臨床檢驗免疫主管(4)

1、臨床檢驗免疫主管（4） 臨床醫(yī)學(xué)檢驗主管技師考試輔導(dǎo)臨床免疫學(xué)和免疫檢驗 第四章單克隆抗體與基因工程抗體的制備 第一節(jié)雜交瘤技術(shù)的基本原理 第二節(jié)單克隆抗體的制備 第三節(jié) 基因工程抗體制備 第四節(jié)單克隆抗體的應(yīng)用 將單個B細(xì)胞分離出來加以增殖 形成一個克隆群落，該B細(xì)胞克隆產(chǎn)生出針對單一表位.結(jié)構(gòu)相同. 功能均一的抗體，稱為單克隆抗體。 第一節(jié)雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤技術(shù)的原理是使免疫 的小鼠脾細(xì)胞與具有體外長期繁殖能力的小鼠骨髓瘤細(xì)胞融為一 體，成為雜交瘤細(xì)胞，最終獲得既能產(chǎn)生所需單克隆抗體，又能 長期繁殖的雜交瘤細(xì)胞系。 將這種雜交瘤細(xì)胞擴大培養(yǎng)，接種于小鼠腹腔，在小鼠腹腔 積液屮即可得

2、到高效價的單克隆抗體。 一. 雜交瘤技術(shù)包括兩種親本細(xì)胞的選擇與制備，細(xì)胞融 合，雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆化。 （一）小鼠骨髄瘤細(xì)胞細(xì)胞株穩(wěn)定，易于傳代培養(yǎng)。 細(xì)胞株自身不會產(chǎn)生免疫球蛋白或細(xì)胞因子。 該細(xì)胞是次黃瞟吟磷酸核酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）的缺陷株。 （二）免疫脾細(xì)胞免疫用抗原盡量提高其純度和活性，免疫 途徑多用腹腔內(nèi)或皮內(nèi)多點注射法。 如為珍貴微量抗原，可用脾臟內(nèi)直接注射法進(jìn)行免疫。 （三）細(xì)胞融合PEG （聚乙二醇）可能導(dǎo)致細(xì)胞膜上脂類物 質(zhì)的物理結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜容易打開而有助于細(xì)胞融合。 （四）雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)HAT培養(yǎng)液，是在基礎(chǔ)細(xì)胞 培養(yǎng)液內(nèi)添加次黃瞟吟.甲氨蝶吟和胸

3、腺卩密噪核昔。 1. 脾細(xì)胞（指B細(xì)胞）在一般培養(yǎng)基中不能生長繁殖。 2. 骨髓瘤細(xì)胞 因缺乏HGPRT而合成DNA,骨髓瘤細(xì)胞在HAT 培養(yǎng)基屮不能增殖而死亡。 3. 雜交瘤細(xì)胞由骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì) 胞。 由于與脾細(xì)胞融合，可獲得其HGPRT,可以合成DNA。因此， 雜交瘤細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)得以生存而被篩選出來。 二. 陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)單個細(xì)胞培養(yǎng)又稱克隆 化。 細(xì)胞克隆化有以下幾種方法： 1. 有限稀釋法； 2. 顯微操作法； 3. 熒光激活細(xì)胞分選儀； 4. 軟瓊脂平板法。 三. 陽性雜交瘤細(xì)胞的凍存目前均采用液氮保存細(xì)胞。 細(xì)胞放入液氮前，需要逐步降溫。 復(fù)蘇

4、細(xì)胞時，從液氮罐內(nèi)取岀凍存管，立即浸入37C水浴。 第二節(jié)單克隆抗體的制備 一. 單克隆抗體的兩大產(chǎn)生方法 （一）動物體內(nèi)誘生法先在小鼠腹腔注射液體石蠟或弗氏不 完全佐劑，一周后將雜交瘤細(xì)胞懸液注射腹腔，12周后，無菌 抽取腹水，離心取上清液即可。 （二）體外培養(yǎng)法將雜交瘤細(xì)胞置培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待培養(yǎng)液 顏色改變或細(xì)胞過多開始死亡時，收集上清液，離心去掉碎片及 細(xì)胞即可。 二. 單克隆抗體的純化從培養(yǎng)液或腹腔積液獲得的單克隆抗 體，不需要純化即可應(yīng)用于日常診斷或定性研究。 由于其屮含有大量來自培養(yǎng)基.宿主或克隆細(xì)胞本身的一些無 關(guān)蛋白，如果用于免疫標(biāo)記測定，如放射性核素.酶.熒光素或生 物素標(biāo)記

5、等，必須進(jìn)一步分離和純化。 三. 單克隆抗體的性質(zhì)鑒定 （一）Ig類型測定通常以兔抗小鼠Ig類及亞類抗體與培養(yǎng) 液屮單克隆抗體按雙向瓊脂擴散法進(jìn)行測定，確定其Ig類型或者 Ig亞類型別。 （二）特異性測定把與相應(yīng)抗原有關(guān)的物質(zhì)通McAb進(jìn)行多 種免疫學(xué)檢測，鑒定McAb的特異性。這直接關(guān)系到McAb應(yīng)用的 可靠性。 第3頁共10頁 （三）抗體效價測定效價以腹腔積液或培養(yǎng)液的稀釋度表 示，稀釋度越高，則抗體效價也越高。 （四）表位測定 通過雙向瓊脂擴散法，把兩種McAb混合， 加入于同一孔中，對孔放相應(yīng)的抗原，如出現(xiàn)兩條沉淀線可證明 兩者為抗不同表位的McAbo 利用ELISA雙抗夾心法，將一種

6、McAb作為包被抗體，另一作 為酶標(biāo)記，其屮加入抗原，如顯色，則證明兩者抗不同的表位。 （五）親和力測定只有當(dāng)抗原與抗體結(jié)合部位結(jié)構(gòu)完全吻合 時，抗體的親和力最大。 這種結(jié)合力以抗原抗體反應(yīng)平衡時，抗原與抗體濃度的乘積 與抗原抗體復(fù)合物濃度之比表示。 （六）染色體分析雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目接近兩親本細(xì)胞 染色體數(shù)目的總和，在結(jié)構(gòu)上多數(shù)為端著絲粒染色體外，還應(yīng)出 現(xiàn)少數(shù)標(biāo)志染色體。 四. 單克隆抗體的特性 （一）單克隆抗體的特性 1. 高度特異性； 2. 高度的均一性和可重復(fù)性； 3. 弱凝集反應(yīng)和不呈現(xiàn)沉淀反應(yīng)； 4. 對環(huán)境敏感性。 （二）單克隆抗體的優(yōu)點 1. 雜交瘤可以在體外“永久”地存

7、活并傳代，只要不發(fā)生細(xì) 胞株的基因突變，就可以不斷地生產(chǎn)高特異性.高均一性的抗體。 2. 可以用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的.均一的抗 體。 3. 由于可能得到“無限量”的均一性抗體，所以適用于以標(biāo) 記抗體為特點的免疫學(xué)分析方法，如IRMA和ELISA等。 4. 由于單克隆抗體的高特異性和單一生物學(xué)功能，可用于體 內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導(dǎo)向治療。 （三）單克隆抗體的局限性 1. 由于單克隆抗體不能進(jìn)行沉淀和凝集反應(yīng)，所以很多檢測 方法不能用單克隆抗體完成。 2. 單克隆抗體的反應(yīng)強度不如多克隆抗體。 3. 制備技術(shù)復(fù)雜，而且費時費工，所以單克隆抗體的價格也 較咼。 第三節(jié)基因工程抗體的制

8、備 一. 基因工程抗體的概念 應(yīng)用DNA重組及蛋白工程技術(shù)對編 碼抗體基因按不同需要進(jìn)行改造和裝配，經(jīng)導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞 后重新表達(dá)的抗體，稱為基因工程抗體。 二. 基因工程抗體的優(yōu)點 1. 通過基因工程技術(shù)的改造，可以降低甚至消除人體對抗體 的排斥反應(yīng)。 2. 基因工程抗體的分子量較小，可以部分降低抗體的鼠源 性，更有利于穿透血管壁，進(jìn)入病灶的核心部位。 3. 根據(jù)治療的需要，制備新型抗體。 4. 可以采用原核細(xì)胞.真核細(xì)胞和植物等多種表達(dá)形式，大量 表達(dá)抗體分子，大大降低了生產(chǎn)成本。 三. 人源化抗體制備人源化抗體的主要目的是減少抗體的異 源性。 （一）嵌合抗體 1. 從雜交瘤細(xì)胞屮分離出

9、功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū) 的基因連接，插入適當(dāng)質(zhì)粒，構(gòu)建鼠-人嵌合的重鏈和輕鏈基因質(zhì) 粒載體，共同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞（如骨髓瘤細(xì)胞），表達(dá)鼠-人嵌合 抗體。 2. 人源化抗體的特點：大大減少鼠源性單克隆抗體的免疫原 性，同時又保留了親本抗體的特異性和親和力。 （二）改形抗體 1. 改形抗體的定義利用基因工程技術(shù)，將人抗體可變區(qū) （V）中互補決定簇（CDR）序列改換成鼠源單抗CDR序列。 2. 改形抗體的特點重構(gòu)成既具有鼠源性單抗的特異性，又保 持抗體親和力的人源化抗體。 四. 小分子抗體小分子抗體包括抗原結(jié)合片段（Fv）.單鏈可 變區(qū)片段（ScFv）和單區(qū)抗體（SdAb） o 分子量小，可在

10、大腸桿菌等原核細(xì)胞表達(dá)，在人體內(nèi)穿透力 強，有利于疾病的治療。 五. 抗體融合蛋白抗體融合蛋白是利用基因工程技術(shù)將抗體 片段與其他生物活性蛋白融合所得的產(chǎn)物。 抗體融合蛋白具有多種生物學(xué)功能，并且表達(dá)的重組蛋白既 不影響單鏈抗體的抗原結(jié)合能力，也不影響與Z融合的蛋白質(zhì)的 生物學(xué)特性。 六. 雙特異性抗體雙特異性抗體（BsAb）又稱雙功能抗體 （BFA）,它的兩個抗原結(jié)合位點具有不同的特異性，應(yīng)用于結(jié)合 兩種不同的抗原分子，在生物醫(yī)學(xué)中有著重要的意義。 （一）化學(xué)交聯(lián)BsAb兩種不同的McAb通過化學(xué)試劑交聯(lián)起 來。 缺點是容易導(dǎo)致抗體失去活性，產(chǎn)物均一性不佳。 （二）細(xì)胞工程BsAb將兩種分泌

11、不同特異性單抗的雜交瘤細(xì) 胞進(jìn)行再次融合，產(chǎn)生四源雜交瘤細(xì)胞。 穩(wěn)定性差，BsAb的產(chǎn)量少且活性低，費時費力，不適用于臨 床。 （三）基因工程BsAb多采用抗體分子片段，如Fab, Fv或 ScFv,經(jīng)基因操作修飾后，或體外組裝為BsAb,或直接表達(dá)分泌 型的BsAbo 七. 噬菌體抗體庫技術(shù)是將體外克隆的抗體基因片段插入噬 菌體載體，轉(zhuǎn)染工程細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)，然后用抗原篩選即可獲得特 異的單克隆噬菌體抗體。 利用這一技術(shù)可以得到完全人源性的抗體，在HIV等病毒感 染和腫瘤的診斷與治療方面有其獨特的優(yōu)越性。 （一）基本原理用PCR技術(shù)從人免疫細(xì)胞中擴增出整套的抗 體重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（

12、VL）基因，克隆到噬菌體載 體上并以融合蛋白的形式表達(dá)在其外殼表面。 （二）程序 1. 從外周血或脾.淋巴結(jié)等組織屮分離B淋巴細(xì)胞，提取mRNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。 2. 應(yīng)用抗體輕鏈和重鏈引物，根據(jù)建庫的需要通過PCR技術(shù) 擴增不同的Ig基因片段。 3. 構(gòu)建噬菌體載體。 4. 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌，構(gòu)建全套抗體庫。 （三）噬菌體抗體庫技術(shù)的特點 1. 模擬天然全套抗體庫。 2. 避免使用人工免疫和雜交瘤技術(shù)。 3. 可獲得高親和力的人源化抗體。 第四節(jié) 單克隆抗體的應(yīng)用 單克隆抗體問世以來，由予其獨 有的特征已迅速應(yīng)用于醫(yī)學(xué)很多領(lǐng)域。主要表現(xiàn)在以下幾個方 面： 一.檢驗醫(yī)學(xué)診斷試劑作為檢驗醫(yī)

13、學(xué)實驗室的診斷試劑，單 克隆抗體以其特異性強.純度高.均一性好等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用子酶 聯(lián)免疫吸附試驗.放射免疫分析.免疫組化和流式細(xì)胞儀等技術(shù)， 并且單克隆抗體的應(yīng)用很大程度上促進(jìn)了商品化試劑盒的發(fā)展。 目前，應(yīng)用單克隆抗體制作的商品化試劑盒廣泛應(yīng)用于：病原 微生物抗原.抗體的檢測；腫瘤抗原的檢測；免疫細(xì)胞及其亞 群的檢測；激素測定；細(xì)胞因子的測定。 二蛋白質(zhì)的提純單克隆抗體是親和層析屮重要的配體。將 單克隆抗體吸附在一、惰性的固相基質(zhì)（如Separose2B, 4B, 6B 等）上，并制備成層析柱。當(dāng)樣品流經(jīng)層析柱時，待分離的抗原 可與固相的單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，其余成分不能與之結(jié) 合。將

14、層析柱充分洗脫后，改變洗脫液的離子強度或pH,欲分離 的抗原與抗體解離，收集洗脫液便可得到欲純化的抗原。 三. 小分子抗體的應(yīng)用將針對某一腫瘤抗原的單克隆抗體與 化療藥物或放療物質(zhì)連接，利用單克隆抗體的導(dǎo)向作用，將化療 藥物或放療物質(zhì)攜帶至靶器官，直接殺傷靶細(xì)胞，稱為腫瘤導(dǎo)向 治療。 將放射性標(biāo)志物與單克隆抗體連接，注入患者體內(nèi)可進(jìn)行放 射免疫顯像，協(xié)助腫瘤的診斷。 四. 抗體融合蛋白的應(yīng)用腫瘤的體內(nèi)顯像診斷病毒的診斷和 抗病毒感染血液性疾病的診斷 五. 雙特異抗體的應(yīng)用 1. 在體外免疫檢測屮的應(yīng)用假如雙特異抗體的一只臂結(jié)合靶 抗原，一只臂結(jié)合紅細(xì)胞，可用于建立自身紅細(xì)胞凝集試驗，快 速檢測HBV和HIV病原體等；假如雙特異抗體的一只臂結(jié)合靶抗 原，一只臂結(jié)合酶（HRP或ALP）,抗體的標(biāo)記只要加入酶即可， 避免化學(xué)交聯(lián)減低兩者的活性，從而提高酶免疫檢測的敏感性。 2. 在體內(nèi)腫瘤放射免疫顯像診斷屮的應(yīng)用假如雙特異