生物化學實驗指導 - 泰山醫(yī)學院

1、生物化學實驗指導生物化學教研室前 言21世紀是生命科學的世紀,生物化學與分子生物學是當代生命科學領(lǐng)域中一門重要的基礎(chǔ)學科,它涵蓋的基礎(chǔ)理論,基本知識,基本技術(shù)與醫(yī)學研究各學科領(lǐng)域密切相關(guān),其理論與技術(shù)的發(fā)展,推動了生命科學的發(fā)展,對人類的科技進步與文明產(chǎn)生巨大影響。 生物化學實驗是醫(yī)學院校學生必修的一門基礎(chǔ)實驗技術(shù)課程，其研究技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用是依據(jù)物理學、化學及生物學的基本理論和實驗方法而建立起來的。20世紀20年代微量分析的發(fā)展，30年代電子顯微鏡的出現(xiàn)，40年代層析技術(shù)和電泳技術(shù)的興起，以及同位素示蹤技術(shù)、各種光譜技術(shù)、核磁共振技術(shù)的應(yīng)用，激光、超導等新技術(shù)的出現(xiàn)，電子計算機技術(shù)的突飛猛進

2、，使生物化學實驗手段提高到一個嶄新的水平，掌握生物化學實驗方法和研究技術(shù)，對醫(yī)學院校學生來說是十分重要的。 本門課程主要側(cè)重于給學生以基本的實驗方法和技能的訓練，讓學生了解并掌握生物化學的四大基本實驗方法，即：分光光度法、離心法、層析法和電泳法。同時也注意引進一些新近發(fā)展起來的、重要的生物化學及分子生物學研究技術(shù)，作為學生學習其他專業(yè)課程和進入科學研究領(lǐng)域的準備。 由于編者水平有限，教材中可能有一些錯誤和不足，望同行專家和使用者提出寶貴意見。 編 者 2012.03目 錄第一章 生物化學實驗基本知識與操作 .5第一節(jié) 生物化學實驗基本 .5第二節(jié) 生物化學實驗基本操作 .8第二章 分光光度技術(shù)

3、 .25 實驗一 雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度 .39實驗二 folin-酚試劑法(lowry法)測定蛋白質(zhì)濃度 .41實驗三 紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度.43實驗四 考馬斯(comessie)亮蘭結(jié)合法測定蛋白質(zhì)濃度 .45實驗五 bca法測定蛋白質(zhì)濃度 .48實驗六 激素對血糖濃度的影響及血糖的測定 .50實驗七 堿性磷酸酶(akp)米氏常數(shù)(km)的測定和底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響 .57第三章 生物大分子的提取、沉淀和離心分離技術(shù).61第一節(jié) 生物材料的選取與預(yù)處理 . .61第二節(jié) 生物大分子的沉淀分離技術(shù) .66第三節(jié) 生物大分子離心分離技術(shù) .69實驗八 雞血sod的提取、分離及活

4、力測定 .76實驗九 堿性磷酸酶的制備及活力測定.79實驗十 酪蛋白的制備 .83實驗十一 細胞核蛋白質(zhì)的提取 85實驗十二 動物肝臟中提取dna 88實驗十三 豬心肌細胞線粒體可溶性atp合酶的提純 91第四章 電泳技術(shù) .96實驗十四 dna瓊脂糖凝膠電泳 . 105實驗十五 血漿脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳 .109實驗十六 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離乳酸脫氫酶同工酶 .113實驗十七 蛋白質(zhì)分子量的測定sds-聚丙烯凝膠電泳 .120實驗十八 聚丙烯酰胺等電聚焦電泳 .123實驗十九 醋酸纖維素薄膜對血清蛋白質(zhì)的電泳 129實驗二十 雙向電泳 131實驗二十一 垂直板sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離

5、血清脂蛋白蛋白質(zhì)143第五章 層析技術(shù) .147第一節(jié) 層析技術(shù)概述 .147第二節(jié) 吸附層析 .148第三節(jié) 分配層析 .150第四節(jié) 離子交換層析 .152第五節(jié) 凝膠層析 . .155第六節(jié) 親和層析 .159第七節(jié) 高效液相層析 .160實驗二十二 氨基酸的紙上層析與氨基酸的轉(zhuǎn)氨基作用162實驗二十三 血清-球蛋白的分離純化與鑒定 .165實驗二十四 親和層析純化胰蛋白酶 .170實驗二十五 離子交換層析分離氨基酸.174實驗二十六 蛋白質(zhì)分子量測定凝膠過濾層析法177第六章 分子生物學基本技術(shù) .181第一節(jié) 核酸分子雜交 .181第二節(jié) 聚合酶鏈反應(yīng). .185第三節(jié) 分子克隆 .

6、189實驗二十七 限制性內(nèi)切酶消化dna分子 193實驗二十八核糖核酸（rna）的提取 195實驗二十九 southern雜交分析 .198實驗三十 northern雜交分析 .203實驗三十一 pcr基因擴增 .206實驗三十二 rt-pcr擴增目的基因cdna 209實驗三十三 瓊脂糖凝膠中dna片段的回收 211實驗三十四 質(zhì)粒dna的提取及酶切 . .213實驗三十五 質(zhì)粒載體和外源dna的連接反應(yīng) 217實驗三十六 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化 219實驗三十七 克隆的篩選和快速鑒定 222附錄一 常用緩沖液的配制方法.224附錄二 易變質(zhì)及需要特殊方法保存的試劑 . 235附錄三

7、 一般化學試劑的分級 .236附錄四 english words in the lab .237第一章 生物化學實驗基本知識與操作第一節(jié) 生物化學實驗基本知識一、實驗課目的與要求（一）實驗課目的1加深對生物化學基本理論的理解和掌握。2掌握生物化學的基本實驗方法和實驗技術(shù)。3培養(yǎng)學生嚴謹?shù)目茖W態(tài)度和思維能力以及獨立分析問題和解決問題的能力。（二）實驗課要求 1實驗前必須預(yù)習實驗指導和有關(guān)理論，明確實驗?zāi)康?、原理、預(yù)期的結(jié)果，操作關(guān)鍵步驟及注意事項。 2實驗時要嚴肅認真專心進行操作，注意觀察實驗過程中出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果，結(jié)果不良時，必須重做。 3實驗中，應(yīng)及時將實驗結(jié)果如實記錄下來，并請老師當場審核

8、。根據(jù)實驗結(jié)果進行科學分析，按時將實驗報告交教師評閱。二、實驗室規(guī)則 1嚴肅、認真、積極、主動地上好實驗課。進實驗室時要穿戴好隔離衣，不得穿拖鞋、背心出入實驗室，以免酸堿腐蝕皮膚。 2進實驗室前準備好實驗指導、課本、筆記、實驗記錄本、報告本、文具等。3要保持實驗臺整潔，試劑、儀器應(yīng)整齊,按次序放置。實驗完畢要按各類儀器的清洗方法和要求將儀器清洗干凈。 4實驗室是培養(yǎng)學生獨立思考、獨立工作能力及良好科學作風的重要場所，操作務(wù)必認真不得敷衍，室內(nèi)應(yīng)保持肅靜，不得吸煙、玩鬧 ，不得隨地吐痰，亂丟紙屑。實驗后要清掃實驗臺面、地面、試劑瓶要碼放整齊。5要愛護儀器、節(jié)約藥品。第一次實驗時要按儀器清單清點儀

9、器，負責保管，用后如數(shù)交還,在使用時如有破損，及時報告，經(jīng)指導教師檢查后填寫破損單，按學校規(guī)定賠償。6貴重儀器，如分光光度計、離心機等，要盡力愛護，使用前應(yīng)熟悉使用方法，嚴格遵守操作規(guī)程，嚴禁隨意開動。 7要節(jié)約水電，一經(jīng)用完隨手關(guān)閉水門、電門。三、值日生任務(wù)1領(lǐng)發(fā)本次所用儀器、物品，清點、交還臨時用儀器、物品，若有損壞負責追查賠償。 2管理操作公用儀器，打蒸餾水。 3搞好實驗室衛(wèi)生，做到儀器、桌面、地面、水池全干凈。 4確保安全：管好儀器、門窗、水電。 5請任課及實驗室老師檢查工作，認可后方能離開實驗室。四、試劑使用規(guī)則 1使用試劑前應(yīng)仔細辨認標簽，看清名稱及濃度，是否為本實驗所需要。2取出

10、試劑后，立即將瓶塞蓋好，切勿蓋錯，放回原處。試劑瓶塞、專用吸量管、滴管，不得與試劑瓶分家，以免錯用而污染試劑，造成自己或他人實驗的失敗。未用完的試劑不得倒回瓶內(nèi)。昂貴的sephadex、sepharose凝膠和deae纖維素等，用后必須及時回收，不得丟棄。 3使用滴管時，滴管尖端朝下，切勿倒置，勿使試劑流入橡皮帽內(nèi)。 4使用有毒試劑及強酸強堿時，盡可能用量筒量取，若用吸管時只能用吸耳球吸取，切勿用嘴吸取，以免造成意外。 五、廢棄物處理 1所有固體廢棄物如：用過的濾紙、棉花、碎屑沉淀物和電泳后的凝膠等必須傾棄于垃圾筒中。 2濃酸必須棄于小缽中，用水稀釋后倒入水池中。六、安全注意事項 1低沸點有機

11、溶劑，如乙醚、石油醚、酒精等均系易燃物品，使用時應(yīng)禁明火、遠離火源，若需加熱要用水浴加熱，不可直接在火上加熱。 2. 若發(fā)生酸堿灼傷事故，先用大量自來水清洗，酸灼傷者用飽和nahc03溶液中和，堿灼傷者用飽和h3b03溶液中和，氧化劑傷害者用na2s204處理。 3若發(fā)生起火事件，根據(jù)發(fā)生起火性質(zhì)分別采用砂、水、c02或ccl4滅火器撲滅。 4離開實驗室必須關(guān)好窗戶，切斷電源、水源，以確保安全。七、實驗室意外事故的處理實驗室如遇著火、燙傷、割傷等意外事件發(fā)生，必須鎮(zhèn)靜，作緊急處理，并立即報告教員，作如下處理：1、著火：如酒精燈推倒或其他原因起火，首先將一切易燃物品移至安全處，然后將火撲滅。滅火

12、方法：可用濕布或工作服蓋上撲滅，或蓋上一層沙撲滅。如乙醚、油類等比水輕易燃的物品著火時，切勿用水，火勢大時速取滅火器滅之。2、火傷：皮膚被火灼傷，用燙傷軟膏涂之，如傷勢較重，即送醫(yī)院。3、藥品傷：皮膚被藥品所侵蝕，應(yīng)據(jù)藥品的性質(zhì)加以適當處理后，用單寧油膏或凡士林涂之，如是酸或堿，則先用大量水沖洗，然后用5%的小蘇打液或1%醋酸分別處理。如眼睛為藥品所侵入，用水洗去后，繼以5%的小蘇打液或1%的硼酸液沖洗，視侵入藥品的性質(zhì)而定。必要時，去醫(yī)院處理。4、割傷出血：凡遇到玻璃割傷出血，可用碘酒或紅藥水消毒后（切忌碘酒與紅藥水同時應(yīng)用），用紗布包扎。如有玻璃留在傷口，應(yīng)先取出再作處理。5、毒物入口：有

13、毒之物切勿用吸管直接用口吸取。如遇毒物入口，除酸、堿外，應(yīng)先使之嘔吐，用芥子粉或0.06克吐酒石溶于2毫升水中作致吐劑，溫鹽水肥皂水也可用。如是腐蝕性物質(zhì)，則飲以雞蛋清作潤滑劑。第二節(jié) 生物化學實驗基本操作一、玻璃儀器的清潔及使用（一）玻璃儀器的清潔1玻璃儀器的清洗實驗中所用的玻璃儀器清潔與否，直接影響實驗的結(jié)果，往往由于儀器的不清潔或被污染而造成較大的實驗誤差，有時甚至會導致實驗的失敗。 做生物化學實驗對玻璃儀器清潔程度的要求，比一般化學實驗的要求更高。這是因為：生物化學實驗中蛋白質(zhì)、酶、核酸等往往都是以“毫克”和“微克”計的，稍有雜質(zhì)，影響就很大。生物化學實驗對許多常見的污染雜質(zhì)十分敏感，

14、如金屬離子（鈣、鎂離子等）、去污劑和有機物殘基等，因此玻璃儀器（包括離心管等塑料器皿）是否徹底清洗凈就是非常重要的。 新購玻璃儀器的清洗 新購買的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性物質(zhì)，可先用0.5的去污劑洗刷，再用自來水洗凈，然后浸泡在12鹽酸溶液中過夜（不可少于四小時），再用自來水沖洗，最后用無離子水沖洗兩次，在100120烘箱內(nèi)烘干備用。 使用過的玻璃儀器的清洗一般非計量玻璃儀器或粗容量儀器：如試管、燒杯、量筒等普通玻璃儀器，可直接用毛刷蘸餐洗凈刷洗，然后用自來水沖洗，直至器壁內(nèi)外既不聚成水滴也不成股流下即可。最后用少量蒸餾水沖洗內(nèi)壁23次，倒置晾干即可。容量分析儀器：容量瓶、滴定管及吸管等

15、容量儀器，用后用自來水多次沖洗，如能清潔（壁不掛水珠），再用蒸餾水少量沖洗23次晾干即可備用。若仍不干凈附有油污等，則須于干后放入鉻酸洗液內(nèi)浸泡數(shù)小時，然后倒凈（或撈出）洗液，用自來水充分沖洗至水不顯黃色后再沖幾次，最后用少量蒸餾水沖洗23次晾干備用。 比色皿的清洗決不可用強堿清洗，因為強堿會浸蝕拋光的比色皿。只能用洗液或12的去污劑浸泡，然后用自來水沖洗，這時使用一支綢布包裹的小棒或棉花球棒刷洗，效果會更好，清洗干凈的比色皿也應(yīng)器壁內(nèi)外既不聚成水滴也不成股流下。切忌用刷子、粗糙的布或濾紙等擦試。洗凈后，倒置晾干備用。2塑料器皿的清洗 聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化學實驗中已用的越來

16、越多。第一次使用塑料器皿時，可先用8mol/l尿素（用濃鹽酸調(diào)ph = 1）清洗，接著依次用無離子水、1 mol/l koh和無離子水清洗，然后用103 mol/l edta 除去金屬離子的污染，最后用無離子水徹底清洗，以后每次使用時，可只用0.5的去污劑清洗，然后用自來水和無離子水洗凈即可。3洗液的配制因己確定鉻有致癌作用，因此配制和使用洗液時要極為小心，常用兩種配制方法如下： 取100ml 工業(yè)濃硫酸置于燒杯內(nèi)，小心加熱，然后慢慢加入5g重鉻酸鉀粉末，邊加邊攪拌，待全部溶解并緩慢冷卻后，貯存在磨口玻璃塞的細口瓶內(nèi)。 稱取5g重鉻酸鉀粉末，置于250ml 燒杯中，加5ml 水使其溶解，然后慢

17、慢加入100ml 濃硫酸，溶液溫度將達80，待其冷卻后貯存于磨口玻璃瓶內(nèi)。 4其他洗滌液 工業(yè)濃鹽酸：可洗去水垢或某些無機鹽沉淀。 5草酸溶液：用數(shù)滴硫酸酸化，可洗去高錳酸鉀的痕跡。 510磷酸三鈉（na3po412h2o）溶液：可洗滌油污物。 30硝酸溶液：洗滌二氧化碳測定儀及微量滴管。 510乙二胺四乙酸二鈉（edta-na2）溶液：加熱煮沸可洗脫玻璃儀器內(nèi)壁的白色沉淀物。 尿素洗滌液：為蛋白質(zhì)的良好溶劑，適用于洗滌盛過蛋白質(zhì)制劑及血樣的容器。 有機溶劑：如丙酮、乙醚、乙醇等可用于洗脫油脂、脂溶性染料污痕等，二甲苯可洗脫油漆的污垢。 氫氧化鉀的乙醇溶液和含有高錳酸鉀的氫氧化鈉溶液：這是兩種

18、強堿性的洗滌液，對玻璃儀器的侵蝕性很強，可清除容器內(nèi)壁污垢，洗滌時間不宜過長，使用時應(yīng)小心慎重。5玻璃和塑料器皿的干燥：生化實驗中用到的玻璃和塑料器皿經(jīng)常需要干燥，一般地說洗凈后的玻璃儀器，如不急用應(yīng)倒放在晾架上令其自然干燥。若有急用可放在烘烤箱中110120烤干，但容量玻璃儀器，如容量瓶、吸量管、滴定管以及燒結(jié)、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的玻璃儀器等，嚴禁烘烤。此類儀器，如急用可采用水泵抽氣法干燥。硝酸纖維素的塑料離心管加熱時會發(fā)生爆炸，所以決不能放在烘箱中干燥，只能用冷風吹干。（二）常用玻璃儀器的使用1、吸量管吸量管是生化實驗最常用的儀器之一，測定的準確度和吸量管的正確選擇和使用有密切關(guān)系。常用的吸量管可以

19、分為三類： 刻度吸量管 刻度吸量管是多刻度吸量管，供量取10ml以下任意體積的溶液，有0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0毫升等規(guī)格。吸量管刻度所標的數(shù)字有自上而下和自下而上兩種，使用之前應(yīng)仔細分辨。有“快”字則為快流式，有“吹”字則為吹出式，無“吹”字的吸管不可將管尖的殘留液吹出。吸、放溶液前要用吸水紙擦拭管尖。 移液管 常用來量取50ml、25ml、10ml、5ml、2ml、1ml的液體，這種吸量管只有一個刻度，放液時，量取的液體自然流出后，管尖需在盛器內(nèi)壁停留15秒鐘，注意管尖殘留液體不要吹出。 奧氏吸量管 在量取粘度較大的液體如血液、血清等時，應(yīng)當使用奧氏吸管。這種

20、吸管也是單標的，并且在其下端有一個膨大部分。所以液體與吸管表面接觸面積較小，當量取血液時，較他種吸管準確。奧氏吸管的容量包括遺留在尖端的液體，故在緩緩使液體流出后，再停留數(shù)秒鐘，吹出最后一滴。在學生實驗中常用的有0.5、1.0、2.0、3.0ml等規(guī)格。 圖1-1 三類吸量管簡圖l、2 刻度吸量管 3奧氏吸量管 4移液管【吸量管的使用】(1) 選用原則 準確量取整數(shù)量液體，應(yīng)選用奧氏吸量管。量取大體積時要用移液管。量取任意體積的液體時，應(yīng)選用取液量最接近的吸量管。如欲取0.15ml液體，應(yīng)選用0.2ml的刻度吸量管。同一定量試驗中，如欲加同種試劑于不同管中，并且取量不同時，應(yīng)選擇一支與最大取液

21、量接近的刻度吸量管。如各試管應(yīng)加的試劑量為0.30、0.50、0.70、0.90ml時，應(yīng)選用一支1.0ml刻度吸量管。(2) 吸量管的使用執(zhí)管：將中指和拇指拿住吸量管上口以食指控制流速;刻度數(shù)字應(yīng)朝向操作者。取液：把吸量管插入液體內(nèi)(切忌懸空，以免液體吸入洗耳球內(nèi))，用洗耳球吸取液體至所取液量的刻度上端1-2cm處，然后迅速用食指按緊吸量管上口，使管內(nèi)液體不再流出。調(diào)準刻度：將已吸足液體的吸量管提出液面，用濾紙片抹干管尖外壁液體，然后垂直提起吸量管于供器內(nèi)口(管尖懸離供器內(nèi)液面)。 用食指控制液流至所需刻度，此時液體凹面、視線和刻度應(yīng)在同一水平面上，并立即按緊吸量管上口。 放液：放松食指，讓

22、液體自然流入受器內(nèi)，(如移液管標有“吹”字，則應(yīng)將管口殘余液滴吹入受器內(nèi))此時，管尖應(yīng)接觸受器內(nèi)壁，但不應(yīng)插入受器內(nèi)的原有液體之中，以免污染吸量管及試劑。洗滌：吸取血液、尿、組織樣品及粘稠試劑的吸量管，用后應(yīng)及時用自來水沖洗干凈。如果吸取一般試劑的吸量管可不必馬上沖洗，待實驗完畢后，用自來水沖洗干凈。晾干水分，再浸泡于鉻酸洗液中，數(shù)小時后，再用流水沖凈，最后用蒸餾水沖洗。晾干備用。 圖l-2 放液體時的姿勢 2微量移液器微量移液器在生化實驗中大量地使用，它們主要用于多次重復(fù)的快速定量移液，可以只用一只手操作，十分方便。移液器可分為二種：一種是固定容量的，常用的有10ml、100 ml和1000

23、ml等多種規(guī)格。另一種是可調(diào)容量的移液器，常用的有100ml 、200ml、500ml和 1000ml等幾種。每種移液器都有其專用的聚丙烯塑料吸頭，吸頭通常是一次性使用，當然也可以清洗后重復(fù)使用，而且此種吸頭還可以進行120高壓滅菌。 微量移液器的結(jié)構(gòu)見圖l-3，液體吸收鈕。體積選取鈕。體積顯示。槍頭排放鈕。槍頭排放器。槍頭接嘴。其內(nèi)部柱塞分2段行程，第l檔為吸液，第2檔為放液。 圖l-3微量移液器的結(jié)構(gòu) 圖l-4持移液器的姿勢 注：推動按鈕內(nèi)部的活塞分2段行程，第一檔為吸液，第二檔為放液，手感十分清楚。 微量移液器的操作 1）調(diào)體積選取鈕至所需體積值；2）套上槍頭，旋緊； 3）垂直持握微量移

24、液器用大拇指按至第一檔；4）將槍頭插入溶液，徐徐松開大拇指，使其復(fù)原； 5）將微量移液器移出液面，必要時可用紗布或濾紙拭去附于槍頭表面的液體(注意：不要接觸吸頭孔口)； 6）排放時，重新將大拇指按下，至第一檔后，繼續(xù)按至第二檔以排空液體。 注意：移取另一樣品時，按槍頭排放鈕棄掉槍頭并更換新槍頭。3容量瓶及量筒：容量瓶是一個細長頸梨形的平底瓶，具有磨口塞，頸上有標線，表示在所示溫度下（一般為20）當液體充滿到標線時，液體體積恰好與瓶下所注明的體積相等。容量瓶有10、25、50、100、200、250、500、1000、2000毫升等規(guī)格。容量瓶是裝量型的定量容器，多用作稀釋溶液或配制精確試劑。當

25、將液體加至刻度后須用瓶塞塞好，顛倒混勻數(shù)次方可使用。容量瓶是較精確的定量容器，不得直接加熱或烘烤，也不應(yīng)將盛有溶液的容量瓶放入冰箱內(nèi)。當配制溶液需要加熱促其溶解時，必須在燒杯中加熱溶解，并待溶液達到室溫后，再定量地轉(zhuǎn)入容量瓶內(nèi)，然后稀釋到刻度，并要注意搖勻。當所量取的液體量要求不十分準確時，可使用量筒，因其較使用吸管或量瓶更為簡便，量筒之底座及筒身是焊接一起的，因而不能量取過熱液體，更不能直接加熱，以防炸裂。4滴定管：滴定管是供容量分析滴定之用，有帶玻塞及橡皮管的兩種類型。前者用以量酸，后者用以量堿。滴定管有刻度較精細的微量滴定管，有1.0、2.0、5.0、10毫升等規(guī)格。還有25、50、10

26、0毫升等規(guī)格的常量滴定管。使用滴定管應(yīng)該注意以下事項：檢查是否清潔干燥，是否漏水，玻塞是否滑潤，如有漏水或轉(zhuǎn)動不靈，應(yīng)拆下活塞重新涂抹凡士林。涂抹前要將玻塞擦干，用手指沾少量凡士林在活塞兩頭各擦一薄層，將活塞插入槽內(nèi)，然后向同一方向轉(zhuǎn)動活塞，直到從外面看時，全部透明為止。油涂好后，在活塞的小頭的槽上套一橡皮圈，以防活塞滑脫。使用前必須認出每一格表示多少毫升。先用少量滴定液清洗滴定管23次，然后方可裝液。裝液體后，管內(nèi)如有氣泡必須排出。滴定前先應(yīng)讀取起始點。滴定時，左手控制玻塞，右手持瓶，邊滴邊搖，密切注意被滴定溶液的顏色變化。裝置滴定管時，管身必須與地面垂直。讀數(shù)時眼睛與溶液月形面下緣在同一水

27、平線上，不要仰頭或低頭讀數(shù)。如用酸式滴定管裝堿性溶液，滴定后應(yīng)立即洗凈，以免活塞粘連。二、一般操作技術(shù)1、混勻法：欲使一化學反應(yīng)充分進行，必須使反應(yīng)體系內(nèi)各種物質(zhì)迅速地相互接觸，因此除特別規(guī)定外，一般都需要將反應(yīng)物徹底混勻?；靹蚍绞酱笾掠幸韵聨追N，可隨使用的器皿的液體容量而選用。（1）旋轉(zhuǎn)混勻法：手持容器作離心旋轉(zhuǎn)，適用以未盛滿液體的試管或小口器皿，如三角瓶等。（2）彈指混勻法：左手持試管使之直立，以右手食指輕擊試管之下部，使管內(nèi)溶液作旋轉(zhuǎn)流動。（3）倒轉(zhuǎn)混勻法：適用于有玻璃塞的瓶子，如容量瓶等。（4）彈動混勻法：以右手大拇指、食指、中指握住試管上部，將試管放平，于左手掌中彈動。（5）吸管混勻

28、法：用吸管將溶液反復(fù)吸放數(shù)次，適用于量少而無沉淀的液體。（6）攪拌混勻法：適應(yīng)燒杯等大口容器所盛之溶液的混勻，一般在配制混合試劑時，用玻棒攪拌以助溶，或混勻大量的溶液。2、保溫與加熱：為使某一化學反應(yīng)在一定的溫度下進行，常需要保溫；為促進或停止化學反應(yīng)，有時需要加熱。實驗過程中要隨時監(jiān)測溫度，并及時調(diào)節(jié)。（1）保溫：常用恒溫箱或恒溫水浴進行，后者的溫度較前者穩(wěn)定。（2）加熱：加熱常用兩種方法，一是直接把試管、燒杯等器皿在酒精燈、電爐或煤氣火焰上加熱；二是在水浴中加熱或煮沸，應(yīng)根據(jù)實驗的目的而定。3、過濾：過濾的目的是將沉淀與液體分開，用于收集濾液，收集沉淀或洗滌沉淀。在生化實驗中如用于收集濾液

29、應(yīng)選用干濾紙，不應(yīng)將濾紙先弄濕，濕濾紙將影響濾液的稀釋比例。濾紙過濾一般采用平析法(即對折后，再對折)并且使濾紙上緣與漏斗壁完全吻合，不留縫隙。向漏斗內(nèi)加液時，要用玻棒引導而且不應(yīng)倒入過快，勿使液面超過濾紙上緣。較粗的過濾可用脫脂棉或紗布代替濾紙。有時以離心沉淀法代替過濾法可達到省時、快捷的目的。三、酸度計的使用方法（以雷磁25型酸度計為例）酸度計是測定溶液ph值的重要精密儀器。實驗室常用的是國產(chǎn)雷磁25型酸度計（最小分度0.1ph）和phs-2型酸度計（最小分度0.02ph），可用于ph測定和電動勢測定。1使用方法（1）安裝電極儀器配備221型玻璃電極和222型甘汞電極。把玻璃電極的塑料帽夾

30、在電極夾的夾子上，插頭插在插孔內(nèi)。把某汞電極的金屬帽夾在電極夾的另一夾子上，由于它具有金屬的帽子，可直接與儀器內(nèi)部形成回路。兩個電極的高度，可利用電極夾上的支頭螺絲調(diào)節(jié)。（2）校正 首先，將“ph-mv”開關(guān)撥到“ph”位置。然后，打開電源開關(guān)，指示燈亮后，應(yīng)預(yù)熱5分鐘。最好預(yù)熱時間在半小時以上，以使零點有較好的穩(wěn)定性。 在小燒杯中加入已知ph值的標準緩沖溶液，將電極浸入，應(yīng)使玻璃電極的球狀體和甘汞電極的毛細孔完全浸入溶液。再輕輕搖動燒杯，使電極所接觸的溶液均勻。 調(diào)節(jié)溫度補償器使旋鈕指示的溫度與杯內(nèi)溶液(或室溫)的溫度相同。 根據(jù)標準緩沖液的ph值，將量程選擇開關(guān)撥至0-7或7-14（phs

31、-2型酸度計為分檔開關(guān)）。 旋轉(zhuǎn)零點調(diào)節(jié)器，使指針指在ph7處。 按下讀數(shù)開關(guān)，轉(zhuǎn)動定位調(diào)節(jié)器，使指針恰好指在標準緩沖液的ph處。 放開讀數(shù)開關(guān)，指針應(yīng)指在ph7處，如有變動，則重復(fù)、操作至數(shù)值穩(wěn)定為止。 為了更好的校準，可分別采用兩種ph范圍（0-7或7-14）的已知ph的緩沖液進行校正。 校正完畢，用蒸餾水沖洗電極與燒杯。校正后，切勿再旋轉(zhuǎn)定位調(diào)節(jié)器，否則必須重新校正。（3）測量 用濾紙輕輕觸及兩個電極以吸干剩余的溶液，或用待測液洗電極。然后，將電極浸入盛有待測液的燒杯中，輕輕搖動燒杯使溶液均勻。 被測溶液的溫度應(yīng)與標準緩沖液的溫度相同。 按下讀數(shù)開關(guān)，指針所指的ph值即為待測液的值（ph

32、s-2型酸度計所測讀數(shù)應(yīng)為分擋開關(guān)上的指示數(shù)加表頭上指示值）。重復(fù)幾次，直至數(shù)值不變?yōu)闇省?在放開讀數(shù)開關(guān)后，指針必須指在ph7處，否則，應(yīng)旋轉(zhuǎn)零位調(diào)節(jié)器至ph7處以后，重測待測液的ph值。 若在量程07范圍測量時，指針讀數(shù)超出刻度范圍，應(yīng)將量程開關(guān)撥至到714的位置，再重復(fù)、的操作。 測量完放開讀數(shù)開關(guān)，關(guān)閉電源開關(guān)。然后沖洗干凈，玻璃電極可浸泡再蒸餾水中，而將甘汞電極離開蒸餾水并戴上橡皮帽。2注意事項 玻璃電極在初次使用前，必須在蒸餾水中浸泡數(shù)日至一星期，至少泡一晝夜。平時，應(yīng)經(jīng)常浸泡在蒸餾水中，以備隨時可用。 玻璃電極不要與強烈吸水的溶劑接觸太久。在強堿溶液中使用應(yīng)盡快操作，用畢立即用水

33、洗凈。 玻璃電極球泡的玻璃膜很薄，因此勿與玻璃杯與硬物相碰，防止球泡破碎。一般安裝時甘汞電極頭應(yīng)長出球泡頭部，使在搖動時不會碰到杯底。 玻璃電極的玻璃膜不要沾上油污。 若不慎沾上油污應(yīng)先用酒精再用四氯化碳或乙醚，最后用酒精浸洗，再用水洗凈。洗凈后只能用濾紙輕輕吸干，千萬不要揩擦， 以免破碎玻璃膜。 甘汞電極在使用時，要注意電極內(nèi)充滿氯化加鉀溶液，里面應(yīng)無氣泡， 防止斷路。并且要用少許氯化鉀結(jié)晶存在，以使溶液保持飽和狀態(tài)。 在使用時應(yīng)將該電極上部的小橡皮塞拔去，讓極少量的氯化鉀溶液從毛細管中流出，使測定結(jié)果可靠。 首次使用時，應(yīng)檢查電源是否與儀器要求相符。儀器的電源必須要有地 線，以使指針穩(wěn)定。

34、 3標準緩沖液的配制酸度計用的標準緩沖液要求：有較大的穩(wěn)定，較小的溫度依賴性其試劑易于提純。常用標準緩沖液的配制方法如下：附表 不同溫度時標準緩沖液的ph值 溫度酸性酒石酸鉀(25時飽和)0.05m鄰苯二甲酸氫鉀0.025m kh2po40.025mna2hpo40.0087mkh2po40.0302m na2hpo40.01m na2b4o704.016.987.539.46104.006.927.479.33154.006.907.459.27204.006.887.439.23253.564.016.807.419.18303.554.026.857.409.14383.554.036.

35、847.389.08403.554.016.847.389.07503.554.066.837.379.01將標準緩沖液儲于硬質(zhì)玻璃瓶或塑料瓶中，能穩(wěn)定12月，它們的ph值隨溫度不同稍有差異，見附表。（1）ph4.00(1020)將鄰苯二甲酸氫鉀在105干燥1小時后，稱取5.07克加重蒸餾水溶解至500毫升。（2）ph6.88（20）稱取在130干燥2小時的3.401克磷酸二氫鉀（kh2po4），8.95克磷酸氫二鈉（na2hpo412h2o）或3.549克無水磷酸氫二鈉（na2hpo4），加重蒸餾水溶解至500毫升。（3）ph9.18（25）稱取3.8144克四硼酸鈉（na2b4o710h2

36、o）或2.20克無水四硼酸鈉（na2b4o7），加重蒸餾水溶解至100毫升。四、生化實驗室的基本設(shè)施與裝備1. 溫度與環(huán)境設(shè)施許多生化實驗都要求在一定的溫度和濕度下進行操作，因此，一個正規(guī)的生化實驗室必須能夠保持恒溫、恒濕的環(huán)境。為了保持這些條件，實驗室都應(yīng)裝備空調(diào)和加濕器等，而儀器分析室則要求保持干燥，一些怕潮濕和易水解的試劑應(yīng)保存在干燥箱中。由于各種生物材料、制劑和各種生化試劑要求在不同的溫度下保存，實驗室必須備有4、-20、-80的冰箱，需要在更低溫度下保存的樣品，則須使用液氮罐。對于需在較高溫度下進行的操作，則可使用烘箱和高溫電爐等。實驗室還應(yīng)備有干冰，以便使用乙醇干冰浴進行樣品的快速

37、冷凍分裝。2. 實驗室用純水生化實驗室使用最多的溶劑是“水”，配制生化實驗用試劑不能用自來水，只能使用經(jīng)過純化的水。生化實驗對所用水的純度是要求比較高的，通?？梢哉J為，水的質(zhì)量越高，實驗的結(jié)果就越真實可靠和準確，為此必須保證實驗用水的質(zhì)量。常用的兩種純水是二次蒸餾水和無離子水。在超純分析和特殊的生化實驗中要求更高的水質(zhì)，如1518 m-cm高純無離子水、無熱源高純水、無菌水、亞沸蒸餾水、無二氧化碳蒸餾水等。實驗室制備無離子水，通常使用聚苯乙烯磺酸型強酸性陽離子交換樹脂和聚苯乙烯季胺型強堿性陰離子交換樹脂填充的陽離子和陰離子交換柱，或是陰、陽離子交換樹脂的比例為21的混合柱。無離子水的水質(zhì)用電阻

38、率表示，最高純度是18 m-cm（25）。雖然無離子水中陰、陽離子的含量可以很低，但用離子交換法卻不能去除水中的有機物雜質(zhì)，離子交換樹脂中的低分子有機化合物亦可能溶于水，因此由無離子水的電阻率不能看出水中有機物的污染程度，有機物的污染有可能干擾生化實驗中的某些反應(yīng)，也會使水的紫外吸收增加，對于那些對紫外吸收要求十分嚴格的實驗，應(yīng)選用蒸餾水而不用無離子水。實驗室中制備蒸餾水，多采用石英管加熱的硬質(zhì)玻璃蒸餾水器，蒸餾時不能用自來水，因為會產(chǎn)生水垢，最好用無離子水作為水源。如欲除去有機物，可在蒸餾水器中每升水加1g高錳酸鉀和1ml 85的磷酸，以便通過氧化除去有機物。不含金屬離子的水，需用亞沸蒸餾水

39、，即用石英亞沸蒸餾器進行蒸餾，其特點是在液面上方加熱，但水并不沸騰，只是液面處于亞沸狀態(tài)，可將水蒸氣帶出的雜質(zhì)減至最低，但制水量較小，每小時約14升。實驗工作中不應(yīng)盲目追求水的純度，水的價格隨水質(zhì)的提高而成倍地增長，因此要根據(jù)實際工作的需要，即所用水中應(yīng)排除的干擾物質(zhì)的類型，來選用水的種類，如：無離子水、普通蒸餾水、二次蒸餾水、亞沸蒸餾水及按特殊要求制備的高純水等。所有的各種純水，在貯存中都會被污染：塑料容器會產(chǎn)生有紫外吸收的有機物；玻璃和金屬容器會產(chǎn)生金屬離子的污染；長時間放置更會使水長菌，空氣中的二氧化碳會溶入水中，所以貯存高純水一定要隔絕空氣，密封蓋嚴，必要時貯存在冰箱的冷藏室中。3.

40、消毒系統(tǒng)生化實驗要進行生物培養(yǎng)和生物反應(yīng)的操作，這些操作都必須排除其他生物因素的干擾，因此在做這些實驗之前，都必須對實驗中用到的、可能造成污染的材料、器械等進行消毒滅菌處理。常用的滅菌方法有：高溫、高壓滅菌、紫外線照射、火焰焚燒、過濾除菌、酒精等試劑浸泡消毒等，因此實驗室必須配備各種無菌處理設(shè)備。4. 計量系統(tǒng)生化實驗都要求在各種標準的定量條件下進行，因此實驗室必須配備各種標準的定量系統(tǒng)。常用的定量系統(tǒng)有：稱量系統(tǒng)、液體體積度量系統(tǒng)、ph測定系統(tǒng)、液體溶質(zhì)定量系統(tǒng)等。 稱量系統(tǒng)：最常用的設(shè)備是各種千分之一的扭力天平、電子天平和各種萬分之一的單、雙盤天平和電子天平等，它們分別用于各種緩沖液的配制

41、和標準物質(zhì)的稱量等。 液體體積度量系統(tǒng)：常用的有各種量筒、移液管、容量并、微量進樣器和各種自動取液器等。 酸堿度ph測量系統(tǒng)：最常用的是ph試紙和ph計。 液體溶質(zhì)定量系統(tǒng)：此系統(tǒng)主要是根據(jù)液體溶質(zhì)的某些理化特性而設(shè)計的，不同的物質(zhì)在一定的條件下有特定的吸收光譜，其吸收值的大小與其在溶液中的濃度有一定的關(guān)系，可以通過測定某物質(zhì)在溶液中的吸收光譜來計算出該物質(zhì)的濃度，因而分光光度計就是生化實驗室必備的儀器分析手段。主要有可見分光光度計、紫外可見分光光度計和高檔的快速掃描紫外可見分光光度計等。5. 離心設(shè)備離心方法是分離和制備生物大分子最常用的手段，因而生化實驗室必須備有各種形式的離心機。常用的有

42、普通臺式離心機、高速冷凍離心機和超速離心機等。6. 電泳裝置電泳是生化實驗中最常用最重要的實驗技術(shù)之一，主要用于分析、鑒定，也可用于制備。電泳裝置由電源和電泳槽兩部分組成，詳見第四章。7. 層析裝置層析又稱為色譜，是分離各種生物大分子的主要手段之一，因而各種層析系統(tǒng)和核酸蛋白檢測器就是生化實驗室最常用的儀器設(shè)備。主要的層析技術(shù)有：吸附層析、凝膠排阻層析、離子交換層析和親和層析等，詳見第五章。8. 光密度儀 激光光密度儀是適用于多種電泳結(jié)果分析的儀器。它采用激光為光源，色散性強，線性范圍廣，分辨率高，所得結(jié)果可以在電腦中進行多維的圖象處理，并打印出結(jié)果，在生化實驗室中正得到越來越廣泛的使用。9.

43、 真空印跡系統(tǒng)該設(shè)備是一種利用真空原理將已經(jīng)分離的生物大分子(蛋白質(zhì)、核酸)從電泳后的凝膠中轉(zhuǎn)移到膜上的儀器，主要由印跡儀和真空印跡泵組成，印跡效率接近100，重復(fù)性好，方法簡易、快速，將轉(zhuǎn)移分子的變性、中和、印跡等所有步驟均在印跡儀中完成，從而避免了凝膠受損。10. 核酸自動合成儀與測序儀用于dna、rna的自動合成及序列測定。11. 蛋白質(zhì)的自動合成與測序儀用于蛋白質(zhì)分子的體外合成與序列測定。12. pcr儀pcr(polymerase chain reaction)是指聚合酶鏈式反應(yīng)。該反應(yīng)是用dna聚合酶在體外大量擴增dna片段的一種方法。pcr儀就是將此方法實現(xiàn)了自動化操作的一種儀器

44、，是生化與分子生物學實驗常用和必備的設(shè)備。13. 同位素實驗設(shè)施生物化學許多實驗都要用到放射性同位素，如：生物體分子示蹤、分子雜交、放射性檢測等，因此實驗室必須有安全的同位素實驗設(shè)施。放射源材料存放室：用于放射源材料的存放、保管等，應(yīng)較僻靜。操作時的防護設(shè)施： 常用的器具有：有機防護并、特制防護衣、防護罩等接觸同位素樣品時必須戴防護手套。放射性檢測、監(jiān)測器：在操作同位素的地方，應(yīng)配備檢測、監(jiān)測器，能自動安全報警，隨時報告并指示放射源情況。放射性核素分析測定儀：用來檢測分析實驗結(jié)果。常用的有液體閃爍計數(shù)器，數(shù)字式放射自顯影分析儀，蓋革計數(shù)器和射線放射顯影盒等。廢物處理器：使用同位素應(yīng)有能夠安全地

45、存放和處理同位素廢物的場所，否則嚴禁使用同位素。14. 生物培養(yǎng)設(shè)施生物培養(yǎng)是生化實驗必不可少的設(shè)備。生物材料的培養(yǎng)有微生物培養(yǎng)、植物細胞及組織培養(yǎng)、動物細胞及動物培養(yǎng)等。不同的培養(yǎng)，其對設(shè)施的要求也有所不同。微生物培養(yǎng)：需要恒溫恒濕培養(yǎng)箱、振蕩培養(yǎng)器即搖床（有空氣和水浴式以及全溫式搖床）、發(fā)酵罐、大型生物反應(yīng)器等。植物細胞及組織培養(yǎng)： 需要恒溫恒濕光照培養(yǎng)箱、振蕩培養(yǎng)器、生物反應(yīng)器和植物房等。動物細胞及動物培養(yǎng)：需要二氧化碳培養(yǎng)箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱和動物房等。 為了對所培養(yǎng)的微生物和動植物細胞進行破碎，提取所需的生物大分子，還必需有各種高效率的細胞破碎裝置。15. 基因?qū)雰x用于向受體生物細胞

46、中導入基因。常用的導入儀有：電導入儀、基因槍、激光和超聲導入儀、原生質(zhì)體融合儀等。16. 高效液相色譜儀和毛細管電泳儀用于各種生物大分子的分析與鑒定。17. 暗室在生化實驗研究中，必須有一間裝備完整的暗室，能對各種照相乳膠和感光材料進行處理，如各種電泳凝膠的照相沖洗和放大，放射性自顯影的x射線片及其他感光底片的處理，以及進行核酸與熒光物質(zhì)（溴化乙錠）結(jié)合后在紫外線照射下對電泳結(jié)果的觀察操作等。暗室中應(yīng)裝備有：照相裝置、放大機、曝光箱、翻拍儀、自動沖片機和紫外透射儀等。18. 冷室生化實驗一般都要求在低溫下進行，由于冰浴太小，冷柜也不能進人操作，因此就需要有一間410的冷室，工作人員可以在其中進

47、行各種柱層析、各種電泳、生物大分子的提取和分離、硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)以及各種物質(zhì)的透析等操作，并可以貯存各種生物制品和生化試劑。19. 其他設(shè)備實驗室除以上常規(guī)設(shè)備和設(shè)施外，還必須裝備下列一些常用設(shè)備通風柜：用于有害和有毒氣體的操作。微波爐：用于化凍、滅菌及其他一些需要快速加熱的操作。組織打碎機和勻漿器：用于各種生物材料、動植物組織和細胞的破碎。超聲清洗機：用于各種器皿、移液管和自動取液器吸頭的清洗和高效液相色譜儀所用流動相的脫氣等。制冰機：為實驗室提供足夠的碎冰塊。冰凍干燥機：用于生物大分子水溶液的冰凍干燥，可由其水溶液直接制得固體干粉。機械和水環(huán)式真空泵：用于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器和各種真空抽氣操作。旋轉(zhuǎn)

48、蒸發(fā)器：用于各種水溶液和有機溶液的旋轉(zhuǎn)減壓蒸餾操作。普通顯微鏡和倒置顯微鏡：用于對各種細胞和生物材料的觀察。酶標儀：用于免疫化學實驗的酶聯(lián)免疫吸附測定。由上述內(nèi)容可見，生化實驗室所需裝備的各種儀器設(shè)備和設(shè)施是多種多樣的，因而要求每一位生物化學工作者和學生都必須非常重視這些儀器設(shè)備和設(shè)施的使用和維護，必須具有較強的實驗動手能力。能否正確熟練地使用上述這些儀器設(shè)備，在很大程度上將決定他們實驗的成敗。 （張媛英，王澤平，方茜）第二章 分光光度技術(shù)分光光度法是利用物質(zhì)特有的吸收光譜來鑒別物質(zhì)或測定其含量的一項技術(shù)，該技術(shù)靈敏度強，精確度高，操作簡便，快速；對于復(fù)雜的組分系統(tǒng)，勿需分離即可檢測出其中的微

49、量組分，因此分光光度法已成為生物化學研究中廣泛使用的方法。人肉眼可見的光線稱可見光，波長范圍在400760nm，波長范圍在200400nm為紫外光區(qū)(波長760nm)?？梢姽鈪^(qū)的電磁波，因波長不同而呈現(xiàn)不同的顏色，這些不同顏色的電磁波稱單色光，單色光并非單一波長的光，而是一定波長范圍內(nèi)的光，太陽及鎢絲燈發(fā)出的白光，是各種單色光的混合光(復(fù)合光)，利用棱鏡可將白光分成按波長順序排列的各種單色光，即紅、橙、黃、綠、青、藍、紫等，這就是光譜。一、基本原理有色物質(zhì)的顯色，是由于它對光線的吸收具有選擇性。白光是波長在400-750nm的電磁波，它是由各種波長不同，顏色不同；如果溶液對某些波長的光吸收較少

50、而對其它波長的光吸收較多，則溶液呈現(xiàn)這種吸收較少而透過較多的光的顏色，例如溶液吸收了紅光，透過藍綠色光較多，則溶液呈現(xiàn)綠色。當然一些物質(zhì)的最大吸收波長在可見光波長以外，如蛋白質(zhì)的吸收波長為280nm，核酸的最大吸收波長為260nm。當光線通過透明介質(zhì)時,某波長的光有一部分被吸收,一部分透過,因此當光透射出溶液之后,光強度減少。lambert-beer定律是利用分光光度計進行比色分析的基本原理，這個定律是討論有色溶液對單色光的吸收程度與溶液的濃度及液層厚度間的定量關(guān)系。1朗伯（lambert）定律：當單色光通過一吸收光的介質(zhì)時，其光強度隨吸收光介質(zhì)的厚度增長而呈指數(shù)減少，即 i/i0 = e-k

51、1l （k1為吸光系數(shù)(absorption coefficient)(gcm-1)）（ i0：入射光強度；：透射光強度；l：介質(zhì)的厚度）2比爾（beer）定律：單色光通過一光吸收介質(zhì)時，光強度隨介質(zhì)濃度增長而呈指數(shù)減少。即 i/i0 = e-k2c （c為溶液濃度(concentration) (gl-1)）兩者結(jié)合在一起為朗伯-比爾（lambert-beer）定律。即 i/i0 = e-cl 式中(epsilon)稱之摩爾吸光率(molar absorptivity)(lmol-1cm-1)系一常數(shù),也叫消光系數(shù)；透光度t(transmittance)為i/i0，通常以百分率表示。取對數(shù)：

52、-lnt= -lni/i0=-lne-cl 令a=-lnt 得：a=cl式為lambert-beer定律的物理表示式，其含義為一束單色光通過溶液介質(zhì)后，光能被吸收一部分，吸收多少與溶液的濃度和厚度成正比。此式為分光分析法的基本計算式。式中a（absorbance）為吸光度，c(concentration)濃度(moll)，l為溶液樣品的長度cm(或比色皿內(nèi)徑長cm)。采用適當?shù)墓庠?、棱鏡和適當?shù)墓庠唇邮掌?，讓某一波長的光透過某一溶液，通過儀器的測定，定性鑒別物質(zhì)或定量測定某一組分含量的方法即為分光光度法。通過光波長的調(diào)整，可使溶質(zhì)濃度的測定范圍不僅僅局限于可見光，尚可擴大到紫外光區(qū)和紅外光區(qū)。經(jīng)單色器（棱鏡）得到的光源雖然不是純的單色光，但波長范圍更狹窄，更符合lambert