Caspase與細胞凋亡概要1資料

1、Caspase與細胞凋亡沈陽市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內科（110041）李莉摘要：細胞凋亡，又稱程序性細胞死亡（Programmed cell death, PCD是機體生長發(fā)育、 細胞分化和病理狀態(tài)中細胞自主性死亡過程。 是細胞內由基因編碼 調控的按嚴格程序執(zhí)行的細胞自殺過程。 細胞凋亡是細胞生長發(fā)育過程的重要生 命現(xiàn)象，是目前生物醫(yī)學領域中的一個重要研究課題。 闡明細胞凋亡的分子機制 可對一些疾病的防治（如腫瘤，神經(jīng)退行性疾病等）產(chǎn)生積極影響。許多實驗提 示細胞凋亡涉及一個瀑布式（Cascade基因表達過程。半胱氨酸蛋白酶（Caspase 在細胞凋亡中發(fā)揮始動和效應作用。 本文就其生物學特性及其

2、在凋亡中的作用機 制作一綜述。關鍵詞：Caspase細胞凋亡細胞凋亡的原詞 Apoptosis 由兩個拉 丁字組成。Apo指離開，ptosis是落下，意 思是細胞凋亡有如秋天落葉，到一定時候 即失去生命力，遂即脫落，細胞凋亡，又 稱程 序 性細 胞死亡 (Programmed cell death, PCD)是機體生長發(fā)育、細胞分化 和病理狀態(tài)中細胞自主性死亡過程，是細 胞內由基因編碼調控的,按嚴格程序執(zhí)行 的細胞自殺過程。 通常需要 30到 60 分鐘, 細胞凋亡形態(tài)學上的變化主要有 DNA 破 碎,染色質凝集,細胞皺縮,線粒體腫脹 和凋亡小體形成,而整個過程的結束以凋 亡小體被吞噬為標志。

3、多數(shù)類型細胞在凋 亡的最后階段發(fā)生細胞核 DNA 的降解： DNA降解成180-200bp或其倍數(shù)的片段， 因此在瓊脂糖凝膠電泳上可見到有特征性 的梯形圖譜。目前對凋亡的研究深入到分 子水平， 發(fā) 現(xiàn)多種半胱氨酸蛋 白酶 (Cysteine aspartas)e 在細胞凋亡之中發(fā)揮 著重要作用。1、什么是 Caspase通 過 對 美 麗 線 蟲 ( nematode cae norhabditis elega nS)的細胞死亡機制的 研究發(fā)現(xiàn)，至少有 3 個基因直接參與了細 胞凋亡的調節(jié)。ced-3、ced-4直接介導細胞 死亡，為促凋亡基因，其編碼的蛋白分別 為CED-3、CED-4、ce

4、d-3在細胞中起關鍵 作用，稱為線蟲自殺基因， CED-3 則稱為 死亡蛋白酶；ced-9則拮抗其作用，為抗凋 亡基因，其編碼的蛋白質為 CED-9。后來 發(fā)現(xiàn)CED-3與哺乳動物的白介素-1 B轉換 酶(Caspase-1,原名為 interleukin-1 B -converting enzyme， ICE )具有高度同源性， CED-4， CED-9 則分別與 Apaf-1 (apoptosis protease-activatfiancgtor-)1、 Bcl-2 同源。 Bcl-2 基因家族產(chǎn)物包括促進及抑制凋亡的兩個 蛋白質亞群 1。哺乳動物的 ICE 類蛋白是 一組半胱氨酸蛋白酶

5、 2；且有以下共同特 點：和ICE有同源性；有高度保守 QACXG (X為R、Q或G )五肽序列3;有發(fā)揮酶活性所必須的半胱氨酸；特 異地裂解天門冬氨酸位點；前體蛋白均 無活性，均需經(jīng)蛋白水解后才產(chǎn)生活性； 轉染不同細胞可誘導凋亡。因它們均具 有半胱氨酸和天門冬氨酸裂解位點， Alnemri 將其命名為 Caspase ，其基因用Casp表示4 ；“ C ”代表半胱氨酸蛋白酶機制，aspase表示其能特異切割底物中在 天冬氨酸（asp）后的肽鍵能力。目前在哺 乳動物中發(fā)現(xiàn)至少16種Caspase，按其 發(fā)現(xiàn)的先后順序命名為Caspase-1 Caspase-16 5。2、Caspase 的生物

6、學特性2.1 Caspase 的結構特點Caspase 家族有相似的氨基酸序列， 結構和底物特異性，通常以無活性的蛋白 酶原（ procaspase ）形式存在細胞內合成 和分泌（ 30-50KD ）。后者由 4 個亞區(qū)組成： NH2- 末 端 區(qū) （ Prodomain ）、 大 亞 基（ P17-20 ）、小亞基（ P10-12 ）及連接大 小亞基的連接區(qū)；各亞區(qū)間經(jīng)蛋白水解后 釋放出 Prodomain 及連接區(qū)，使大小亞基 結合成一活性的異四聚體并暴露出底物識 別，結合和催化所需的氨基酸殘基，即形 成了活性的 Caspase ； Procaspase 可自我 催化及催化其他 Proca

7、spase 產(chǎn)生活性蛋 白酶，其蛋白水解級聯(lián)功能類似凝血因子 活化的“ 瀑布效應” 6。 Caspase 的作用 特點是能識別底物裂解位點 NH2 末端最少 4 個氨基酸并在天門冬氨酸后裂解底物， 從而使其蛋白裂解行為具有高選擇性。不 同的 Caspase 因所識別的 4 個氨基酸的不 同而具有明顯的底物特異性，從而發(fā)揮各 自不同的生物學功能。2.2 Caspase 家族成員及分類Caspase 分類較為復雜，通常根據(jù)蛋 白 酶序 列的 相似性分為 三個亞族： Caspase-1 亞族（ Caspase-1 、4、5、1 3 ）； Caspase-2 亞 族 （ Caspase-2 、 9 ）

8、 和 Caspase-3 亞族（ Caspase-3 、6、7、8、 10）。在 Caspase 家族成員中， Caspase-1 、 2、4、5、8、9、10、11 等為調控 Caspase ， 參與打靶和激活調控； Caspase-3 、6、7、 12、14 等為效應 Caspase ，即參與凋亡的 效應物。Caspase-1 （白介素-1 B -轉換酶， ICE）是該家族中第一個被鑒定的成員， 但 它在細胞凋亡中并無十分明顯的作用，主要參與IL-1 B的成熟和轉運。Caspase-8 是啟動者 Caspases 的重要代表，可通過 與連接分子 FADD 的結合而活化，將凋亡 信號傳遞到下

9、游的效應 Caspases 分子。 Caspase-14 是該家族中的最新成員， 主要 表達于胚胎細胞中，成年期缺乏表達，由 于分子結構中沒有 NH 2-末端域，因此又被 稱為 MICE（mini-ICE ）。功能研究發(fā)現(xiàn)它 能直接誘導細胞凋亡，但具體的信號轉導 途徑高不清楚 7。并不是所有 Caspase 都 參與細胞凋亡反應， 如 Caspase-1 、4、5、 12 等 的 作 用 主 要 是 參 與 炎 癥 反 應 。 Caspase-3 是迄今為止研究比較透徹的一 個，它是主要的效應者分子。 1994 年 Femandes-Alnemri 等在人 Jurkat T 細胞 系，首先克隆

10、出 CPP32 （Caspase-3 ）基 因，分為 CPP32 a和CPP32 B。兩者的 閱讀框均由 831 個核苷酸組成，編碼 277 個氨基酸，相對分子質量約為32 X103（32KD ）。人 Caspase-3 基因定位于染色 體 4q33-q35.1 處。 Caspase-3 酶 原與 CED-3 蛋白有 35%的一致性， 58%的相似 性，是已知哺乳動物中與 CED-3 相似性最 高的一種。目前推測， Caspase-3 酶原上 有 4 個酶切位點 Asp9 、Asp28 （亦稱 P3 切割點）、 Asp 1 75 （亦稱 P17 切割）和 Asp181 ， 后兩 個 位點 的

11、切 割 產(chǎn)生 P20 （1-175 氨基酸）和 P11 （181-277 氨基 酸）大小亞基，大亞基進一步在 Asp28 處 切割去掉 N 末端前肽，而 Asp9 處的切割 產(chǎn)生 P19 大亞基，其與 Caspase-3 酶原的 自身活化有關。被切割形成的大亞基、小 亞基結合成a 2 B2四聚體，成為有活性的 酶。在蛋白酶級聯(lián)切割過程中， Caspase-3 處于核心位置，不同的蛋白酶分別切割Caspase-3 酶原，從而激活 Caspase-3 ； 活化的 Caspase-3 又進一步切割不同的底 物，導致蛋白酶級聯(lián)切割放大，最終使細 胞走向死亡 8。因此 Caspase-3 被稱為死 亡蛋

12、白酶。2.3 Caspase 的活化Caspase 的活化有兩條主要途徑 6，9 。 一條由 DD （ death domain ）介導，將 Caspase-8 募 集到 Fas （即 CD95 ）、 TNFR-1、DR3等受體復合物途徑。細胞膜 上的 Fas、 TNFR-1 、 DR3 等死亡受體均含 有 D D ， Caspase-8 、 10 等則含有 DED （ death-effector domain ） ， 而 procaspase-1 ，2， 4，5，9 含 CARD （caspase recruitment domain ）。 DD、 DED、 CARD 結構極其相似， 可相

13、互作用， 在 Caspase 的活化中起關鍵的接合作用， 稱為接合器（adaptor ）。以Fas受體為例， Fas 受體激活后， FADD 與募集而來的 procaspase-8 的 DED 結合形成信號復合 物，使 procaspe-8 自我水解、活化，形成 活性 Caspase-8 ，后者再激活 Caspase3 、 6、 7 等。另一途徑由細胞色素 C（ cyto-c ） 介導。細胞內外各種死亡信號可誘導線粒 體釋放 cyto-C 。 cyto-C 再與 Apaf-1 結合， 使 Apaf-1 發(fā)生構象改變，繼而寡聚化。然 后， Apaf-1 的 CARD 區(qū)與 Procaspase-

14、9 的 N- 末 端 的 CARD 區(qū) 結 合 ， 形 成 cyto-c-Apaf-1-Procaspase-9 “ 凋 亡 體 ”（ apoptosome ），從而使 Procaspase-92.4 Caspase 活化的調節(jié)Caspase 的活化可引起細胞凋亡 。那 么機體是如何抑制 Caspase 的過度激活百 不發(fā)生病理性凋亡的呢？已知有三大類蛋 白質參與 Caspase 活化的調節(jié)。2.4.1 FLIP 與 ARC目前發(fā)現(xiàn)有兩種蛋白參與 Caspase 初 始活化的調節(jié)即 FLIP（ FADD 樣的 ICE 抑 制蛋白）和ARC （含有CARD的凋亡抑制 蛋白）。 4、10 從 Ca

15、spase 的激活途徑可以 看出：調節(jié) Procaspase 與接合蛋白的相 互作用可抑制 Caspase 的活化。 研究發(fā)現(xiàn) FLIP 除沒有關鍵的催化殘基外，其序列與 Procaspase-8 相似，可與 Procaspase-8 競 爭 FADD 的 結 合 位 點 ， 達 到 阻 止 Caspase活化的目的；ARC可直接與多種 Procaspase 結合而阻止其活化。2.4.2 Bcl-2 家族Bcl-2 家族可調節(jié) cyto-c 的釋放，從而 調節(jié) cyto-c 介導的 Caspase 的活化 6,11 。 Bcl-2 家族成員是一組通道蛋白。 主要位于活化并激活下游其他 Casp

16、ase 線粒體、內質網(wǎng)及細胞核的外膜。 BAX 通過協(xié)助線粒體釋放 cyto-c 而促凋亡； Bcl-2 和 Bcl-xL 則可拮抗 Bax 的作用而明顯抑制 凋亡。另外，Bcl-2家族成員還可能直接與 CED-4/Apaf-1 結 合 ， 抑 制 cyto-c-Apaf-1-procaspase-9 復合物的形 成而阻止 Caspase-9 的激活；而 Bax 等其 他促凋亡的家族成員則拮抗此種作用，增 強 CED4/Apaf-1 的活性。2.4.3 IAP ( inhibitors of apoptosis protein)家族迄今， IAP 家族是哺乳動物唯一的內 源性 Caspase

17、抑制劑。 12 它包括神經(jīng)元凋 亡抑制蛋白( neuronal apoptosis inhibitory protein,NAIP ) 、X 染色體凋亡抑制劑( X chromosome-linked inhibitorofapoptosis,XIAP)、人凋亡抑制劑(human inhibitor of apoptosis,HIAP)、 Survivin 等， 可特異性地抑制 Caspase-3 、 7、 9 的活性， 使始動 Caspase 及效應 Caspase 均受抑 制而達到抗凋亡目的。3、Caspase 在細胞凋亡中的作用Caspase-3 缺乏的小鼠腦袋是正常的 2 倍。研究表明

18、這種 Caspase-3 缺陷小鼠 在大腦發(fā)育中缺乏腦細胞凋亡。這種小鼠 于出生后 1-3 周即死亡且表現(xiàn)出神經(jīng)系統(tǒng) 發(fā)育的極度異常。 13但 Caspase 并不抑制 由低K+引起的小腦神經(jīng)元凋亡14。 Caspase 蛋白酶家族成員在哺乳動物細胞 凋亡中起重要作用：滅活阻止細胞凋亡 的細胞內物質。通過對細胞結構的直接 酶解而促進凋亡。通過對一些細胞骨架 調節(jié)相關蛋白質的酶解而改變細胞結構而 導致細胞凋亡。Caspase發(fā)揮作用的起 點是其凋節(jié)區(qū)與效應區(qū)的分離。4、Caspase 導致凋亡的機理 細胞凋亡有兩條途徑。一個為線粒體 依賴途徑，另一個為死亡受體介導途徑 。4.1 線粒體依賴途徑4

19、.1.1 MPT 孔MPT ( mitochondrial permeability transiton)孔15、16是由膜內、外蛋白組成。 當通道開放時，分子量w 1.5KD的分子均 能自由通過，使線粒體內膜兩側的離子達 到平衡，H+梯度消失而中斷呼吸鏈。同時 高滲狀態(tài)的基質發(fā)生腫脹，致使無嵴的外 膜較有嵴的內膜先破裂。這樣，線粒體內 外膜間的凋亡誘導蛋白就可以被釋放到胞 漿中，包括 cytoC、AIF（apoptosis-inducing factor,即一種 DNA 酶）和 Procaspe-2 3、 9cytoC的釋放也可不依賴于 MPT孔的開 放，甚至大線粒體內膜保持完整的離子梯 度

20、下也能進行。其中的 Procaspase-2、 9 已 被證明存在于五個不同的器官（肝、腎、 心、腦、脾）和不同的細胞系的線粒體內 外膜間。17最近又有報告提出，細胞 10-90%的Procaspase-3也存在于線粒體內 外膜間，它們釋放后使通過蛋白水解作用 而自身激活。4.1.2. Bcl-2家族在凋亡中的作用Bcl-2、 Bcl-XL 和 Bax 能在線粒體外膜 上形成離子通道，通過控制其開放而調節(jié) MPT 0 MPT提高后，線粒體就可以釋放凋 亡誘導蛋白，正常情況下 Bcl-XL 與 Apaf-1 結合，使 Apaf-1 不參與激活 Procaspase-90 當細胞受到死亡信號刺激時

21、， Bax 可與 Bcl-XL 相互作用，去除 Bcl-XL 對 Apaf-1 的抑制作用。在cyto C被釋放后和ATP充 足時，游離于胞漿中的 Apaf-1 可通過其CARD 與 Procaspase-9 結 合 ， 使 Procaspase-9i身水解激活。Caspase-9 隨 后激活效應型 Caspase-3 ， Caspase-3 再 激活 DFF/CAD （一種 DNA 酶）引起細胞 凋亡。4.1.3 線粒體與 CaspaseCaspase 可直接誘導細胞凋亡，也可 被死亡信號激活后，再激活第二信使如神 經(jīng)酰胺，Ca2+,B cl-2的修飾，細胞內氧 化還原水平的改變， Bax、

22、 Bak 和 C-Myc 的過分表達等作用于線粒體再誘導凋亡。 只有這樣死亡信號才能夠突現(xiàn)級聯(lián)放大， 加快細胞凋亡。4.2 死亡受體介導途徑死亡受體是 TNF 受體家族的成員， 位 于細胞膜表面，為 I 型膜蛋白，具有相似 的結構：細胞外為半胱氨酸富集區(qū)，細胞 內為死亡區(qū)（DD, death domain ）。死亡 區(qū)雖是死亡受體引起凋亡的結構基礎，但 有時也能抑制凋亡。 9只有死亡受體與配體 形成復合體后才能起作用；死亡配體大多 為 II 型膜蛋白，由三個亞基組成，可同時 與三個受體形成寡聚體。不同的死亡受體 所誘導的凋亡過程在信號傳導上極為相 似，即受體先與配體形成寡聚體，接著適 配子通過

23、 DD 與受體結合，另一方面再通 過適配子的 DED 與鄰近的 Caspase 前體 結合，活化 Caspase 而誘導凋亡，但不同 的受體 / 配體系統(tǒng)在傳遞信號時又各有特 點。9，18CD95 是最典型的死亡受體 （又稱 FAS 或 APO-1 ），它參與人體的重要生理凋亡過 程。CD95的配體是CD95L，每個CD95L 能聚合三個 CD95 分子。通過核磁共振分 析結構和突變研究，發(fā)現(xiàn)死亡區(qū)常易聚集 在一起。 FADD 是一種適配子蛋白，它常 常通過它的死亡區(qū)使受體死亡區(qū)發(fā)生聚 合， 并通過受體 的 死亡效應區(qū) ， 與 Caspase-8 的前體結合。然后 Caspase-8 發(fā)生自身

24、裂解而被激活，并繼而激活下游 的效應型 Caspase 如 Caspase-9 。5、結語與展望 作為凋亡機制中重要的效應子成分，Caspase 家族參與多種與凋亡有關的生理 和病理過程。在諸如生長因子撤除、熱休 克、細胞因子和 DNA 損傷劑等刺激作用 下，細胞內多種凋亡信號傳導途徑被活化， 最終將會聚于 Caspase 家族蛋白酶這一共 同的遺傳保守機制。在免疫系統(tǒng)方面， Caspase 的作用更為突出，參與自體免疫 性胸腺細胞， T 細胞和 B 細胞的陰性選擇， 促使其成熟； 19參與 T 細胞介導的細胞毒 作用，并下調免疫反應。 20在神經(jīng)元凋亡 中， Caspase 也起著關鍵作用，

25、因此參與 一些神經(jīng)變性疾病的發(fā)生。 現(xiàn)代觀點認為， 腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅是細胞增殖異常的結 果，而且與細胞凋亡異常有關。因此對 Caspase 的結構、特性及其在凋亡中的作 用不斷深入的了解，將有助于人類對生命 奧秘的了解和對腫瘤等疾病的診斷和最終 治療。參考文獻1 Hengarther MO, Horvitz HR. C. elegans cell survival Gene ced-9 encodes a functional homolog of the mammalian proto-oncogene bcl-2 J. cell, 1994, 76:665-676.2 Harvey NL

26、, Kumar S. The role of caspases in apoptosis J. Adv BiochemEng Biotechnol, 1998, 62:107-128.3 Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis J. J Biol Chem, 1997, 326 (ptl): 1-16.4 Thornberry NA, Yuril. Caspases: Enemies within J. Science, 1998, 281(8):1312-1316.5 Marks N, et al. Bcl-Xl-Caspase-9

27、 interations in the Developing Nervous system: Evidence for Multiple death pathway. Neurochem Int, 1999, 35(3):195.6 Nunez G. Benedict MA, HuY, et al. Caspase: the proteases of the apoptotic pathway. Oncogene, 1998, 17:3237-3245.7 Van-De-Craen M, Van-Loo-G, Pype S, et al. Identification of a new cas

28、pase homologue: caspase-14. Cell Death Differ, 1998: 5(10):838-846.8 Srinivasula SM, Fernandes-Alnemri T, Iangrilli J, et al. The Ced-3/interleukinl beta converting enzyme-like homolog Mcho and the lamincleaving enzyme Mch2 alpha are substrates for the apoptotic mediator cpp32. J Biol Chem, 1996, 27

29、1(43):27099-27106.9 Schulze-osthoff k, Ferrari D, Los M, et al. Apptosis signaling by death receptors. Eur J biochem, 1998, 254:439-459.10 Stennicke HR. Salvesen GS. Properties of caspases.Biochim Biophys Acta. 1998, 1387:17-31.11 Pettmann B, Henderson CE. Neuronal cell death. Neuron, 1998, 20:633-6

30、47.12 Bergmann A. Agapite J. Steller H. Mechanism and control of programmed cell death in invertebrates. On cogene, 1998, 17:3215-3223.13 Kuida K, Zheng TS, Na S, et al. Decreased apoptosis in the brain and premature lethality in cpp32-definient mice.1996, 384:368-372.14 D Mello SR, et al. DNA Hypomethyletion perturbs the fuction and Survival of CNS Neurons in postnatal animals. J Neurosci, 1997, 17:1548.15 Hirsch T, Susin SA, Marzo I, et