胰蛋白酶或抑制劑分離純化綜合

1、實驗 胰蛋白酶或抑制劑分離、純化 在動物胰臟中， 胰蛋白酶是以無活性的酶原狀態(tài)存在的。 在生理條件下， 胰蛋白酶原隨 胰液分泌至十二指腸后，在小腸上腔有 Ca2+的環(huán)境中，為腸激酶或胰蛋白酶所激活，其肽 鏈 N - 端的賴氨酸與異亮氨酸之間的一個肽鍵被水解，失去一個酸性 6 肽， 其分子構(gòu)象發(fā)生 一定的改變后轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂写呋鞍踪|(zhì)水解活性的胰蛋白酶。 胰蛋白酶原分子量約為 24 000，其等電點為 pH8.9；胰蛋白酶的分子量約為 23 400，其 等電點為 pH 10.8。 胰蛋白酶在 pH3.0 時最穩(wěn)定，其濃溶液可貯存于冰箱（ 0 以下）數(shù)周而活性無顯著喪 失。pH3 時，胰蛋白酶易變性。

2、 PH時，胰蛋白酶易自溶。胰蛋白酶催化活性的最適 pH 為 7.6 7.8。 重金屬離子、 有機磷化合物和反應(yīng)產(chǎn)物都能抑制胰蛋白酶的活性。胰臟、 卵清和大豆中 也含有一些蛋白質(zhì)對胰蛋白酶活性具有抑制作用。 實驗（一）胰蛋白酶活性測定 原理 胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解， 對于由堿性氨基酸 （如精氨酸、賴氨酸） 的羧基與其他 氨基酸的氨基所形成的肽鍵具有高度的專一性。 此外， 胰蛋白酶也能催化由堿性氨基酸的羧 基所形成的酰胺鍵和酯鍵， 有高度的專一性仍表現(xiàn)為對堿性氨基酸羧基一側(cè)的選擇對此等化 學(xué)鍵的催化水解活性的敏感度為： 酯鍵酰胺鍵肽鍵。 因此， 可以利用含有這些化學(xué)鍵中 任一種鍵型的底物來研究

3、胰蛋白酶的專一催化活性。 本實驗方法一采用 N-苯甲酰 -L-精氨酸乙酯 （ BAEE ），N-benzoyl-L-arginine ethyl ester 作為底物，水解反應(yīng)如下： N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯 （BAEE ）在波長 253nm下的紫外光吸收遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于 N-苯甲酰 -L- 精氨酸 （BA ）， benzoyl-L-arginine 的紫外光吸收。在胰蛋白酶的催化下， BAEE 隨著酯鍵 的水解，水解產(chǎn)物 BA 逐漸增多，反應(yīng)體系的紫外光吸收亦隨之相應(yīng)增加，以 A 253nm計算 胰蛋白酶的活性。 胰蛋白酶的 BAEE單位定義為：以BAEE為底物，在一定反應(yīng)條件下， 每分鐘使 A2

4、53nm 增加 0.001 的酶量為一個 BAEE 單位。 本實驗方法二采用以酪蛋白為底物的方法來測定胰蛋白酶活性。以酪蛋白為底物，主 要用于測定胰蛋白酶粗制品的活力。 胰蛋白酶催化水解底物酪蛋白生成不被三氯醋酸沉淀的 小分子肽以及氨基酸。在一定濃度范圍內(nèi)，酶的水解濾液在波長 275nm 處光吸收的增值與 胰蛋白酶的活力單位成正比。 測定中以標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液的光吸收作對照， 根據(jù)活力單位的定 義，確定樣品中胰蛋白酶的活性?；盍挝坏亩x：在一定條件下，每分鐘酶水解濾液光吸 U）。 收的增值與 1 mol 酪氨酸在 275nm 處光吸收值相同時的酶量為一個蛋白酶活力單位 試劑和器材 1、試劑 （

5、1） 1.0mmol/L BAEE 底物溶液 （ 2） 10mmol/L HCl （ 3） 0.1mol/L 、pH8.0 硼酸鹽緩沖液 （ 4） 10mg/m 酪蛋白溶液 取酪蛋白 1g，加 13mL 0.1mol/L NaOH 、蒸餾水 40mL ，置 60水浴加熱至溶解， 放至 室溫后，加水稀釋調(diào) pH 至 8.0 并定容至 100mL 。 （5）5% 三氯乙酸溶液 （ 6） 0.2mol/L 鹽酸溶液 （ 7） 50 g/mL 酪蛋白對照溶液 精確稱取經(jīng) 105 干燥至恒重的酪氨酸5mg ，用 0.2mol/L 鹽酸定容至 100mL 。 （ 8）胰蛋白酶樣液 2、器材 （1）恒溫水浴

6、 （2）紫外分光光度計 （3）離心機 （4）試管 方法和步驟 1、N-苯甲酰 -L-精氨酸乙酯（ BAEE ）測定法： 取 2 個光程為 1cm 的帶蓋石英比色杯， 分別加入 25 預(yù)熱過的 2.8mL 1.0mmol/L BAEE 底物溶液。向一個比色杯內(nèi)加入 0.2mL10mmol/L HCl ，作為空白，在波長 253nm 下調(diào)節(jié)儀 器零點；向另一個比色杯中加入 0.2mL 待測酶液，立即蓋上蓋迅速混勻計時，每半分鐘讀 數(shù)一次， 共讀 3 4min 。測得的結(jié)果要使 A253nm/min 控制在 0.050.100之間為宜。 若偏離 此范圍則要適當(dāng)增減酶量。 以時間（ t）為橫坐標(biāo)，光吸

7、收值（ A 253nm）為縱坐標(biāo)作圖，在直線部分任選一個時間 間隔與相應(yīng)的光吸收值變化（ A 253nm），按以下公式計算胰蛋白酶的活力單位。 胰蛋白酶活力單位（ BAEE單位 /mL) A253nm /min 0.001 酶液加入體積 稀釋倍數(shù) 胰蛋白酶比活力（ BAEE單位 /mg）酶液活力（ BAEE單位 /mL）稀釋倍數(shù) 酶液蛋白含量（ mg/mL） 酶液加入體積（ mL） 2、酪蛋白為底物測定法 （1）取 3支試管， 13編號。 取試管 1，加入 1.0mL 酶液，加用 0.1mol/L 、 pH8.0 硼酸鹽緩沖液 2.0mL ，在水浴保溫 10min ，精確加入 40預(yù)熱的 10

8、mg/mL 酪蛋白溶液 5.0mL ，混勻，立即置于 40水浴中， 準(zhǔn)確反應(yīng) 30min 后，加入 5.0mL 的 5%三氯乙酸，迅速搖勻。 取試管 2，加入 1.0mL 酶液，加用 0.1mol/L ，pH8.0 硼酸鹽緩沖液 2.0mL ，在 40水浴保溫 10min ，精確加入 5.0mL 5%三氯乙酸， 搖勻，在 40水浴保溫 30min 后，再加 10mg/mL 酪蛋白溶液 5.0mL ，混勻。 取試管 3，分別加入 5.0mL 5%三氯乙酸和 8.0mL 0.1mol/L （pH8.0）硼酸緩沖液，混合。 將上述三試管溶液于 3 500r/min 離心 10min ，分別取上清液。

9、 以試管 3 離心上清液作參比，在紫外分光光度計中波長 275nm 處測定試管 1 和試管 2 離心上清液的光吸收值（ A275）。 （ 1）酪氨酸對照液的測定 以 0.2mol/L 鹽酸溶液作參比，在波長 275nm 處測定酪氨酸對照溶液的光吸收值（ AS）。 結(jié)果計算 胰蛋白酶活力單位（ U /mL） A A0 C 對照 V總 n AS M 對照 t V樣品 式中 A 試管 1 測得的光吸收值； A0 試管 2 測得的光吸收值； AS 酪氨酸對照溶液的光吸收值； C 對照 酪氨酸的濃度（ g/ mL ）； M 對照 酪氨酸的分子量（ 181.19 ）； V總 反應(yīng)總體積（ mL）； V 樣

10、品 加入的樣液體積（ mL ）； t 反應(yīng)時間（ min ）； n樣品的稀釋倍數(shù)。 實驗（二）胰蛋白酶的提取 原理 在動物胰臟中除了存在胰蛋白酶外，還有另外兩種與胰蛋白酶性質(zhì)相似的蛋白水解酶： 胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶。 在胰蛋白酶提取過程中， 三者彼此很難分開。 需采用合適的方 法進(jìn)一步分離純化。 從動物胰臟中提取胰蛋白酶，一般是用稀酸將胰腺細(xì)胞中含有的胰蛋白酶原提取出來， 然后根據(jù)等電點沉淀的原理將提取液的pH 值調(diào)至酸性 （ pH3.0 左右），使大量的酸性蛋白沉 淀出來。 經(jīng)硫酸銨分級鹽析將胰蛋白酶原、 胰凝乳蛋白酶原和彈性蛋白酶原沉淀。 沉淀物經(jīng) 水溶解并調(diào)至 pH8.0 ，用極少量

11、的胰蛋白酶將胰蛋白酶原激活，同時溶液中的胰凝乳蛋白酶 原和彈性蛋白酶原也被激活，三種酶原相互作用過程如下： 也可采用從胰臟中提取出胰蛋白酶原， 利用合適的提取溶液的 pH 值促使胰蛋白酶原部 分自溶，并通過溶液中 Ca2+的環(huán)境，使胰蛋白酶原被開始自溶的少量具有活性的胰蛋白酶 所激活， 轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘囊鹊鞍酌?（胰凝乳蛋白酶原及彈性蛋白酶原亦同時被胰蛋白酶激 活成有活性的酶） 。 激活后的酶溶液再進(jìn)一步分離純化。 試劑和器材 1、試劑 （ 1） pH2.5 3.0 乙酸化的水溶液 （2）10%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸 （ 3） 2mol/L 硫酸 （ 4）固體硫酸銨 （ 5）無水 CaCl2 （ 6

12、）結(jié)晶胰蛋白酶 （ 7） 25%乙醇溶液 （含 0.015mol/ HCl 、 0.05mol/ CaCl 2） （8） 95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇 （ 9） 5mol/ NaOH （ 10）丙酮 2、器材 （1）胰臟 （2）組織搗碎機 （3）離心機 （4）磁力攪拌器 （5）透析袋、 20 目篩網(wǎng)、紗布、水浴鍋 （6）燒杯、量筒、刻度吸管、試管、玻璃漏斗 （ 7）布氏漏斗、抽濾瓶、溫度計、滴管、玻璃攪棒、紗布、pH 試紙等 方法和步驟 方法一 1、 胰蛋白酶原的提取 取新鮮胰臟約 150g，剝?nèi)ソY(jié)締組織和脂肪，取凈重100g ，切成碎塊，在組織搗碎機中 搗碎，并加入 2倍體積預(yù)冷的 pH2.53.

13、0乙酸化水溶液，制成勻漿。漿液倒入500mL 燒杯 中，用 10%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸調(diào)節(jié) pH 在 2.53.0 之間，在 5 10下提取 6h 以上，并間 隙輕輕攪拌。用 4層紗布過濾，盡量擠出濾液。組織殘渣中再加入 0.5倍體積（約 50mL 左 右）預(yù)冷的 pH2.5 3.0 乙酸化水溶液再提取一次（放置1 2h），再用 4 層紗布過濾。合并 兩次濾液，用2.5mol/L 硫酸調(diào)節(jié)濾液 pH在 2.53.0之間，4放置 4h（pH始終保持在 2.5 3.0），使提取液中酸性蛋白沉淀析出。 提取液用折疊濾紙于玻璃漏斗中自然過濾， 收集濾液， 量取體積（約 200mL 左右）。 濾液中加入粉末

14、狀固體硫酸銨，使溶液達(dá) 0.75 飽和度（每升濾液加 492g， 5）。放置 過夜，使胰蛋白酶原完全析出。次日抽濾，棄濾液，壓緊并收集濾餅，即胰蛋白酶原粗品。 2、 胰蛋白酶原的激活 將胰蛋白酶原粗品稱重 （濕重），分次加入 10 倍體積預(yù)冷的蒸餾水 （按濾餅重量計算） ， 使濾餅完全溶解（一般情況濾餅中硫酸銨含量約占餅重1/4）。用 5mol/L NaOH 將溶液調(diào)至 pH8.0，慢慢地攪拌下加入固體無水 CaCl 2使溶液的 Ca2+終濃度達(dá)到 0.1mol/L （要減去一部 分氯化鈣與硫酸銨結(jié)合生成硫酸鈣的鈣離子） 。取出 2mL 溶液用于測定激活前的蛋白含量及 酶活性。原溶液中加入 5

15、mg 結(jié)晶胰蛋白酶， 輕輕攪拌均勻， 25放置 2 4h，或 4放置 12 16h，使胰蛋白酶原活化。 每隔 1h 取樣測定胰蛋白酶活性增長情況， 直至酶激活速度變慢或 停止增長。 一般比活可達(dá)到 3 5004 000 BAEE 單位/mg。留取 2mL 溶液用于測定激活后的 蛋白質(zhì)含量和酶活性。 激活酶溶液用 2mol/L 硫酸調(diào) pH 至 2.5 3.0，濾紙過濾， 濾去硫酸鈣 沉淀，收集濾液， 4保存?zhèn)溆谩?方法二 稱取冷凍豬胰臟 100g，在 2 5下解凍，切成小塊，用 組織搗碎機中絞碎成胰漿，在 510存放 24h 以上，使胰酶自身活化 。胰漿中 加入 25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)） 乙醇溶液

16、250mL（ 25% 乙醇溶液中加 0.015mol/L HCl 、 0.05mol/L CaCl 2），搗碎機中搗碎 1min。胰漿倒入 500mL 燒杯中，間隙攪拌，溫度 20左右，活化 5 6h。每隔 1.5h，吸取 2mL 活化液 用于測定激 活后的蛋白質(zhì)含量和酶活性。 活化反應(yīng)結(jié)束后， 胰漿 3 500 r/min 離心 20min ，將離心后上清液用二層紗布過濾。 濾液 置 250mL 燒杯中，以過濾清液的體積為準(zhǔn)，加入粉末狀硫酸銨，攪拌溶解，使溶液硫酸銨 飽和度為 20%。放置 6h 后， 3 500 r/min 離心 20min ，保存上清液待用，取沉淀。沉淀分別 用適量 95

17、%乙醇洗滌過濾，再用丙酮洗滌，過濾。最后將沉淀置于表面皿上自然干燥，即 得胰蛋白酶粗品。 在上述離心上清液中，加入粉末狀硫酸銨，攪拌溶解，使上清液溶液達(dá)到 55%硫酸銨 飽和度，放置 6h 后，3 500 r/min 離心 30min，取離心沉淀，分別用適量 95%乙醇、丙酮洗 滌，過濾后將沉淀置于表面皿上自然干燥，即得胰蛋白酶粗品。 實驗（三）胰蛋白酶的純化 原理 胰蛋白酶與另外兩種蛋白水解酶： 糜蛋白酶 （胰凝乳蛋白酶） 和彈性蛋白酶同時存在于 胰臟中。 由于胰蛋白酶、 糜蛋白酶和彈性蛋白酶的酶蛋白分子在結(jié)構(gòu)上及其它很多性質(zhì)上的 相似之處， 往往在一般的制備過程中很難將它們彼此徹底分開，

18、傳統(tǒng)的分離、 純化技術(shù)難以 達(dá)到十分滿意的結(jié)果，但采用親和層析技術(shù)，大大提高了分離純化的效果。 雞卵類粘蛋白是一種專一性很強的胰蛋白酶的抑制劑， 對豬和牛的胰蛋白酶有很強的抑 制作用（而對胰凝乳蛋白酶無抑制作用） 。在 pH7.68.0 的范圍內(nèi)，豬或牛胰蛋白酶能牢固 地吸附在雞卵類粘蛋白上，在pH2.5 3.0 的范圍內(nèi)，能從雞卵類粘蛋白上被洗脫下來。因 此，采用雞卵類粘蛋白作為配基制成親和吸附劑， 可以從胰蛋白酶粗品直接獲得高純度的胰 蛋白酶。反應(yīng)的基本原理如下： 圖 胰蛋白酶親和層析流程示意圖 親和層析需要選擇耐用的， 非特異性吸附少的， 水不溶性的載體， 此載體并可在溫和條 件下與配基

19、能共價偶聯(lián)， 而又不影響配基原有的生物學(xué)特性。 瓊脂糖凝膠顆粒， 具有機械強 度高、通透性好、非特異性吸附少等優(yōu)點，目前作為親和層析載體使用最廣泛。 瓊脂糖作為親和層析基質(zhì)使用最廣泛。 為了增加瓊脂糖的穩(wěn)定性和提高機械強度， 在堿 性條件下加入環(huán)氧氯丙烷進(jìn)行交聯(lián)， 并適當(dāng)加入一些硼氫化鈉， 以還原除去瓊脂糖中某些不 利于層析的離子基團(tuán)（如硫酸基） 。珠狀交聯(lián)瓊脂糖，在接上配基之前，需要活化?；罨?法很多，溴化氰活化最常用，但該化合物極毒。 本實驗方法一使用染料“對 -硫酸酯乙砜基苯胺（ SESA ）”與瓊脂糖反應(yīng)生成 ABSE- 瓊脂糖， 經(jīng)重氮化反應(yīng)后與卵粘蛋白配基偶聯(lián)， 制得胰蛋白酶的親

20、和吸附劑。 親和吸附劑制 備過程主要反應(yīng)如下： 實驗中方法二采用用環(huán)氧氯丙烷活化， 再與卵粘蛋白配基偶聯(lián)的方式。 最后制備親和層 析柱純化胰蛋白酶。 本實驗采用自制珠狀交聯(lián)瓊脂糖經(jīng)活化、偶聯(lián)制備親和吸附劑。 試劑和器材 、試劑 （1）瓊脂糖 （2）卵粘蛋白 （ 3）環(huán)氧氯丙烷 （ 4）碳酸鈉 （ 5）對 - 硫酸酯乙砜基苯胺 （6）0.1mol/pH 9.5 碳酸鈉 -碳酸氫鈉緩沖液 （7）0.1mol/pH7.5 Tris-HCl 緩沖液 （8）0.2mol/ pH2.5 甘氨酸緩沖液 （ 9） 1mol/ NaOH 溶液 （10）1mol/NaOH 溶液（含 2mg/mL NaBH 4）

21、（11）1mol/ HCl 溶液 （12）1.5mol/ 碳酸鈉溶液 （13）5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)） NaNO2 溶液 （ 14）1， 4-二氧六環(huán) 2、器材 （1）沸水浴、恒溫水浴 （2）加熱攪拌器 （3）離心機 （ 4）層析柱 1.2cm 30cm （5）燒杯、試管、布氏漏斗、抽濾瓶、三角燒瓶 （6）金屬網(wǎng)篩、溫度計、 pH 試紙 方法和步驟 一、親和吸附劑固相化雞卵粘蛋白的制備 方法一 1、交聯(lián)瓊脂糖 取 100mL 燒杯，稱取瓊脂糖 2g，加入蒸餾水 30mL ，用沸水浴使之溶解，冷卻凝固。 將凝固的瓊脂糖用 20 目篩網(wǎng)制成小顆粒。 在小燒杯中稱取凝膠顆粒， 以小顆粒濕重量每 g 加入 1

22、mL 1mol/L NaOH（ 其內(nèi)含 2 ml/mL NaBH 4）的比例，將相應(yīng)量的 NaOH 溶液加入盛有瓊脂糖顆粒的小燒杯中。小燒杯放入盛有 適量水的 250mL 燒杯中，以水浴方式在加熱攪拌器上加熱至30 ，攪拌。按上面所加 1mol/L NaOH（其內(nèi)含 2 ml/mL NaBH 4）量的 1/10 比例，量取環(huán)氧氯丙烷，并分成三份。在30加熱 攪拌的瓊脂糖顆粒中加入第一份環(huán)氧氯丙烷后，緩緩攪拌升溫至45，加入第二份環(huán)氧氯 丙烷，再緩緩攪拌升溫至 60時，加入第三份環(huán)氧氯丙烷。保持60，攪拌反應(yīng) 2h。趁熱 抽濾，用近沸的蒸餾水抽濾洗滌凝膠顆粒至中性。 2、對氨基苯磺酰乙基（ AB

23、SE ）-瓊脂糖 取 100mL 燒杯， 稱取上面交聯(lián)瓊脂糖 （抽干濕重） 10g ，加入 10mL 蒸餾水， 用 1 mol/L NaOH 調(diào) pH13 （試紙測定） 。 取 10mL 試管，稱入 0.8g 對 -硫酸酯乙砜基苯胺（ SESA ），加入 5mL 蒸餾水，置旋渦 震蕩器上震蕩 5min ，用 1.5 mol/L Na 2CO3調(diào)整溶液 pH 至 6，3 000r/min 離心 15min 。離心上 清液倒入盛有交聯(lián)瓊脂糖的燒杯中，按上述水浴方式，置加熱攪拌器上60水浴攪拌 3min 后，加入 0.25g Na2CO3， 60攪拌反應(yīng) 45min 。抽濾，沉淀用 0.05 mol

24、/L NaOH 洗滌三次， 用蒸餾水洗滌三次，抽干。 3、ABSE- 瓊脂糖重氮化 將上面抽干的 ABSE 瓊脂糖凝膠顆粒放入 100mL 燒杯中，加入 10mL 蒸餾水。按上 述水浴方式置攪拌器上冰浴攪拌，依次加入4預(yù)冷的 1mol/L HCl 10mL 和 5% NaNO 2溶液 10mL ，冰浴攪拌 20min 。抽濾。用 4預(yù)冷的 0.05 mol/L HCl 迅速抽洗二次。用 4預(yù)冷的 蒸餾水迅速抽洗二次，抽干。 4、固相化雞卵粘蛋白（偶聯(lián)） 取 100mL 燒杯， 稱取 0.3g 雞卵粘蛋白， 加入 10mL 0.1 mol/L pH9.5 碳酸鈉 -碳酸氫鈉緩 沖液，溶解后置冰浴

25、中待用。 將上面重氮化的 ABSE- 瓊脂糖凝膠在迅速抽干后即刻加入預(yù)先準(zhǔn)備于冰浴中的雞卵粘 蛋白溶液中，冰浴攪拌反應(yīng) 10h。抽濾。凝膠用蒸餾水抽洗三次。抽干后放入100mL 燒杯， 懸浮于適量的 0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl 緩沖液中。 方法二 用環(huán)氧氯丙烷活化 稱取 10g瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)， 用 100mL 1.0mol/L NaCl 溶液抽洗（少量多次） ，100mL 蒸餾水抽洗，抽干后轉(zhuǎn)移到 100mL 三角瓶中，分別加入蒸餾水 7mL 、1，4-二氧六環(huán) 8mL 、 2 mol/L NaOH 6.5mL 和環(huán)氧氯丙烷 1.5mL ，混勻，在 45恒溫水浴中，振搖

26、活化 2h。停止 活化，抽去活化劑，再用 100mL 蒸餾水洗（少量多次） ，洗后轉(zhuǎn)移至 100mL 三角瓶中，準(zhǔn) 備偶聯(lián)。 稱取約 100mg雞卵黏蛋白，用 10mL 0.lmol/L pH9.5 碳酸鈉緩沖液充分溶解（取樣稀釋 10 倍測定蛋白質(zhì)濃度） ，轉(zhuǎn)移到 100mL 三角瓶中與活化的瓊脂糖凝膠介質(zhì)混勻。在40恒 溫水浴中，振搖偶聯(lián) 22h 左右，停止偶聯(lián)。 取一個洗凈的抽濾瓶， 將巳經(jīng)偶聯(lián)好的瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)抽濾， 收集濾液， 測定濾液 中剩余的雞卵黏蛋白的含量。 凝膠用 100mL1.0mol/L NaCl 溶液抽洗， 接著用 100mL 蒸餾水 抽洗，再用 20mL 親和層析

27、洗脫液洗滌。將親和介質(zhì)轉(zhuǎn)移到 50mL 的小燒杯內(nèi)，加人 20mL 親和層析平衡液，浸泡 20min ，脫氣，裝柱。 二、親和層析 1、裝柱 層析柱（ 1.2cm30cm ）用水洗干凈，柱的上、下端聯(lián)接塑料管接上小乳膠管，裝上螺 旋夾。 將層析柱垂直裝好。打開柱上端口，從柱底下出口管朝柱內(nèi)注入水，使柱底全部充滿 水而不留氣泡，關(guān)閉柱出口。最終柱內(nèi)留存有1/4 1/5 的水。從出口處接上一根直徑 2 細(xì)塑管，塑管另一端固定在柱的上端部位。 輕輕攪動固定化卵粘蛋白凝膠懸浮溶液， 立即沿玻棒倒入層析管內(nèi)， 讓加入的凝膠在柱 內(nèi)自然沉降， 待柱底面上積起約 12 的凝膠床后， 打開柱出口水流。 隨著柱

28、內(nèi)水的流出， 上面不斷加入凝膠液， 使形成的凝膠床面上有凝膠連續(xù)下降 （如果凝膠床面上不再有凝膠顆 粒下降，應(yīng)吸去清液，用攪拌均勻地將凝膠床攪起數(shù)厘米高后，再加凝膠懸浮液， 不使形成 斷層面）。 當(dāng)凝膠沉積到柱的頂端約 3 處，停止裝柱，讓柱內(nèi)水面高于凝膠床界面 1 左右。 用眼睛觀察柱內(nèi)凝膠是否均勻，不應(yīng)有氣泡。 、平衡 柱裝好后，使層析床穩(wěn)定 15min。然后用 0.1 mol/L pH7.5 Tris-HCl 緩沖液洗柱平衡，流 速在 0.5mL/min 左右，將柱內(nèi)親和吸附劑中的游離蛋白洗盡，洗至柱流出液A280 值在 0.050 以下。 3、親和吸附 將實驗 （二）提取保存待用的胰蛋

29、白酶粗酶液或粗制品， 留少許用于檢測。 粗品用適量 0.1 mol/L pH7.5Tris-HCl 緩沖液溶解，溶解液稀釋至 80mL ，用 1mol/L NaOH 調(diào)整溶液至 PH7.5 8.0，濾紙過濾。取清液上柱，進(jìn)行親和吸附，流速0.5mL/min 。 4、洗柱 吸附完畢。用 0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl 緩沖液洗柱，開始流速 0.5mL/min 。 20min 后， 控制流速 0.7mL/min 。直至柱流出液 A280 值小于 0.030。 5、脫附 用 0.1mol/L pH2.5 甘氨酸緩沖液上柱脫附， 流速 0.15mL/min 。分部收集，每管收集 15m

30、in （約 2mL/ 管左右）。 6、檢測與收集 紫外吸收法檢測蛋白含量：上面收集的各管脫附液于紫外分光光度計中依次測定A280 值。 將初始峰值在 0.035 以上到峰尾數(shù)值在 0.070 左右的那部分收集管合并，作為胰蛋白酶 洗脫含量較集中部分。進(jìn)行胰蛋白酶活力測定和蛋白質(zhì)含量測定。 結(jié)果與計算 1、畫出層析圖譜； 2、計算親和層析前后樣品和收集峰的酶比活、純化倍數(shù)、酶活性回收率和蛋白質(zhì) 回收率。 實驗（四）胰蛋白酶抑制劑的制備 一、親和層析純化卵粘蛋白 原理 雙功能試劑 -硫酸脂乙砜基苯胺（ SESA）活化珠狀交聯(lián)瓊脂糖，重氮化后與胰蛋白酶 偶聯(lián)形成親和吸附劑，來制備卵粘蛋白（一種天然的

31、胰蛋白酶抑制劑） 。 可參見實驗（三） 。 試劑和器材 1、 試劑 （ 1）對 -硫酸酯乙砜基苯胺（ SESA ） （ 2） 1mol/ HCl 溶液 （ 3） 1mol/ NaOH 溶液 （ 4）碳酸鈉 （ 5） 1.5mol/ 碳酸鈉溶液 （ 6） 5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)） NaNO2 溶液 （ 7）10ml/mL 胰蛋白酶 （8）0.1mol/pH7.5 Tris-HCl 緩沖液 （內(nèi)含 0.01mol/LCaCl 2, 0.5mol/LNaCl） （ 9） 0.01mol/L pH4.8 乙酸緩沖液 （內(nèi)含0.2mol/LCaCl 2, 0.3 mol/LNaCl） （ 10）0.05mol/ pH2.5 甘氨酸緩沖液 2、器材 （1）新鮮雞蛋 （2）沸水浴、恒溫水浴 （3）抽濾瓶、布氏漏斗 （4）電磁攪拌器 （5）層析柱 （6）部分收集器 （7）紫外分光光度計 方法和步驟 1、親和吸附劑固定化胰蛋白酶的制備 （1）對氨基苯磺酰乙基（ ABSE ）-瓊脂糖制備 濾干的瓊脂糖凝膠 12