人多效生長因子(PTN)ELISA檢測試劑盒說明書講課稿

1、人多效生長因子（PTN） ELISA檢測試劑盒說明書 本試劑僅供研究使用 標(biāo)本：血清或血漿 樊克生物專業(yè)供應(yīng)： 使用目的： 本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關(guān)液體樣本多效生長因子（PTN）含量 試驗原理: PTN試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ ELISA .已知PTN濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行 檢測。先將PTN和生物素標(biāo)記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過的HRR再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合 物，然后加入底物 A、B,和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中 PTN的濃度呈比例關(guān)系。 試劑盒內(nèi)容及其配制 試劑盒成份（2-8 r保存） 96孔配置

2、 48孔配置 配制 96/48人份酶標(biāo)板 1塊板（96T） 半塊板（48T） :即用型 塑料膜板蓋 1塊 半塊 即用型 標(biāo)準(zhǔn)品：80n g/ml 1 瓶（0.6ml） 1 瓶（0.3ml） 按說明書進(jìn)行稀 稀 空白對照 1 瓶（1.0ml） 1 瓶（0.5ml） 即用型 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液 1 瓶（5ml） 1 瓶（2.5ml） 即用型 生物素標(biāo)記的抗PTN抗體 1 瓶（6ml） 1 瓶（3.0ml） :即用型 親和鏈酶素-HRP 1 瓶（10ml） 1 瓶（5.0ml） 即用型 洗滌緩沖液 1 瓶（20ml） 1 瓶（10ml） 按說明書進(jìn)行稀 釋 底物A 1 瓶（6.0ml） 1 瓶（3.0

3、ml） 即用型 底物B 1 瓶（6.0ml） 1 瓶（3.0ml） :即用型 終止液 1 瓶（6.0ml） 1 瓶（3.0ml） :即用型 標(biāo)本稀釋液 1 瓶（12ml） 1 瓶（6.0ml） 即用型 自備材料 1. 蒸餾水。 2. 加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。 3. 振蕩器及磁力攪拌器等。 安全性 1. 避免直接接觸終止液和底物 A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。 2. 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。 3. 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。 操作注意事項 1. 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)

4、丟棄，不可保存。 2. 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。 3. 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。 4. 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。 5. 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。 6. 洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。 7. 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物 B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立 即讀取OD值。 8. 加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。 9.

5、按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。 樣品收集、處理及保存方法 1、 血清臊作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000 x g離心10分鐘將血清 和紅細(xì)胞迅速小心地分離。 2、 血漿EDTA檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000 x g離心30分鐘去除顆粒。 3、 細(xì)胞上清液1000 x g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。 4、 組織勻漿-將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000X g離心10分鐘，取上清液 5、 保存如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70 C保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂 血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過

6、濾。不要在37C或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地 充分解凍。 試劑的準(zhǔn)備 1. 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準(zhǔn)備，不能儲存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行: 80 ng/ml （6號標(biāo)準(zhǔn) 品） 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。 40 ng/ml （5號標(biāo)準(zhǔn) 品） 100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 20 ng/ml （4號標(biāo)準(zhǔn) 品） 100ul的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 10 ng/ml （3號標(biāo)準(zhǔn) 品） 100ul的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 5.0 n g/ml （2號標(biāo)準(zhǔn) 品） 100ul的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入

7、100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 2.5 n g/ml （1號標(biāo)準(zhǔn) 品） 100ul的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 0 n g/ml （空白對照） 原始濃度不用稀釋直接加入50ul。 操作步驟 1. 使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。 2. 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定, 能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1: 1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。 3. 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品 50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品 50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入 50ul的生

8、物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板， 輕輕振蕩混勻，37 C溫育1小時。 4. 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌 次數(shù)增加一次。 5. 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻，37C溫育30分鐘。 6. 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌 次數(shù)增加一次。 7. 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37C溫育10分鐘。避免光照。 8. 取出酶標(biāo)板，迅速加入 50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。 9. 在450nm波長處測定各孔的OD值

9、。 建議使用的實驗方案 標(biāo)準(zhǔn)品濃 度( ng/ml) A 80 80 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 B 40 40 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 C 20 20 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 D 10 10 樣品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 E 5.0 5.0 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 F 2.5 2.5 樣品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品

10、 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 G 0 0 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 H 樣品 樣品 樣品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 樣 品 局限 6號標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無法得到精確的結(jié)果。 多效生長因子（PTN） ELISA試劑盒性能 1. 靈敏度：最小的檢測濃度小于 1號標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。 2. 特異性：不與其它細(xì)胞因子反應(yīng)。 3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于 10%。 結(jié)果判斷與分析 1、儀器值：于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔

11、的 OD值 2、 以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y）,相應(yīng)的PTN標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X）,做得相應(yīng)的曲線，樣品的 PTN含量可根據(jù)其OD值 由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。 3、檢測值范圍：0-80 ng/ml 4、敏感度：0.1 ng/ml The performa nee of kit: 1 sensitivity: minimum deteetion concentration is less than 1 standard. Linearity of dilution. Sample linear regression and the expected concentration correl

12、ation coefficient R value is 0.990. 2: no specific react ion with other cytok in es. 3 repeatability: plate, plate between the coefficients of variation were less than 10%. Human type III procollagen amino terminal peptide ELISA kit steps: 1 before use, all reage nts and mixing. Do not allow liquid

13、to produce a large nu mber of bubbles, so as to avoid add ing a large nu mber of bubbles, result ing in the additi on of the error. 2 accordi ng to determ ine the nu mber of sample nu mber plus sta ndard strip nu mber. Each sta ndard and bla nk hole is recomme nded to do the hole. Each sample can be

14、 made according to its own quantity, and can be used as a hole in the hole. 3 diluted after sta ndard 50ul in reacti on hole, added to the sample 50 UL in react ion hole to be measured. Immediately joined the 50 UL an tibody biot in. Cover the membrane plate, gently oscillating mixing, 37 degrees Ce

15、lsius for 45 minutes. 4 left hole liquid, each hole filled with washing liquid, oscillating 30 seconds off the washing liquid, pat dry with absorbent paper. Repeat this operation 4 times. If the wash ing mach ine with wash ing, wash ing times in creased on ce. 5 per hole adding chain affinity enzyme

16、 -HRP 100ul, gently oscillating mixing, 37 degrees 30 minu tes in cubati on. 6 left hole liquid, each hole filled with washing liquid, oscillating 30 seconds off the washing liquid, pat dry with absorbent paper. Repeat this operation 4 times. If the wash ing mach ine with wash ing, wash ing times in

17、 creased on ce. 7 per hole adding substrate A, B 50ul, gently oscillating mixing, 37 degrees 5 minutes in cubati on. Avoid light. 8 remove ELISA plate, quickly add 50ul terminated liquid, adding the stop solution immediately after the determ in ati on results. 9 od determ in ati on of each hole at t

18、he wavele ngth of 450nm. The result of judgme nt and an alysis: 1, i nstrume nt value: Yu Bo 450nm ELISA od read the hole on the in strume nt 2, to the OD value as a vertical coord in ate (y), corresp onding ot sta ndard concen trati ons as a horiz on tal coordi nate (x), do have corresp onding curve, sample ot content can be accord ing to the OD value by sta ndard curve conv ersi on out corresp onding concen trati on, multiplied by the diluti on multiple; or with the sta ndard concen trati