīng)傳代方式進(jìn)行再次培養(yǎng)的細(xì) 胞稱為傳代細(xì)胞。胞稱為傳代細(xì)胞。 若能穩(wěn)定生長(zhǎng)傳至若能穩(wěn)定生長(zhǎng)傳至10-20代以上的細(xì)代以上的細(xì) 胞可確立為細(xì)胞系。胞可確立為細(xì)胞系。 單細(xì)胞經(jīng)克隆、純化并大量擴(kuò)增所單細(xì)胞經(jīng)克隆、純化并大量擴(kuò)增所 形成的特性穩(wěn)定的細(xì)胞群體稱為細(xì)形成的特性穩(wěn)定的細(xì)胞群體稱為細(xì) 胞株或克隆細(xì)胞。胞株或克隆細(xì)胞。 第一

2、節(jié)第一節(jié) 原代細(xì)胞的取材原代細(xì)胞的取材 人和動(dòng)物細(xì)胞的取材是原代細(xì)人和動(dòng)物細(xì)胞的取材是原代細(xì) 胞培養(yǎng)成功的首要條件，直接胞培養(yǎng)成功的首要條件，直接 影響細(xì)胞的體外培養(yǎng)。影響細(xì)胞的體外培養(yǎng)。 一、取材的基本要求一、取材的基本要求 1取材要注意新鮮和保鮮取材要注意新鮮和保鮮 2應(yīng)嚴(yán)格無菌應(yīng)嚴(yán)格無菌 3防止機(jī)械損傷防止機(jī)械損傷 4去除無用組織和避免干燥去除無用組織和避免干燥 5注意組織類型、分化程度、年齡等注意組織類型、分化程度、年齡等 6作好記錄作好記錄 二、各類組織的取材技術(shù)二、各類組織的取材技術(shù) 皮膚和粘膜的取材皮膚和粘膜的取材 內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材 血液細(xì)胞的取材血液細(xì)胞的取

3、材 骨髓、羊水、胸骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材腹水細(xì)胞取材 動(dòng)物組織取材動(dòng)物組織取材 人胚體組織取材人胚體組織取材 雞（鴨）鳥類胚胎組織取材雞（鴨）鳥類胚胎組織取材 皮膚和粘膜的取材皮膚和粘膜的取材 主要取自于手術(shù)過程中的皮片，方法主要取自于手術(shù)過程中的皮片，方法 似外科取斷層皮片手術(shù)操作，但面積似外科取斷層皮片手術(shù)操作，但面積 一般一般24平方厘米。平方厘米。 內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材 內(nèi)臟除消化道外基本是無菌的，但取內(nèi)臟除消化道外基本是無菌的，但取 材時(shí)要明確和熟悉所需組織的類型和材時(shí)要明確和熟悉所需組織的類型和 部位，實(shí)體瘤取材時(shí)要取腫瘤細(xì)胞豐部位，實(shí)體瘤取材時(shí)要取腫瘤細(xì)胞豐

4、 富的區(qū)域，要避開破潰、壞死液化部富的區(qū)域，要避開破潰、壞死液化部 分，以防污染，盡量去除混雜的結(jié)締分，以防污染，盡量去除混雜的結(jié)締 組織。組織。 血液細(xì)胞的取材血液細(xì)胞的取材 血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的取材，一般多抽血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的取材，一般多抽 取靜脈外周血，或從淋巴組織中（如取靜脈外周血，或從淋巴組織中（如 脾、扁桃體、胸腺、淋巴結(jié)等）分離脾、扁桃體、胸腺、淋巴結(jié)等）分離 細(xì)胞，取材時(shí)應(yīng)注意抗凝。細(xì)胞，取材時(shí)應(yīng)注意抗凝。 骨髓、羊水、胸骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材腹水細(xì)胞取材 嚴(yán)格無菌，注意抗凝，還要盡快分嚴(yán)格無菌，注意抗凝，還要盡快分 離培養(yǎng)，離心后，用無鈣、鎂離培養(yǎng)，離心后，用無鈣、鎂PB

5、S洗洗 兩次，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培兩次，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培 養(yǎng)，不宜低溫存放。養(yǎng)，不宜低溫存放。 動(dòng)物組織取材動(dòng)物組織取材 1、鼠胚組織取材、鼠胚組織取材 首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動(dòng)首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動(dòng) 物，然后將其整個(gè)浸泡在含有物，然后將其整個(gè)浸泡在含有75%酒精的燒杯中，酒精的燒杯中， 5分鐘后（注意時(shí)間不能太長(zhǎng)，以避免酒精從口或分鐘后（注意時(shí)間不能太長(zhǎng)，以避免酒精從口或 其他通道進(jìn)入體內(nèi)，影響組織活力），取出動(dòng)物，其他通道進(jìn)入體內(nèi)，影響組織活力），取出動(dòng)物， 在消毒過的木板上可用無菌的圖釘或大頭針固定在消毒過的木板上可用無菌的圖釘或大頭針固

6、定 四肢，切開皮膚，用無菌操作法解剖取胚或用無四肢，切開皮膚，用無菌操作法解剖取胚或用無 菌止血鉗挾起皮膚、用無菌眼科剪沿軀干中部環(huán)菌止血鉗挾起皮膚、用無菌眼科剪沿軀干中部環(huán) 形剪開皮膚，用止血鉗分別挾住兩側(cè)皮膚拉向頭形剪開皮膚，用止血鉗分別挾住兩側(cè)皮膚拉向頭 尾，把動(dòng)物反包，暴露軀干，然后再固定，更換尾，把動(dòng)物反包，暴露軀干，然后再固定，更換 無菌解剖器材，采用無菌操作法解剖取出胚胎。無菌解剖器材，采用無菌操作法解剖取出胚胎。 2、幼鼠胚腎（或肺）取材、幼鼠胚腎（或肺）取材 幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部朝幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部朝 上固定在木板上，先切開游離毛皮并拉上固定在木板上

7、，先切開游離毛皮并拉 開至兩側(cè)：然后采用無菌法打開胸腔取開至兩側(cè)：然后采用無菌法打開胸腔取 肺，或背部朝上固定在木板上，先將背肺，或背部朝上固定在木板上，先將背 部毛皮切開游離并拉向兩側(cè)，然后采用部毛皮切開游離并拉向兩側(cè)，然后采用 無菌法從背部打開腹腔取腎。無菌法從背部打開腹腔取腎。 雞（鴨）鳥類胚胎組織取材步驟雞（鴨）鳥類胚胎組織取材步驟 （1）取孵化至適當(dāng)胚齡（）取孵化至適當(dāng)胚齡（912天）的胚蛋，暗處燈天）的胚蛋，暗處燈 檢，選取血管豐富、胚體有運(yùn)動(dòng)的胚蛋，用有色檢，選取血管豐富、胚體有運(yùn)動(dòng)的胚蛋，用有色 筆劃出氣室和胚體位置；筆劃出氣室和胚體位置； （2）清洗蛋殼，再用碘酒、）清洗蛋殼

8、，再用碘酒、75%酒精消毒；酒精消毒； （3）在無菌條件下采用無菌法用剪刀或中號(hào)鑷子打）在無菌條件下采用無菌法用剪刀或中號(hào)鑷子打 開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼；開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼； （4）用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚；）用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚； （5）用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無菌平）用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無菌平 皿中，解剖取材。皿中，解剖取材。 第二節(jié)第二節(jié) 原代細(xì)胞的分離和制作原代細(xì)胞的分離和制作 人或動(dòng)物體內(nèi)（或胚胎組織）由于人或動(dòng)物體內(nèi)（或胚胎組織）由于 多種細(xì)胞結(jié)合緊密，不利于各個(gè)細(xì)多種細(xì)胞結(jié)合緊密，不利于各個(gè)細(xì) 胞在體外培養(yǎng)中生長(zhǎng)繁殖，必須將胞在體外

9、培養(yǎng)中生長(zhǎng)繁殖，必須將 現(xiàn)有的組織塊充分散開，使細(xì)胞解現(xiàn)有的組織塊充分散開，使細(xì)胞解 離出來。離出來。 一、懸浮細(xì)胞的分離方法一、懸浮細(xì)胞的分離方法 組織材料若是來自血液、羊水、胸水組織材料若是來自血液、羊水、胸水 或腹水的懸液材料，最簡(jiǎn)單的方法是或腹水的懸液材料，最簡(jiǎn)單的方法是 采用采用1000r/min的低速離心的低速離心10分鐘。經(jīng)分鐘。經(jīng) 離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在 分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需 要收獲目的細(xì)胞。要收獲目的細(xì)胞。 二、實(shí)體組織材料的分離方法二、實(shí)體組織材料的分離方法 對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)

10、對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié) 合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分 分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械 分散法（物理裂解）和消化分離法。分散法（物理裂解）和消化分離法。 （一）機(jī)械分散法（一）機(jī)械分散法 方法方法: 特點(diǎn)特點(diǎn): 簡(jiǎn)便、快速，簡(jiǎn)便、快速， 但對(duì)組織機(jī)械但對(duì)組織機(jī)械 損傷大，而且細(xì)胞分散效果差，適用損傷大，而且細(xì)胞分散效果差，適用 于處理纖維成分少的軟組織。于處理纖維成分少的軟組織。 （二）消化分離法（二）消化分離法 組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊 狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作

11、用進(jìn)狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn) 一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松，一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松， 由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管 吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì) 胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán) 和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì) 胞容易貼壁生長(zhǎng)。胞容易貼壁生長(zhǎng)。 酶消化分離法酶消化分離法 酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原 酶酶 胰蛋白酶（胰

12、蛋白酶（trypsin）分散原理：胰蛋）分散原理：胰蛋 白酶是一種胰臟制品，對(duì)蛋白質(zhì)有水白酶是一種胰臟制品，對(duì)蛋白質(zhì)有水 介作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸介作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸 相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白 質(zhì)水解而使細(xì)胞分散開。質(zhì)水解而使細(xì)胞分散開。 影響胰蛋白酶作用的主要因素影響胰蛋白酶作用的主要因素 細(xì)胞類型細(xì)胞類型 酶的活力，活力通常在酶的活力，活力通常在1：200、 56C、 pH=8.0 左右時(shí)最強(qiáng)左右時(shí)最強(qiáng) 酶的濃度酶的濃度 溫度溫度 pH 無機(jī)鹽離子，鈣、鎂等有抑制作用無機(jī)鹽離子，鈣、鎂等有抑制作用 消化時(shí)間消化時(shí)間 膠原酶（膠原酶

13、（collagenase）消化法）消化法 膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來的膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來的 酶，對(duì)膠原有很強(qiáng)的消化作用。適酶，對(duì)膠原有很強(qiáng)的消化作用。適 于消化纖維性組織、上皮組織以及于消化纖維性組織、上皮組織以及 癌組織，它對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較好的消癌組織，它對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較好的消 化作用化作用。 消化分離法的操作步驟消化分離法的操作步驟 ：消化分離法的：消化分離法的 操作步驟操作步驟 剪切剪切 加液漂洗加液漂洗 消化消化 棄去消化液棄去消化液 漂洗漂洗 機(jī)械分散機(jī)械分散 消化分離法的注意事項(xiàng)消化分離法的注意事項(xiàng) （1）組織塊必須漂洗）組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、次以除去組織

14、中的鈣、 鎂離子和血清對(duì)胰蛋白酶和鎂離子和血清對(duì)胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。的抑制作用。 （2）胰蛋白酶濃度不宜過高，作用時(shí)間不能太）胰蛋白酶濃度不宜過高，作用時(shí)間不能太 長(zhǎng)，以避免毒性作用。長(zhǎng)，以避免毒性作用。 （3）消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避）消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避 免毒性產(chǎn)生，而且動(dòng)作要輕，以避免膨松的細(xì)免毒性產(chǎn)生，而且動(dòng)作要輕，以避免膨松的細(xì) 胞隨漂洗而丟失。胞隨漂洗而丟失。 No Image 三、原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法三、原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法 原代細(xì)胞的培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng)是從原代細(xì)胞的培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng)是從 供體取得組織細(xì)胞在體外進(jìn)行的首供體取得組織細(xì)胞在體外進(jìn)行的首

15、 次培養(yǎng)，是建立細(xì)胞系的第一步，次培養(yǎng)，是建立細(xì)胞系的第一步， 是一項(xiàng)基本技術(shù)。是一項(xiàng)基本技術(shù)。 原代細(xì)胞最接近和最能反映體內(nèi)生原代細(xì)胞最接近和最能反映體內(nèi)生 長(zhǎng)特性，適用于藥物敏感性試驗(yàn)、長(zhǎng)特性，適用于藥物敏感性試驗(yàn)、 細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)研究。細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)研究。 （一）組織塊培養(yǎng)法（一）組織塊培養(yǎng)法 組織塊培養(yǎng)是常用、簡(jiǎn)便易行和成功組織塊培養(yǎng)是常用、簡(jiǎn)便易行和成功 率較高的原代培養(yǎng)方法。率較高的原代培養(yǎng)方法。 基本方法是將剪成的小組織團(tuán)塊接種基本方法是將剪成的小組織團(tuán)塊接種 于培養(yǎng)瓶（或皿）中，瓶壁可預(yù)先涂于培養(yǎng)瓶（或皿）中，瓶壁可預(yù)先涂 以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶以膠原薄層，以利于組織

16、塊粘著于瓶 壁，使周邊細(xì)胞能沿瓶壁向外生長(zhǎng)。壁，使周邊細(xì)胞能沿瓶壁向外生長(zhǎng)。 No Image （二）消化培養(yǎng)法（二）消化培養(yǎng)法 （三）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法（三）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法 對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、 淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中 的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無需消化，可采的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無需消化，可采 用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋 巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。 （四）器官培養(yǎng)（四）器官培養(yǎng) 器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織 塊后，

17、不進(jìn)行組織分離而直接在體外塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外 的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)，的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)， 器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對(duì)完整器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對(duì)完整 性，可用于重點(diǎn)觀察細(xì)胞間的聯(lián)系、性，可用于重點(diǎn)觀察細(xì)胞間的聯(lián)系、 排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境 的生物調(diào)節(jié)作用。的生物調(diào)節(jié)作用。 No Image 第三節(jié)第三節(jié) 原代和傳代細(xì)胞的培養(yǎng)和維原代和傳代細(xì)胞的培養(yǎng)和維 持持 原代細(xì)胞的培養(yǎng)與維持原代細(xì)胞的培養(yǎng)與維持 原代細(xì)胞培養(yǎng)的首次傳代原代細(xì)胞培養(yǎng)的首次傳代 傳代細(xì)胞的傳代培養(yǎng)傳代細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 傳代細(xì)胞的建系和維持傳代細(xì)胞的建系和維持 一、原

18、代細(xì)胞的培養(yǎng)與維持一、原代細(xì)胞的培養(yǎng)與維持 （一）原代細(xì)胞培養(yǎng)：（一）原代細(xì)胞培養(yǎng)： 1靜置貼壁細(xì)胞（包括半貼壁細(xì)胞的培靜置貼壁細(xì)胞（包括半貼壁細(xì)胞的培 養(yǎng)）培養(yǎng)養(yǎng)）培養(yǎng) 2懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)懸浮細(xì)胞的培養(yǎng) 靜置貼壁細(xì)胞（包括半貼壁細(xì)胞）培養(yǎng)要求靜置貼壁細(xì)胞（包括半貼壁細(xì)胞）培養(yǎng)要求 細(xì)胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性。細(xì)胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性。 細(xì)胞接種時(shí)濃度要稍大一些，至少為細(xì)胞接種時(shí)濃度要稍大一些，至少為 5108細(xì)胞細(xì)胞 /L。 培養(yǎng)基可用培養(yǎng)基可用Eagle（MEM）或）或DMEM。 小牛血清濃度為小牛血清濃度為10%-20%。 應(yīng)在應(yīng)在37、5% CO2的培養(yǎng)

19、箱中培養(yǎng)。的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 在起始的在起始的2天中盡量減少振蕩，以防天中盡量減少振蕩，以防 止剛貼壁的細(xì)胞發(fā)生脫落、漂浮。止剛貼壁的細(xì)胞發(fā)生脫落、漂浮。 待細(xì)胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，待細(xì)胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀， 應(yīng)將原代細(xì)胞換液。應(yīng)將原代細(xì)胞換液。 骨髓或外周血中的懸浮細(xì)胞經(jīng)靜置培骨髓或外周血中的懸浮細(xì)胞經(jīng)靜置培 養(yǎng)養(yǎng)1周時(shí)，應(yīng)將細(xì)胞懸液經(jīng)低速離心周時(shí)，應(yīng)將細(xì)胞懸液經(jīng)低速離心 后換液。后換液。 懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)要求懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)要求 原代培養(yǎng)時(shí)要盡量去除紅細(xì)胞。原代培養(yǎng)時(shí)要盡量去除紅細(xì)胞。 短期培養(yǎng)，可在含短期培養(yǎng)，可在含10%小牛血清的小牛血清的RPMI 1640培培 養(yǎng)基中進(jìn)行。

20、養(yǎng)基中進(jìn)行。 細(xì)胞濃度可在細(xì)胞濃度可在5-8109/L范圍內(nèi)。范圍內(nèi)。 進(jìn)行分瓶試驗(yàn)。進(jìn)行分瓶試驗(yàn)。 長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)，淋巴細(xì)胞中要加入生長(zhǎng)因子，白長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)，淋巴細(xì)胞中要加入生長(zhǎng)因子，白 血病細(xì)胞中要加入少量的原患者血清，以利細(xì)血病細(xì)胞中要加入少量的原患者血清，以利細(xì) 胞生長(zhǎng)。胞生長(zhǎng)。 細(xì)胞換液一般每隔細(xì)胞換液一般每隔3天需半量換液一天需半量換液一 次。次。 細(xì)胞傳代一般待細(xì)胞增殖加快、細(xì)胞細(xì)胞傳代一般待細(xì)胞增殖加快、細(xì)胞 密度較高時(shí)才能進(jìn)行。密度較高時(shí)才能進(jìn)行。 （二）原代細(xì)胞的維持（二）原代細(xì)胞的維持 貼壁細(xì)胞長(zhǎng)成網(wǎng)狀或基本單層時(shí)，未達(dá)到飽和密貼壁細(xì)胞長(zhǎng)成網(wǎng)狀或基本單層時(shí)，未達(dá)到飽和密 度，需

21、采取換液方式來更新營(yíng)養(yǎng)成分以滿足細(xì)胞度，需采取換液方式來更新營(yíng)養(yǎng)成分以滿足細(xì)胞 繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖的需要。繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖的需要。 換入等量完全培養(yǎng)基或換成含換入等量完全培養(yǎng)基或換成含2%小牛血清的維持小牛血清的維持 液。液。 懸浮細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)基中不僅會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化而且會(huì)發(fā)懸浮細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)基中不僅會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化而且會(huì)發(fā) 生分裂繁殖，此時(shí)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分并不能維生分裂繁殖，此時(shí)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分并不能維 持細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求，需進(jìn)行換液。通常采用半量持細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求，需進(jìn)行換液。通常采用半量 換液的方法。換液的方法。 二、原代細(xì)胞培養(yǎng)的首次傳代二、原代細(xì)胞培養(yǎng)的首次傳代 原代培養(yǎng)后，由于懸浮細(xì)胞增殖，數(shù)原代培養(yǎng)后，

22、由于懸浮細(xì)胞增殖，數(shù) 量增加甚至達(dá)飽和密度，或貼壁細(xì)胞量增加甚至達(dá)飽和密度，或貼壁細(xì)胞 相互匯合，使整個(gè)瓶底逐漸被細(xì)胞覆相互匯合，使整個(gè)瓶底逐漸被細(xì)胞覆 蓋，細(xì)胞難以繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，需要進(jìn)蓋，細(xì)胞難以繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，需要進(jìn) 行分瓶培養(yǎng)，這種使原代細(xì)胞經(jīng)分散行分瓶培養(yǎng)，這種使原代細(xì)胞經(jīng)分散 接種的過程稱之為傳代。每進(jìn)行一次接種的過程稱之為傳代。每進(jìn)行一次 分離再培養(yǎng)稱為傳一代。分離再培養(yǎng)稱為傳一代。 首次傳代應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：首次傳代應(yīng)注意以下幾點(diǎn)： （1）細(xì)胞生長(zhǎng)密度不高時(shí)，不要急于傳代。）細(xì)胞生長(zhǎng)密度不高時(shí)，不要急于傳代。 （2）原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞需控制消化時(shí)間。）原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞需控制消化時(shí)間

23、。 （3）吹打已消化的細(xì)胞應(yīng)減少機(jī)械損傷。）吹打已消化的細(xì)胞應(yīng)減少機(jī)械損傷。 （4）首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些。）首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些。 （5）首次傳代培養(yǎng)的）首次傳代培養(yǎng)的pH應(yīng)偏低些，小牛血清濃度應(yīng)偏低些，小牛血清濃度 可加大至可加大至15%20%左右。左右。 三、傳代細(xì)胞的傳代培養(yǎng)三、傳代細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 傳代細(xì)胞，可根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法進(jìn)行傳代細(xì)胞，可根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法進(jìn)行 細(xì)胞傳代。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用消化法傳代，部分細(xì)胞傳代。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用消化法傳代，部分 貼壁的細(xì)胞用直接吹打或用硅膠軟刮的刮除法傳貼壁的細(xì)胞用直接吹打或用硅膠軟刮的刮除法傳 代。懸浮細(xì)胞可采

24、用加入等量新鮮培養(yǎng)基后直接代。懸浮細(xì)胞可采用加入等量新鮮培養(yǎng)基后直接 吹打分散進(jìn)行傳代，或用自然沉降法加入新培養(yǎng)吹打分散進(jìn)行傳代，或用自然沉降法加入新培養(yǎng) 基后再吹打分散進(jìn)行傳代?；笤俅荡蚍稚⑦M(jìn)行傳代。 No Image 四、傳代細(xì)胞的建系和維持四、傳代細(xì)胞的建系和維持 細(xì)胞系的維持通過換液傳代再換液、細(xì)胞系的維持通過換液傳代再換液、 再傳代和細(xì)胞種子凍存來實(shí)現(xiàn)。再傳代和細(xì)胞種子凍存來實(shí)現(xiàn)。 每一個(gè)細(xì)胞系都有其自身的特點(diǎn)，要每一個(gè)細(xì)胞系都有其自身的特點(diǎn)，要 做好建系和維持，必須記錄好細(xì)胞檔做好建系和維持，必須記錄好細(xì)胞檔 案，案， 及時(shí)換液傳代并做好細(xì)胞系（或及時(shí)換液傳代并做好細(xì)胞系（或 株

25、）的鑒定和管理工作。株）的鑒定和管理工作。 第四節(jié)第四節(jié) 原代細(xì)胞的純化和克隆原代細(xì)胞的純化和克隆 體外培養(yǎng)的細(xì)胞絕大多數(shù)呈混合生體外培養(yǎng)的細(xì)胞絕大多數(shù)呈混合生 長(zhǎng)，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性、長(zhǎng)，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性、 一致性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性，要求一致性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性，要求 采用單一種類細(xì)胞來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因采用單一種類細(xì)胞來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因 而培養(yǎng)細(xì)胞的純化就成為實(shí)驗(yàn)研究而培養(yǎng)細(xì)胞的純化就成為實(shí)驗(yàn)研究 的重要一步。的重要一步。 一、細(xì)胞的純化一、細(xì)胞的純化 細(xì)胞的純化分為：細(xì)胞的純化分為： （一）自然純化：長(zhǎng)期傳代過程中靠自然淘汰法，（一）自然純化：長(zhǎng)期傳代過程中靠自然淘汰法， 不斷排擠其

26、他生長(zhǎng)慢的細(xì)胞，最后留下生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)不斷排擠其他生長(zhǎng)慢的細(xì)胞，最后留下生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì) 旺的細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的，如腫瘤突變細(xì)旺的細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的，如腫瘤突變細(xì) 胞可通過此方法建立細(xì)胞系。胞可通過此方法建立細(xì)胞系。 （二）人工純化：利用人為手段造成對(duì)某一種細(xì)胞（二）人工純化：利用人為手段造成對(duì)某一種細(xì)胞 生長(zhǎng)有利的環(huán)境條件，抑制其他細(xì)胞的生長(zhǎng)從而生長(zhǎng)有利的環(huán)境條件，抑制其他細(xì)胞的生長(zhǎng)從而 達(dá)到純化細(xì)胞的目的。主要有以下達(dá)到純化細(xì)胞的目的。主要有以下5種方法：種方法： 1細(xì)胞因子依賴純化法：通過加入某細(xì)胞因子依賴純化法：通過加入某 些特殊的細(xì)胞因子而純化出只依賴些特殊的細(xì)胞因子而純化出只依賴 于

27、這種細(xì)胞因子生長(zhǎng)的細(xì)胞系。于這種細(xì)胞因子生長(zhǎng)的細(xì)胞系。 2酶消化法：利用上皮細(xì)胞和成纖維酶消化法：利用上皮細(xì)胞和成纖維 細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同，使細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同，使 兩者分開，達(dá)到純化的目的。另外兩者分開，達(dá)到純化的目的。另外 對(duì)貼壁細(xì)胞與半貼壁及粘附細(xì)胞間對(duì)貼壁細(xì)胞與半貼壁及粘附細(xì)胞間 的分離純化也是十分有效的。的分離純化也是十分有效的。 3機(jī)械刮除法機(jī)械刮除法 原代培養(yǎng)時(shí)，如果上皮細(xì)胞和成纖原代培養(yǎng)時(shí)，如果上皮細(xì)胞和成纖 維細(xì)胞為分區(qū)成片混雜生長(zhǎng)，每種維細(xì)胞為分區(qū)成片混雜生長(zhǎng)，每種 細(xì)胞都以小片或區(qū)域性分布的方式細(xì)胞都以小片或區(qū)域性分布的方式 生長(zhǎng)在瓶壁上，可采用機(jī)械的方法

28、生長(zhǎng)在瓶壁上，可采用機(jī)械的方法 去除不需要的細(xì)胞區(qū)域而保留需要去除不需要的細(xì)胞區(qū)域而保留需要 的細(xì)胞區(qū)域。的細(xì)胞區(qū)域。 4反復(fù)貼壁法反復(fù)貼壁法 成纖維細(xì)胞貼壁過程快，能在短時(shí)成纖維細(xì)胞貼壁過程快，能在短時(shí) 間內(nèi)完成附著過程，而上皮細(xì)胞在間內(nèi)完成附著過程，而上皮細(xì)胞在 短時(shí)間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，短時(shí)間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定， 稍加振蕩即浮起，利用此差別可以稍加振蕩即浮起，利用此差別可以 純化細(xì)胞。純化細(xì)胞。 5電烙篩選法電烙篩選法 貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)，在培養(yǎng)瓶的細(xì)胞層貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)，在培養(yǎng)瓶的細(xì)胞層 中會(huì)出現(xiàn)分散的轉(zhuǎn)化灶，細(xì)胞密集、中會(huì)出現(xiàn)分散的轉(zhuǎn)化灶，細(xì)胞密集、 排列規(guī)則，有明顯生長(zhǎng)趨勢(shì)，與周邊排列規(guī)則，有明顯生長(zhǎng)趨勢(shì)，與周邊 未能轉(zhuǎn)化的細(xì)胞有明顯的區(qū)域界限，未能轉(zhuǎn)化的細(xì)胞有明顯的區(qū)域界限， 可用機(jī)械