dn連接反應的影響因素提高平端連接效率的方法

1、dna1接反應的影響因素 艱高平端連接效率的方法&外源dna和質粒載體的連接反應&端。1人連接接反應1、 連接緩沖液的影響：大體上緩沖液含有以下組分： 20-100mmol/l的tris-hcl ,較多用50mmol/l, ph的范圍在7.4-7.8 ,較多 用7.8, 目的是提供合適酸堿度的連接體系； 10mmol/l 的 mgcl2， 作用是激活酶反應；1-20mmol/l的dt1較多用10mmol/l,作用是維持還原性 環(huán)境，穩(wěn)定酶活性，25-50ug/ml的bsa作用是增加蛋白質的濃度，防止因蛋白濃度過稀而造成酶的失活。與限制酶緩沖液不同的是連接酶緩沖液還含有0.5-4mmol/l的a

2、tfp現多用1mmol/l,是酶反應 所必需的。2、ph的影響：一般將緩沖液的ph調節(jié)到7.4-7.8 ,較多用7.8。 有實驗表明，若把ph為7.5-8.0時的酶活力定為100%那么體系偏堿（ph為8.3）時僅為全部活力的65%當體系偏酸（ph為6.9）時 僅為全部活力的40%。3、atp濃度的影響：連接緩沖液中atp的濃度在0.5-4mmol/l之間， 較多用1mmol/l。研究發(fā)現，atp的最適濃度為0.5-1mmol/l ,過濃 會抑制反應。例如，5mmol/l的atp會完全抑制平末端連接，黏端的連接也有10%抑制；還有報道，當atp的濃度為0.1mmol/l時，去 磷酸載體的自環(huán)比例

3、最大。由于atpb易分解，所以當連接反應失敗 時，除了 dnaw酶的問題外，還應考慮 atp的因素。含有atp的緩沖 液應于 -20 保存， 溶化取用后立即放回。 連接緩沖液體積較大時最好分小管貯存，防止反復凍融引起atp分解。與限制酶緩沖液不同的 是，含atp的連接緩沖液長 期放置后往往失效，所以也可自行配制 不含atp的緩沖液（可長期保存），臨用時加入新配制的atp母液。4、連接溫度與時間的影響：因為黏性末端的dnax鏈間有氫鍵的作 用， 所以溫度過高會使氫鍵不穩(wěn)定， 但連接酶的最適溫度又恰為37。為了解決這一矛盾，在經 過綜合考慮后，傳統上將連接溫度定為16， 時間為 4-16h 。 現

4、經實驗發(fā)現， 對于一般的黏性末端來說，2030min就足以取得相當好的連接效果，當然如果時間充裕的話，20c60min能使連接反應進行得更完全一些。對于平末端是不用考慮氫鍵 問題的，可使用較高的溫度，使酶活力得到更好的發(fā)揮。5、酶濃度的影響：日常使用的 dnat度比酶單位定義狀態(tài)低10-20倍，連接平末端時酶用量要比連接黏端大10-100 倍。進行黏末端連接時需先行稀釋， 稀釋液的成分與酶保存緩沖液相同或類似， 稀釋液 中的酶能在長時間保持活力，也便于隨時取用。6、dna濃度的影響：要求得到環(huán)化的有效連接產物， dna濃度不可 過高，一般不會超過20nmol/l。要求線性化的連接產物， dna

5、的濃 度可以高些， 至少是接近推薦的濃度。 在用大質粒載體進行大片段克隆時，以及在雙酶切片段的連接反應中，dn頌度還應降低，甚至是dna勺總濃 度低至幾個nmol/l。另據研究，t4 dna1接酶對dn襪 端的表觀km值為1.5nmol/l ,所以，連接時dnat度不應低于 1nmol/l 。即應具有2nmol/l 的末端濃度。提高平端連接效率的方法：1、 低溫下長時間的連接效率比室溫下短時間連接的好， 平端連接需要過夜反應。2、 在體系中加一點切載體的酶，只要連接后原來的酶切位點消失。這樣可避免載體自連， 應該可以大大提高平端連接的效率。 足夠多的載體和插入片段是最重要的。要看片段具體情況而

6、言，有時載體和片段濃度過高，容易產生線性化產物，不利于環(huán)化的。插入的dn*段的摩爾數是載體摩爾數的5-10 倍，這個很關鍵。 載體通常 50ng就夠了，若載體在10k 左右，可用 50 100ng。3、平端的連接對于離子濃度很敏感，回收的時候多洗洗，加pegffi擴大酶量，22度2小時后4c過夜。4、 盡可能縮小連接反應的體積，最好不超過10 微升，在 5 、 6 微升左右最佳。5、 建議放在四度冰箱連接兩天效率更高比 14 度好。（一）外源dn a和質粒載體的連接反應外源dna片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈dna 5 磷酸和相鄰的 3 羥基之間 形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都

7、帶5磷酸，可生成4個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒dn a已去磷酸化，則吸能形成2個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的 兩個雜交體分子帶有2個單鏈切口，當雜本導入后可被修復。相鄰的 5 磷酸和3 羥基間磷酸二酯鍵的形成可在體外由兩種不同的dn a連接酶催化，這兩種酶就是大腸桿菌d n a連接酶和t4噬菌體d na連接酶。實際上在有用途中，t 4噬菌體dna連接酶都是首選 的用酶。這是因為在下沉反應條件下，它就能有效地將平端d n a片 段連接起來。dna一端與另一端的連接可認為是雙分子反應，在標準條件 下，其反應速度完全由互相匹配的d n a末端的濃度決定。不論末端位于同一dna分子（分子內連接）

8、還是位于不同分子（分子間連接），都是如此。現考慮一種簡單的情況，即連接混合物中只含有一種d n a ,也就是用可產生粘端的單個限制酶切割制備的磷酸化載體dna。在瓜作用的底物。如果反應中dna濃度低，則配對的兩 個末端同一d n a分子的機會較大（因為d n a分子的一個末端找到 同一分子的另一末端 的概率要高于找到不同d n a分子的末端的概 率）。這倦，在dna濃度低時，質粒dna重新環(huán)化將卓有成效。 如果連接反應中d n a濃度有所增高，則在分子內連接反應發(fā)生以前，某一個d n a分子的末端碰到另一d n a分子末端的可能性也有 所增大。因此在d n a濃度高時，連接反的初產物將是質粒二

9、聚體和 更大一些的 寡聚體。dugaiczyk 等 （1975; 同時參見 bethesda res,lab.出版的focus第2卷，第2、3期合刊）從理論上探討了dn a濃度 對連接產物性質的影響。 簡而言之， 環(huán)化的連接產物與多聯體連接產物的 比取決于兩個參數：j和i。j是dna分子的一個末端在同一分子的另一末端附近的有效濃度， j 的數值是根據如下一種假設作出的：沉吟液中的dna呈隨機卷曲。這樣，j與dna分子的長度成反比（因為dna越長，某一給定分子的兩末端的越不可能相互作 用），因此j對給定長度的dna分子來說是一個常數，與 dna 深度無關。j=3/（3兀lb0）3/2 其中l(wèi)是d

10、na長度，以cm計，b 是隨機卷曲的dna區(qū)段的長度。b的值以緩沖液的離子強度為轉移， 而后者可影響dna的剛度。i 是溶液中所有互補末端的深度的測量值，對于具有自身互補粘端的雙鏈dna而言，i=2nomx10-3末端/ml這里n o是阿佛伽德羅常數， m是dna 的摩爾濃度（單位：mol/l）。理論上，當j=i時，給定 d n a分子的一個末端與同一分子的另一末端，以及與不同分子的末端相接觸的可能性相等。因而在這樣的條件下，在反應的初始階段中，環(huán)狀分子與多聯體分子的生成速率相等。而當 ji 時，有利于重新環(huán)化；當ij ,則有利于產生多聯體。圖1.9顯示了dna區(qū)段的 大小與連接反應混合物中j

11、:i之比分別為0.5、1、2和5時所需dn a濃度之間關系（d ugaiczyk等，1985）?，F在考慮如下的連接反 應混合物：其中除線狀質粒之外，還含有帶匹配末端的外源dna片 段。 對于一個給定的連接混合物而言， 產生單體環(huán)狀重組的效率不僅受反 應中末端的絕對濃度影響， 而且還受質粒和外源d n a末端的 相對濃度的影響。當i是j的2 3倍（即末端的絕對濃度足以滿足 分子間連接的要求，而又不致引起大量寡聚體分子的形成時） 外源有效重組體的產量可達到最大。 這些條什 下，連接反應終產物的大約40%都是由單體質粒與外源dna所形成的嵌合體。當連接混合物中線瘃質粒的量恒定（ j:i=3 ）而帶匹

12、配末端的外源dna的量遞增時，這種嵌合體在連接反應之末的理論產 量。涉及帶粘端的線狀磷酸化質粒d n a的連接反應應包含：1）足量的載體dna,以滿足j:i1和j:i3。對一個職pucil 般大小的質粒，這意味著連接反應中應含有載體dna為20-60區(qū)g/ml 。2）未端濃度等于或稍高于載體dna的外源dna ,如外源dna濃度比載體低得多， 在效連接產物的數量會很低， 這樣就很難別小部 分帶重組抽粒的轉化菌落。 這種情況下，可考慮采用一些步驟來減少帶非重組質粒的背景菌落。如用磷酸酶處理線狀質粒d na或發(fā)跡 策略以便通過定向的方法構建重組質粒。（ 二）粘端連接1）用適當的限制酶消化質粒和外源

13、dna。如有必要，可用凝膠電 泳分離片段并（或）用堿性磷酸酶處理質粒dna。通過酚：氯仿抽 提和乙沉淀來純化dna,然后用 te（ph7.6）溶液使其濃度為 100/ml 。2）按如下所述設立連接反應混合物：a.將0.1屋 載體dna轉移到無菌微量中，加等摩爾量的外源dnao b.加水至7.5屋，于45c加溫5分鐘以使重新退炎的粘端解鏈，將 混合物冷卻到0 c。c.加入：10xt4噬菌體dna連接酶緩沖液1 t 4噬菌體nd a連接酶 0.1weiss單位5 mmol/l atp 1 ”于16c溫育1 4小時10xt4噬菌體d n a連接酶緩沖液200mmol/l 同 tris.cl（ph7.

14、6）50mmol/k mgcl250mmol/l二硫蘇糖醇500 g/ml牛血清白蛋白（組分v .sigma產品）（可用可不用）該緩訓液應分裝成小份，貯存于 20。另外，再設立兩個對照反應，其中含有（1 ）只有質粒載體；（2 ） 只有外源dna片段。如果外源dna量不足，每個連接反應可用 50-100ng質粒dna,并盡可能多加外源dna,同時保持連接反 應體積不超過10?？捎弥辽?種不同方法來測定t 4噬菌體dn a連接酶的活性。大多數制造廠商（除 new england biolabs 公司 外）現在都用 weiss等，1 1968）對該酶進行標化。1個 weiss單位 是指在37c下20

15、分釧內催化1 mmol32雙焦磷酸根 置換到丫，（3 -32patp所需酶時，1個 weiss單位相當于0.2個用外切核酸酶耐 受試驗來定義的單位（ modrich 和 lehman,1970） 或者 60個粘端單位（如new england biolabs 公司所定義）。因此，0.015weiss 單位 的t 4噬菌體dn a連接酶在16c下30分鐘內可使50%的入噬菌體 hindin片段 （5g）得以連接。在本書中，丁4噬菌體。1人連接 酶一律用weiss單位表示。par目前提供的t 4噬菌體d n a連接酶 均為濃溶液（1-5 單位 / “），可用 20mmol/l tris.cl（ph

16、7.6）、 60mmol/l kcl、5mmol/l二硫蘇糖醇、500區(qū)g/ml牛血清白蛋白、50% 甘稀釋成 100 單位 /ml 的濃度置存。處于這種濃度并在這種緩沖液中的t 4噬體 dna連接酶于-20 c保存3個月可保持穩(wěn)定。3 ）每個樣品各取1 2區(qū)l轉化大腸桿菌。（三）平端dna連接t 4噬菌體dna連接酶不同于大腸桿菌dna連接酶，它可以催化平端dna片段的連接（sgaramella和 khorana,1972;sgaramella 和 ehrlich,1978 ）,由于dna很容易成 為平端，所以這是一個極為有用的酶學物性。有了這樣的 物性，才 能使任何dna分子彼此相連。然而

17、，相對而言，平端連接是低效反 應，它要求以下4個條件：1 ）低濃度（0.5mmol/l）的 atp（ferretti 和 sgaranekka,1981 ）。 2 ）不存在亞精胺一類的多胺。3）極高濃度的連接酶（50weiss單位.ml）。4）高濃度的平端。1 .凝聚劑在反應混合物中加入一些可促進大分子群聚作用并可導致d npheiffer 和zimmerman,1983;zimmermarf口 pheiffer,1983;zimmermant harrison,1985) 或氯化六氨全高鉆(rusche和howard-flanders,1985 )，可以使如何取得適當濃度的平端dna的總是

18、迎刃而解。在連接反應中，這些物質具有兩作用：1)它們可使平端d n a的連接速率加大1 3個數量級，因此可使連接反應在酶dna濃度不高的條件下進行。2)它們可以改變連接產物的分布，分子內連接受到抑制，所形成的連接產物一律是分子間連接的產物。這樣，即使在有利于自身環(huán)化(j:i=10 )的dna濃度下，所有的dn a產物也將是線狀多聚體。par 在設立含凝聚劑的連接反應時，下列資料可供參考。(1 )聚乙二醇(peg80001 )用去離子水配制的p e g 8000貯存液(40%)分裝成小份，冰凍保存， 但加入連接反應混合物之前應將其融化并使其達到室溫。 在含 15peg8000 的連接反應混合物中

19、，對連接反刺激效應最為顯著。除peg800和t 4噬菌體dna連接酶以外，其他所有連接混合物的組分應于0c混合，然后加適當體積的peg 8000(處于室溫)，混勻，加酶后于20進行溫育。2 )連接混合物中含 0.5mmol/l at可口 5mmol/l mgcl2時對連接反應的刺激效應最為顯著，甚至atp濃度略有增加或m gcl2濃度略有降低，都會嚴重降低刺激的強度( pheiffer 和 zimmerman,1983)。3)濃度為15%的peg 8000可刺激帶粘端的dna分子的連接效率提高至原來的 10-100 倍，反應的主產物是串聯的多聯體。4) peg 8000可刺激短至8個核甘酸的合

20、成寡聚物的平端連接，在這一方面，它與氯化六氨合高鈷有所不同。(2 )氯化六氨合高鉆1 )氯化六氨合高鉆可用水配成10mmol/l貯存液貯存于-20 c,它對連接反應的刺激具有高度的濃度信賴性。 當連接反應混合物中鹽深度為1.0-1.5mol/l時，其刺激作用最大。氯化六氨合高鉆可使平端連接的效率大約提高到原來的50幡瓦但只能使端連接的效率提高到原來的 5 倍 (rusche和 howard-flanders,1985 )。2)在單價陽離子(30mmol/l kcl)存在下，它對平端連接仍有一定的刺激作用， 但此時連接產物的分布有所改變。 連接產物不再是清一色的分子間連接產物，相反，環(huán)狀dn a將點盡優(yōu)勢。3)與peg 8000不同，氯化六氨合高鉆不能顯著提高合成寡核昔酸的連接速率。一、轉化由于外源dna勺進入而使細胞遺傳性改變稱為轉化，早在 1943年， avery等就發(fā)現有毒肺炎雙球菌的dnaw無毒肺炎雙球菌共培養(yǎng)后產 生有毒性的肺炎 雙球菌后代的轉化現象。但 dnas入細胞的效率很 低， 在分子生物學和基因工程工作中可采取一些方法處理細胞， 經處 理后的細