《DNA的粗提取與鑒定》教案

1、DNA的粗提取與鑒定【考試說(shuō)明要求】1.制備和應(yīng)用固定化酶（A）2. 酵母細(xì)胞的固定化（B）【課堂活動(dòng)】基礎(chǔ)回顧一、實(shí)驗(yàn)原理1DNA的溶解性 DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度（如2mol/L）就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反(DNA在濃度為0.14mol/L的NaCl溶液中，溶解度最小)，以達(dá)到分離目的。此外，DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步的分離。2DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性 蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對(duì)DNA沒(méi)有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受6080oC的

2、高溫，而DNA在80oC以上才會(huì)變性。洗滌劑能夠瓦解細(xì)胞膜，但對(duì)DNA沒(méi)有影響。3DNA的鑒定 在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色，因此二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。二、實(shí)驗(yàn)材料的選取 凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但是使用DNA含量相對(duì)較高的生物組織，成功的可能性更大，如雞血（原因：DNA含量豐富，材料易得，雞血細(xì)胞吸水易脹破）。若用動(dòng)物組織如豬肝，則需研磨。三、過(guò)程1破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液 動(dòng)物細(xì)胞的破碎比較容易，以雞血細(xì)胞為例，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒攪拌，過(guò)濾后收集濾液即可。如果實(shí)驗(yàn)材料是植物細(xì)胞，需要先用洗滌劑溶解細(xì)胞膜。例如，提取洋蔥的D

3、NA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進(jìn)行充分的攪拌和研磨，過(guò)濾后收集研磨液。注意：為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。如果研磨不充分，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響?研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。此步

4、驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)。2 去除濾液中的雜質(zhì) 方案一的原理是DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白質(zhì)，不分解DNA；方案三的原理是蛋白質(zhì)和DNA的變性溫度不同。注意：為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過(guò)反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。方案二與方案三的原理有什么不同？方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開(kāi)；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)

5、高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離（6075的恒溫水浴保溫1015min）。3 DNA的析出與鑒定 將處理后的溶液過(guò)濾，加入與濾液體積相等、冷卻的酒精溶液，靜置23min，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物，這就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水分。取兩支20ml的試管，各加入物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液5ml，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4ml的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝螅瑢⒃嚬苤糜诜兴屑訜?min，待試管冷卻后，比較兩支試管溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否變藍(lán)。四、注意事項(xiàng)1以

6、血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，每100ml血液中需要加入3g檸檬酸鈉防止血液凝固。2加入洗滌劑后，動(dòng)作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫，不利于后續(xù)步驟地操作。加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。3二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會(huì)影響鑒定的效果。4DNA的溶解度與NaCl溶液濃度的關(guān)系：當(dāng)NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時(shí)，隨濃度的升高，DNA的溶解度降低；當(dāng)NaCl溶液濃度高于0.14mol/L時(shí)，隨濃度升高，DNA的溶解度升高。5盛放雞血細(xì)胞液的容器，最好是塑料容器。雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于細(xì)胞內(nèi)DNA的含量本

7、來(lái)就比較少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就會(huì)更少。因此，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中最好使用塑料的燒杯和試管，這樣可以減少提取過(guò)程的DNA的損失。診斷檢測(cè)1.下列圖示中能反映DNA溶解度與NaCl溶液濃度之間關(guān)系的是：2.在DNA粗提取的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，得到的絲狀物主要成分就是DNA， 依據(jù)是 A絲狀物易溶于2molL的氯化鈉溶液中 B絲狀物溶解后，遇二苯胺(沸水浴)變藍(lán)色 C絲狀物能在約為O14molL氯化鈉溶液中析出 D加酒精可使溶解的絲狀物再被析出3.在“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中，向5mL血細(xì)胞液中加入20mL蒸餾水的目的是A.使血細(xì)胞破裂 B.防止血液凝固 C.析出DNA D.使蛋白質(zhì)與DN

8、A分離4.在NaCl溶液中反復(fù)溶解、析出并過(guò)濾，就能除去DNA溶液中的雜質(zhì)的理由不包括 ( ) A用高濃度鹽溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì) B用低濃度鹽溶液使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì) C反復(fù)操作就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì) D反復(fù)操作就能夠使各種雜質(zhì)變性而沉淀析出典例引路在采用雞血為材料對(duì)DNA進(jìn)行粗提取的實(shí)驗(yàn)中，如果需要進(jìn)一步提取雜質(zhì)較少的DNA，可以依據(jù)的原理是( )A.在物質(zhì)的量濃度為0.14 mol/L的氯化鈉溶液中DNA的溶解度最小B.DNA遇二苯胺在沸水浴的條件下會(huì)變成藍(lán)色C.DNA不溶于酒精而細(xì)胞中的一些物質(zhì)易溶于酒精D.質(zhì)量濃度為0.1

9、g/mL的檸檬酸鈉溶液具有抗凝血作用有關(guān)DNA粗提取的操作，錯(cuò)誤的是A向溶解DNA的燒杯中加蒸餾水的目的是漂洗DNABDNA和雜質(zhì)分子在95%的冷酒精中溶解度存在差異C提取植物細(xì)胞DNA時(shí)需在研缽中加入洗滌劑和氯化鈉等試劑D提取動(dòng)物細(xì)胞DNA時(shí)可用雞血與蒸餾水混合后用玻璃棒攪拌 歸納總結(jié)1.雞血細(xì)胞的DNA提取2.實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵(1) 取材不用哺乳動(dòng)物的血細(xì)胞( 由于成熟紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核)。(2)獲取 DNA 時(shí)要向雞血細(xì)胞液加入足量的蒸餾水，以便使細(xì)胞膜和核膜破裂，把核內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)。(3)實(shí)驗(yàn)中的攪拌，除最后一次攪拌外，其余攪拌均要朝一個(gè)方向。并且，在析出 DNA、DNA 再溶解和提取中，各步驟攪

10、拌都要輕緩，玻璃棒不要直插燒杯底部，防止 DNA 分子斷裂。3.此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有幾次使用蒸餾水？幾次過(guò)濾，幾次析出，幾次攪拌？答：整個(gè)實(shí)驗(yàn)共“兩次蒸餾水，三次過(guò)濾，兩次析出”兩次蒸餾水第一次：細(xì)胞吸水脹破 第二次：使 DNA黏稠物析出 三次過(guò)濾第一次： DNA存在于濾液里 第二次： DNA被留在紗布上 第三次： DNA存在于濾液里 過(guò)濾時(shí)使用的紗布層數(shù)與需用濾液或黏稠物有關(guān)，第二次要用其濾出的黏稠物有關(guān)，所以要使用多層紗布，第一次和第三次均要用其濾液，使用的紗布為12層兩次析出第一次：用0.14 molL 的NaCl溶液,含雜質(zhì)多第二次：用冷卻的95的酒精 4.預(yù)冷的酒精溶液具有的優(yōu)點(diǎn)抑制核酸水

11、解酶活性，防止 DNA 降解。降低分子運(yùn)動(dòng)易于形成沉淀析出。低溫有利于增加 DNA 分子柔韌性，減少斷裂。5.評(píng)價(jià)：觀察你提取的DNA顏色，如果不是白色絲狀物，說(shuō)明DNA中的雜質(zhì)較多；二苯胺鑒定出現(xiàn)藍(lán)色說(shuō)明實(shí)驗(yàn)基本成功，如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能所提取的DNA含量低，或是實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)錯(cuò)誤，需要重新制備本實(shí)驗(yàn)提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)6.酒精的使用觀察花生種子子葉細(xì)胞脂肪顆粒時(shí)，用體積分?jǐn)?shù)為50的酒精洗去浮色葉綠體色素的提取和分離實(shí)驗(yàn)中，用無(wú)水酒精作有機(jī)溶劑提取色素制作洋蔥根尖細(xì)胞裝片時(shí)，用鹽酸和酒精的混和液對(duì)根尖進(jìn)行解離DNA粗提取過(guò)程中，用體積分?jǐn)?shù)為95的冷卻酒精可以進(jìn)一

12、步純化DNA70%的酒精用于消毒，如果酒的制作 變式訓(xùn)練（多選）下列DNA粗提取的實(shí)驗(yàn)操作中，經(jīng)離心或過(guò)濾后取上清液或?yàn)V液的有A在新鮮雞血中加入適量的檸檬酸鈉，混合均勻后離心B在盛有血細(xì)胞的塑料燒杯中加蒸餾水，快速攪拌后過(guò)濾C在2molL的氯化鈉溶液中放入絲狀物，輕輕攪拌后過(guò)濾 D在溶有DNA的氯化鈉溶液中緩緩加入蒸餾水，輕輕攪拌后過(guò)濾當(dāng)堂反饋1.下列關(guān)于 DNA 粗提取與鑒定的說(shuō)法中，正確的是A.析出 DNA 時(shí)要緩慢地加蒸餾水，當(dāng)析出黏稠物時(shí)即不再加水B.在探究洗滌劑對(duì)植物細(xì)胞 DNA 提取的影響實(shí)驗(yàn)中，自變量是洗滌劑和食鹽C.提取的 DNA 溶解后加入二苯胺試劑即可染成藍(lán)色D.將含有 D

13、NA 的濾液放在 6075的恒溫水浴箱中保溫后過(guò)濾，能去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)2.（多）“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中，將含有一定雜質(zhì)的DNA絲狀物分別放入體積為2mL 的四種溶液中，經(jīng)攪拌后過(guò)濾，獲得4種濾液，含DNA較少的是 1蒸餾水中攪拌后過(guò)濾濾液E 2 2molL的NaCl溶液攪拌后過(guò)濾濾液F 3 O14molL的NaCl溶液中攪拌后過(guò)濾濾液G 4冷卻的95的酒精溶液中攪拌后過(guò)濾濾液H A濾液E B濾液F C濾液G D濾液H3.在DNA的粗提取與鑒定試驗(yàn)中，有兩次DNA的沉淀析出，其依據(jù)的原理是 DNA在NaCl的物質(zhì)的量的濃度為O.1 4molL時(shí)，溶解度最低 DNA在冷卻的體積分?jǐn)?shù)為95的酒精

14、中能沉淀析出 A兩次都是 B兩次都是C第一次是，第二次是 D第一次是，第二次是4.（多選）有關(guān)DNA粗提取的操作，正確的是A盛放雞血細(xì)胞液的容器最好是塑料容器B將雞血細(xì)胞液與蒸餾水混合，用玻璃棒沿一個(gè)方向快速攪拌，釋放DNAC向溶解DNA的燒杯中加蒸餾水的目的是漂洗DNAD用漏斗和濾紙過(guò)濾析出的DNA，得到DNA粘稠物5.在DNA粗提取實(shí)驗(yàn)中，為得到含DNA的黏稠物，某同學(xué)進(jìn)行了如下操作：在新鮮雞血中加入適量的檸檬酸鈉，經(jīng)離心后，除去血漿留下血細(xì)胞備用。取510mL血細(xì)胞放入50mL的塑料燒杯中，并立即注入20mid015molL的氯化鈉溶液，快速攪拌5min后經(jīng)濾紙過(guò)濾，取得其濾液。濾液中加

15、人40mL2molL的氯化鈉溶液，并用玻璃棒一個(gè)方向快速攪拌lmin。上述溶液中緩緩加人蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒沿一個(gè)方向不停地輕輕攪拌，同時(shí)加蒸餾水，直到溶液中出現(xiàn)絲狀物為止，再進(jìn)行過(guò)濾而得到含DNA的黏稠物。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果是：所得含DNA的黏稠物極少，導(dǎo)致下一步實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行。 請(qǐng)指出并改正該同學(xué)的實(shí)驗(yàn)操作上的三個(gè)錯(cuò)誤：(3分) ， ， 。(2)按正確操作提取和過(guò)濾黏稠物后，再溶解黏稠物所用的溶劑為 (標(biāo)明濃度)；提取含雜質(zhì)較少的DNA的方法是 。 (3)鑒定DNA的試劑是 試劑，DNA鑒定時(shí)對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置方法為 。(2分)(4)采用?；蜓虻难鹤鰧?shí)驗(yàn)，取材方便，但即使正確操作也無(wú)法提取到DNA，而

16、用動(dòng)物的肝臟組織作為實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好，原因是 ，實(shí)驗(yàn)中最好增加一步驟為 。 （10分）（1）0.015mol/L的氯化鈉溶液應(yīng)改為蒸餾水；濾紙應(yīng)改為紗布；直到溶液中出現(xiàn)絲狀物為止應(yīng)改為直到溶液中絲狀物不再增加為止（每項(xiàng)1分）（2）2mol/L的NaCl溶液 加入冷卻的、體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精（3）二苯胺 向試管中只加0.015mol/L的NaCl溶液和二苯胺試劑，不加DNA，沸水浴（4）哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞核 研磨提取雞血細(xì)胞的細(xì)胞核物質(zhì) 將制備好的雞血細(xì)胞液5 mL10mL，注入到50 mL燒杯中。向燒杯中加入蒸餾水20 mL，同時(shí)用玻璃棒充分?jǐn)嚢? min，使血細(xì)胞加速破裂。

17、然后，用放有紗布的漏斗將血細(xì)胞液過(guò)濾至500mL。取其濾液。溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA 將氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為 2 mol/L 40mL加入到濾液中，并用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌1min，使其混合均勻，這時(shí)DNA在溶液中呈溶解狀態(tài)析出含DNA的粘稠物 沿?zé)瓋?nèi)壁緩緩加入蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒不停地輕輕攪拌，這時(shí)燒杯中有絲狀物出現(xiàn)，注意觀察絲狀物呈什么顏色。繼續(xù)加入蒸餾水，溶液中出現(xiàn)的粘稠物會(huì)越來(lái)越多。當(dāng)粘稠物不再增加時(shí)停止加入蒸餾水（這時(shí)溶液中氯化鈉的物質(zhì)的量濃度相當(dāng)于0.14 molL）濾取含DNA的粘稠物 用放有多層紗布的漏斗，過(guò)濾步驟3中的溶液至 500mL的燒杯中，含 DNA的粘稠物被留在紗布上將DNA的粘稠物再溶解 取 1個(gè) 50 mL燒杯，向燒杯內(nèi)注入氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為 2 molL的溶液 20mL。用鈍頭鑷子將紗布上的粘稠物夾至氯化鈉溶液中，用玻璃擇不停地?cái)嚢?，使粘稠物盡可能多地溶解于溶液中過(guò)濾含有DNA的氯化鈉溶液 取1個(gè)100 mL燒杯，用放有兩層紗布的漏斗過(guò)濾步驟5中的溶液。取其濾液，DNA溶于濾液中提取含雜質(zhì)較少的DNA 在