東方百合雜交后代SRAP鑒定

1、本科畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）本科畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 題題 目：目：東方百合雜交后代東方百合雜交后代 srapsrap 鑒定鑒定 學(xué)學(xué) 院：院： 森林資源與環(huán)境學(xué)院森林資源與環(huán)境學(xué)院 專(zhuān)專(zhuān) 業(yè)：業(yè)： 生物技術(shù)生物技術(shù) 學(xué)學(xué) 號(hào)：號(hào)： 學(xué)生姓名：學(xué)生姓名： 指導(dǎo)教師：指導(dǎo)教師： 職職 稱(chēng)：稱(chēng)： 東方百合雜交后代東方百合雜交后代 srapsrap 鑒定鑒定 摘要摘要：為探討東方百合雜交后代與親本間的親緣關(guān)系,本研究選用了 46 對(duì) srap (sequence- related amplified polymorphism)標(biāo)記引物對(duì)東方百合 constanta和sorbonne以 及 30 份constan

2、ta sorbonne的 f1代基因組 dna 進(jìn)行遺傳多樣性以及遺傳關(guān)系分析。 共檢測(cè)到 140 個(gè)多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)，平均每對(duì)引物組合產(chǎn)生 3.1 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中不同引 物組合擴(kuò)展條帶大小集中在 100 到 1100bp 之間。應(yīng)用 ntsys-pc (version 2.1)軟件采用 平均距離法(upgma)進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果表明， constanta和sorbonne以及其雜交子代間 的相關(guān)系數(shù)為 0.4800.672，其中sorbonne和 8 號(hào)供試材料的親緣關(guān)系最近。upgma 聚 類(lèi)將 32 個(gè)供試材料分成 2 類(lèi)，較好的反應(yīng)了其親緣關(guān)系。聚類(lèi)分析結(jié)果與形態(tài)分類(lèi)結(jié)果 大致吻合。

3、srap 標(biāo)記適合于百合屬植物遺傳多樣性與遺傳關(guān)系分析。本研究為百合雜交 后代真實(shí)性鑒定提供了 dna 分子證據(jù)，從而提高選育效率，降低育種成本。 關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞:東方百合;雜交后代;srap;遺傳關(guān)系 genetic diversity of oriental lily hybrid offspring using srap markers abstract to probe the hybrids and their parents relationship of oriental lily, 45 sequence-related amplified polymorphism (srap)

4、 primer combinations were chosen to analyze genetic diversity of constanta and sorbonne and 33 f1 hybrids of constanta sorbonne. 140 polymorphism loci were produced and the average number of polymorphic loci were 3.1per primer pairs.primer combinations of different bands in 100 on size expanded to 1

5、100bp. dendrograms were constructed by the unweighted pair group method of arithmetic average (upgma) using the ntsys-pc version 2.1. the result showed the genetic similarity coefficient of constanta and sorbonne and 30 f1 hybrids of constanta sorbonne ranged from 0.480 to 0.672.among them sorbonne

6、dan 8 of the materials closest relative. 32 materials were classified into 2 clustering groups by upgma, the result quite shows their linage relationship. clustering analysis results and the shape classification results roughly identical. srap mark suitable for the lily family genetic diversity and

7、genetic relationship analysis.this research will provid evidence of dna molecules for identification of lily hybrids, improve breeding efficiency and reduce the cost of breeding. key words: oriental lily; hybrid; srap; genetic relationship 目目 錄錄 前言前言 .1 1 文獻(xiàn)綜述.2 1.1 遺傳標(biāo)記及其應(yīng)用.2 1.1.1 形態(tài)標(biāo)記.2 1.1.2 細(xì)胞標(biāo)

8、記.2 1.1.3 生化標(biāo)記.2 1.1.4 分子標(biāo)記.2 1.2 常用分子表及類(lèi)型.3 1.2.1 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（rflp）.3 1.2.2 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 dna（rapd）.3 1.2.3 簡(jiǎn)單重復(fù)序列（ssr）.4 1.2.4 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（aflp） .4 1.2.5 簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增多態(tài)性（issr）.4 1.2.6 序列相關(guān)擴(kuò)增性（srap）.4 1.3 常用分子標(biāo)記 rflp、rapd、ssr、aflp、issr、srap .5 1.4 dna 分子標(biāo)記在花卉研究中的應(yīng)用及進(jìn)展 .6 1.4.1 種質(zhì)資源鑒定.6 1.4.2 遺傳多樣性研究.6 1.4.3 親緣

9、關(guān)系及分類(lèi)研究.6 1.5 花卉分子育種中應(yīng)注意的問(wèn)題.7 2 材料與方法.7 2.1 實(shí)驗(yàn)材料.7 2.2 試驗(yàn)方法.8 2.2.1 基因組 dna 提取 .8 2.2.2 pcr 體系及擴(kuò)增.8 2.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì).8 3 結(jié)果與分析.9 3.1 srap 擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性條帶分析.9 3.2 遺傳多樣性分析.9 4 討論與展望.10 致謝致謝 .12 參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn) .13 前言 百合(lilium.l.)是百合科（liliaceae）百合屬(lilium)植物所有種的總稱(chēng)，為多年生草 本球根花卉1。百合是世界五大鮮切花之一，其花朵碩大、花色艷麗、花姿百態(tài)、芳香宜 人，被世界各地廣為

10、栽培，在世界鮮切花市場(chǎng)中占有十分重要的地位。目前，荷蘭和美 國(guó)成為世界百合的培育中心，已培育出數(shù)以千計(jì)的品種，幾乎壟斷了國(guó)際百合種球市場(chǎng)。 我國(guó)的百合鮮切花生產(chǎn)，種球幾乎完全依賴(lài)進(jìn)口，進(jìn)口的種球種性退化快，嚴(yán)重制約著 我國(guó)百合鮮切花產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。 中國(guó)是百合屬植物自然分布中心，全世界百合約有 97 個(gè)種，而起源于我國(guó)的就有 47 個(gè)種和 18 個(gè)變種，約占世界百合屬植物的一半，其中有 36 個(gè)種和 15 個(gè)變種為中國(guó)特有 種2。中國(guó)的百合種質(zhì)源于 18 世紀(jì)后期開(kāi)始相繼傳入歐洲，對(duì)世界百合育種做出了極大 的貢獻(xiàn)。中國(guó)百合資源不僅是我國(guó)的寶貴財(cái)富，也是世界花卉種質(zhì)資源庫(kù)中的寶貴財(cái)富3。 利用我國(guó)

11、豐富的百合資源，采用生物技術(shù)與常規(guī)育種相結(jié)合，培育出擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán) 的百合新品種，這對(duì)改變我國(guó)在百合產(chǎn)業(yè)上依賴(lài)進(jìn)口品種的被動(dòng)局面，提高我國(guó)花卉業(yè) 在國(guó)際市場(chǎng)種的競(jìng)爭(zhēng)力，具有十分重要的意義。 針對(duì)以上問(wèn)題，我國(guó)早在 20 世紀(jì) 80 年代初，黃濟(jì)明就率先進(jìn)行百合的雜交育種工 作，90 年代以來(lái)，雜交育種研究持續(xù)不斷，當(dāng)時(shí)的雜交以野生百合間的雜交為主，后因 工作中斷，并沒(méi)有培育出有市場(chǎng)潛力的品種4。近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)百合市場(chǎng)的持續(xù)升溫， 從事百合育種的科研院所也在增多。目前，在百合資源收集和種質(zhì)創(chuàng)新方面開(kāi)展工作較 多的單位主要包括北京農(nóng)科院、北京林業(yè)大學(xué)、南京林業(yè)大學(xué)、西北農(nóng)林科技大學(xué)、云 南省農(nóng)

12、科院等，但在百合育種的基礎(chǔ)理論方面的研究則相對(duì)較少。 從 2002 年開(kāi)始,本實(shí)驗(yàn)室較為系統(tǒng)的收集整理了我國(guó)野生百合資源及代表性商品種。 已收集了野生百合 35 個(gè)種，1000 多份；采用細(xì)胞工程及田間保存相結(jié)合的方法，共計(jì)保 存了 21 個(gè)種 45 個(gè)種源的 300 多份種質(zhì)。收集商品種 30 個(gè)，其中東方百合 15 個(gè)，亞洲 百合 11 個(gè)，麝香百合 4 個(gè)；建立了野生百合及部分商品種的組培產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)體系； 運(yùn)用花粉形態(tài)形狀、issr 分子標(biāo)記、its 序列、葉綠體 trnl-f 區(qū)序列分別研究收集種質(zhì) 資源的親緣關(guān)系5-9；2004 年-2008 年連續(xù) 5 年開(kāi)展百合的雜交育種及胚

13、拯救研究，獲得 了一大批遠(yuǎn)緣雜交種后代，篩選出了少數(shù)有潛力的新品系。但在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，百合 為多年生草本花卉，東方百合雜交種后代開(kāi)花需要 3 年以上時(shí)間，使得新品系的選育過(guò) 程漫長(zhǎng)。因此，縮短育種周期，提高選育效率，從理論上探索百合分子標(biāo)記輔助育種 （marker assistant selection,mas）的分子基礎(chǔ)顯得尤為重要。 1 文獻(xiàn)綜述 1.1 遺傳標(biāo)記及其應(yīng)用 遺傳學(xué)上通常將生物體中可識(shí)別的染色體或染色體的一段等位基因或在家系中傳遞 的任何一種遺傳特性等稱(chēng)為遺傳標(biāo)記(genetic markers)。經(jīng)典遺傳學(xué)中是以形態(tài)標(biāo)記和細(xì) 胞學(xué)標(biāo)記為基礎(chǔ)的。20 世紀(jì)末，由于遺傳學(xué)在基

14、因定位、遺傳作圖、基因組研究及群體 遺傳學(xué)與進(jìn)化遺傳學(xué)等領(lǐng)域的擴(kuò)展與應(yīng)用，經(jīng)典的、基于表型的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)水平上 的遺傳標(biāo)記已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足要求，一批新型的遺傳標(biāo)記，如蛋白質(zhì)標(biāo)記、同工酶標(biāo)記、 dna 標(biāo)記等分子標(biāo)記被開(kāi)發(fā)利用10-13。當(dāng)前遺傳標(biāo)記主要有 4 種類(lèi)型： 1.1.1 形態(tài)標(biāo)記 即植物的外部特征特性，如株高、根粗、穗長(zhǎng)、粒色、生物學(xué)產(chǎn)量等。在眾多的遺 傳標(biāo)記中，形態(tài)學(xué)標(biāo)記的應(yīng)用歷史最為悠久。孟德?tīng)栒抢猛愣?7 對(duì)單基因控制的形 態(tài)性狀進(jìn)行研究，并建立了著名的分離規(guī)律和自由組合規(guī)律。形態(tài)標(biāo)記簡(jiǎn)單直觀，但其 標(biāo)記數(shù)有限、多態(tài)性很差、易受環(huán)境條件影響。因而其在應(yīng)用上極其有限。 1.

15、1.2 細(xì)胞標(biāo)記 染色體畸變?nèi)绲刮?、移位等使得染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)的變化常常引起表型的變化，因 此染色體的變化可以作為一種細(xì)胞學(xué)的遺傳標(biāo)記。細(xì)胞學(xué)標(biāo)記主要是染色體核型(染色體 數(shù)目、大小、著絲點(diǎn)位置等)和帶型。顯然這些標(biāo)記的數(shù)目也很有限。 1.1.3 生化標(biāo)記 主要包括同工酶和貯藏蛋白，其標(biāo)記數(shù)亦有限，不能滿(mǎn)足種質(zhì)資源鑒定和育種工作 的需要。 1.1.4 分子標(biāo)記 是一種新的理想的遺傳標(biāo)記形式。分子標(biāo)記輔助選擇(molecular marker-asslsted selection，簡(jiǎn)稱(chēng) mas)是現(xiàn)代分子生物學(xué)與傳統(tǒng)遺傳育種的結(jié)合點(diǎn)，借助分子標(biāo)記可以對(duì) 育種材料從 dna 水平上進(jìn)行選擇，從而達(dá)

16、到作物產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性等綜合性狀的高效改 良。它有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)在植物體的各個(gè)組織、各發(fā)育階段均可檢測(cè)到，不受外界環(huán)境限 制，不存在表達(dá)與否的問(wèn)題；(2)多態(tài)性高；(3)數(shù)量極多，遍布整個(gè)基因組。目前，分子 標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源研究、遺傳圖譜構(gòu)建、目的基因定位、起源進(jìn)化研究和標(biāo)記 輔助選擇育種等方面。分子標(biāo)記育種需要以下技術(shù)的支撐：(1)多態(tài)性高的分子標(biāo)記繪制 的遺傳圖譜；(2)高效自動(dòng)化技術(shù)；(3)與目標(biāo)農(nóng)藝性狀基因緊密連鎖的經(jīng)濟(jì)有效的分子標(biāo) 記。生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生了許多由 dna 堿基序列變異所致的遺傳變異。以物種內(nèi) 這種極為豐富的 dna 堿基序列變異為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記

17、技術(shù)已相繼出現(xiàn)幾十種， 它們各具特色，為不同的研究提供了豐富的技術(shù)手段。但是分子標(biāo)記育種技術(shù)目前尚不 完善和成熟，其不能作為一種育種方法單獨(dú)使用，應(yīng)將分子標(biāo)記育種技術(shù)與常規(guī)育種技 術(shù)相結(jié)合14-16。目前，常用的 dna 分子標(biāo)記有 rapd、rflp、aflp、ssr、issr、snp 和 srap 等。 1.2 常用分子表及類(lèi)型 1.2.1 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（rflp） 是發(fā)展最早的分子標(biāo)記技術(shù)。是利用放射性同位素(通常用 p32)或非放射性物質(zhì)(如地 高辛等)標(biāo)記探針，與轉(zhuǎn)移于支持膜上的總基因組 dna(經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶消化)雜交，通過(guò) 顯示限制性酶切片段的大小，來(lái)檢測(cè)不同遺傳位點(diǎn)等位

18、變異(多態(tài)性)的一種技術(shù)。用作 rflp 的探針有 cdna 探針(即互補(bǔ) dna，用 nka 作模板通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成的 dna)與基因 組 dna(gdna)探針兩種。cdna 探針的保守性較強(qiáng)，許多禾本科植物(如小麥、水稻、玉 米、甘蔗等)的 cdna 探針都可以通用，因此這類(lèi)探針是研究植物起源演化的較好探針。 但是這類(lèi)探針檢測(cè)的多態(tài)性頻率較低，在育種上應(yīng)用可能會(huì)較少。cdna 探針是從植物總 基因組 dna 中克隆出來(lái)的，這類(lèi)探針檢測(cè)的多態(tài)性頻率較高，但不同種屬特異性較強(qiáng)。 rflp 標(biāo)記具有共顯性的特點(diǎn)，它可以區(qū)別純合基因型和雜合基因型，能夠提供單個(gè)位點(diǎn) 上的較完整的資料。rflp 的探

19、針極多，目前各種主要作物上篩選的探針均有數(shù)千個(gè)，因 而它檢測(cè)的遺傳位點(diǎn)也非常之多。rflp 標(biāo)記主要應(yīng)用于各種植物遺傳連鎖圖的繪制和目 標(biāo)基因的標(biāo)記。但是 rflp 標(biāo)記對(duì) dna 的需要量較大，需要的儀器設(shè)備較多，技術(shù)也較 為復(fù)雜。 1.2.2 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 dna（rapd） 是以基因組 dna 為模板，以一個(gè)隨機(jī)的寡核昔酸序列(通常為 10 個(gè)堿基對(duì))作引物通 過(guò) pcr 擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生不連續(xù)的 dna 產(chǎn)物，用以檢測(cè) dna 序列的多態(tài)性。該方法的優(yōu) 點(diǎn)主要是簡(jiǎn)單易行、需要的 dna 量極少、無(wú)放射性、實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單、周期短，因此受到 研究者的普遍歡迎。目前該方法已廣泛用于種質(zhì)資源鑒定

20、與分類(lèi)、目標(biāo)性狀基因的標(biāo)記 等研究上，也有人利用 rapd 標(biāo)記來(lái)繪制遺傳連鎖圖。該方法的缺點(diǎn)主要有兩點(diǎn):其一是 多數(shù)位點(diǎn)的標(biāo)記帶表現(xiàn)為顯性的特點(diǎn)，因此不能提供完整的遺傳信息；更主要的是該方 法在一些植物上擴(kuò)增效果的穩(wěn)定性和重復(fù)性較差。 1.2.3 簡(jiǎn)單重復(fù)序列（ssr） 在人類(lèi)及動(dòng)植物的基因組中，均存在著許多由 1-4 個(gè)堿基對(duì)組成的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，如 (ca)n，(ac)n，(caa)n(其中 n 為重復(fù)次數(shù))等。在植物中，akkyaa 等(1992)和 mogrnaet 等(1993)發(fā)現(xiàn) at 重復(fù)較 ac 重復(fù)更為普遍。在人類(lèi)基因組中，這些重復(fù)序列分布遍及所 有的染色體及染色體的各個(gè)區(qū)

21、段，在植物上也很可能如此。目前 ssr 標(biāo)記已被廣泛用于 資源鑒定、連鎖圖繪制及目標(biāo)性狀基因的標(biāo)記等研究上。與 rflp 標(biāo)記相比，ssr 檢測(cè)的 多態(tài)性頻率要高很多。ssr 除用作探針外，還可通過(guò) pcr 擴(kuò)增植物基因組中所含的重復(fù) 序列區(qū)域，因此它具有其它 pcr 方法所不具備的優(yōu)點(diǎn)。但是要克隆足夠數(shù)量的 ssr，并 對(duì)其進(jìn)行測(cè)序和設(shè)計(jì)引物，沒(méi)有足夠的投資、人力和時(shí)間，是不可能實(shí)現(xiàn)的。 1.2.4 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（aflp） aflp 是 1992 年由荷蘭 kyegene 公司科學(xué)家 zbaeuamare 和 vospieetr 等人發(fā)明的一 項(xiàng)技術(shù)。其基本原理是選擇性擴(kuò)增基因組 d

22、na 的酶切片段。由于不同材料的 dna 的酶 切片段存在差異，因而便產(chǎn)生了擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性。由此可見(jiàn)，aflp 實(shí)際是 rflp 與 pcr 相結(jié)合的一種產(chǎn)物。aflp 標(biāo)記的多態(tài)性強(qiáng)，非常適合繪制品種的指紋圖譜及進(jìn)行分 類(lèi)研究。該項(xiàng)技術(shù)的另一個(gè)特點(diǎn)是穩(wěn)定性、重復(fù)性強(qiáng)，不受環(huán)境影響，而且還具有 dna 用量少，靈敏度高、快速高效等優(yōu)點(diǎn)；但存在操作復(fù)雜，價(jià)格較高的問(wèn)題。 1.2.5 簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增多態(tài)性（issr） 是一種新型分子標(biāo)記，其原理是根據(jù) ssr 的特點(diǎn)，采用錨定 ssr 策略，對(duì)簡(jiǎn)單重復(fù) 序列間的遺傳信息進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增的分子標(biāo)記技術(shù)。由 ziekiewicz 等(1994)提出

23、錨定 ssr 的新策略，采用錨定的微衛(wèi)星 dna 為引物，即在 ssr 序列的 3，端或 5，端加上 1-4 個(gè) 簡(jiǎn)并堿基，每個(gè)簡(jiǎn)并堿基代表 2-3 個(gè)堿基，優(yōu)點(diǎn)是在基因組上只有那些與錨定的核昔酸匹 配的位點(diǎn)才能被靶定，避免 ssr 在基因組的滑動(dòng)，大大提高了 pcr 擴(kuò)增的專(zhuān)一性。所研 究生物系統(tǒng)的基因頻率及方差、基因的多寡及分布，是揭示遺傳多樣性及差異的基本遺 傳參數(shù)，是反映遺傳結(jié)構(gòu)的主要量值。dna 水平的遺傳多態(tài)性本質(zhì)是核昔酸序列的差異， 分子標(biāo)記是 dna 序列信息的間接反應(yīng)，借助于標(biāo)記譜帶及多態(tài)性譜帶，估算指紋圖譜隱 含的基因頻率與差異，通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件對(duì)種內(nèi)遺傳變異豐富程度和遺傳結(jié)

24、構(gòu)、種間遺傳 距離、群體間分化進(jìn)行分析。 1.2.6 序列相關(guān)擴(kuò)增性（srap） srap 是一種基于 pcr 的新型標(biāo)記，由美國(guó)加州大學(xué)作物系 li 和 quiros 博士提出的。 srap 技術(shù)是與 rapd 技術(shù)相似的一種標(biāo)記技術(shù)，即 srap 可用一對(duì)引物，但所用的引物 是在 ssr 的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的。srap 技術(shù)是一種無(wú)需任何序列信息即可直接 pcr 擴(kuò)增的新 型分子標(biāo)記技術(shù)。srap 標(biāo)記已在水稻、棉花、番茄、馬鈴薯、柑橘、大蒜、辣椒、黃瓜、 芹菜、油菜、擬南芥、小麥等植物研究中得到成功應(yīng)用,具有簡(jiǎn)便、中等產(chǎn)量、高共顯性、 重復(fù)性、易于分離條帶及測(cè)序等優(yōu)點(diǎn),在基因組中分布均勻，適合

25、基因定位、基因克隆、 遺傳圖譜構(gòu)建等生物學(xué)研究。在 srap 分子標(biāo)記中引物的設(shè)計(jì)是關(guān)鍵, 它利用獨(dú)特的引 物設(shè)計(jì)對(duì) orfs ( open reading frames, 開(kāi)放式閱讀框)進(jìn)行擴(kuò)增。正向引物長(zhǎng) 17 bp 5端的 前 10 bp 是一段非特異性的填充序列, 緊接著是 ccgg, 它們一起組成核心序列, 然后是 靠著 3端的 3 個(gè)選擇性堿基, 對(duì)外顯子進(jìn)行擴(kuò)增。反向引物長(zhǎng) 18 bp, 即由 5的 11 個(gè)無(wú) 特異性的填充序列和緊接著的 aatt 組成的核心序列, 及 3的 3 個(gè)選擇性堿基, 對(duì)內(nèi)含 子和啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增； 因個(gè)體不同以及物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔長(zhǎng)度不

26、等 而產(chǎn)生多態(tài)性擴(kuò)增產(chǎn)物。 1.3 常用分子標(biāo)記 rflp、rapd、ssr、aflp、issr、srap 盡管 rflp、rapd、ssr、issr 和 aflps 種分子標(biāo)記在植物輔助育種、遺傳圖譜構(gòu) 建、數(shù)量性狀基因位點(diǎn)作圖及種質(zhì)資源遺傳多樣性研究上得到了廣泛的應(yīng)用，但它們?cè)?實(shí)際應(yīng)用上仍有各自的特點(diǎn)。如 rflp 對(duì) dna 多態(tài)性檢出的靈敏度不高，rflp 連鎖圖 上常常存在許多大的空間區(qū)，且操作繁瑣，有放射性危害；rapd 存在穩(wěn)定性和重復(fù)性較 差等問(wèn)題，只能檢測(cè)到等位基因的有無(wú)，無(wú)法鑒別純合子和雜合子的差異；ssr 必需預(yù) 先知道微衛(wèi)星兩翼序列信息才能設(shè)計(jì)引物，許多物種需要構(gòu)建文

27、庫(kù)，而且研制開(kāi)發(fā)引物 需要幾個(gè)月的時(shí)間；aflp 也存在操作步驟復(fù)雜、繁瑣，對(duì)儀器設(shè)備和操作程序的要求都 很高、費(fèi)用也較高等問(wèn)題；srap 其原理是利用基因外顯子里 g、c 含量豐富，而啟動(dòng)子 和內(nèi)含子里 a、t 含量豐富的特點(diǎn)設(shè)計(jì)一對(duì)獨(dú)特的引物，對(duì)開(kāi)放閱讀框架進(jìn)行擴(kuò)增。相關(guān) 序列擴(kuò)增多態(tài)性( srap) 是一種新型的基于 pcr 的標(biāo)記系統(tǒng), 是由美國(guó)加州大學(xué)蔬菜系 li 與 quiros 博士17于 2001 年在蕓薹屬植物開(kāi)發(fā)出來(lái), 又叫基于序列擴(kuò)增多態(tài)性- sbap。引物設(shè)計(jì)是它的核心, srap- pcr 反應(yīng)體系中使用兩個(gè)引物:即 17 個(gè)堿基的正向 引物和 18 個(gè)堿基的反向引物

28、。正向引物的 ccgg 和反向引物的 aatt 的核心序列使得 srap 標(biāo)記主要是對(duì)基因組的開(kāi)放閱讀框(orf)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。srap 標(biāo)記是基于 pcr 的標(biāo)記系統(tǒng), 具有操作簡(jiǎn)便快速、成本低、無(wú)放射性污染等優(yōu)點(diǎn)。由于在設(shè)計(jì)引物時(shí)正反 引物分別是針對(duì)序列相對(duì)保守的外顯子與變異大的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔序列, 因此, 多 數(shù) srap 標(biāo)記在基因組中分布是均勻的, orfs 是基因的重要組成部分, 基因的多樣性有 利于揭示遺傳資源的多樣性。而且 srap 引物設(shè)計(jì)可節(jié)省實(shí)驗(yàn)費(fèi)用, 通過(guò)改變 srap 引 物 3端的選擇性堿基可以設(shè)計(jì)多種引物, 上游引物和下游引物的自由組合, 從而可以在 較少的

29、引物數(shù)中進(jìn)行多種組合, 大大降低了引物合成成本, 提高了引物使用效率。srap 作為一種新的標(biāo)記技術(shù)已成功構(gòu)建了了蕓薹、烤煙、棉花、黃瓜、甘薯等的遺傳連鎖圖 譜, 其分子標(biāo)記在大田作物研究的各個(gè)方面都有應(yīng)用。此技術(shù)具有簡(jiǎn)單、高效、高共顯性、 重復(fù)性高、易測(cè)序等優(yōu)點(diǎn)，適合于基因的定位與克隆等分子生物學(xué)的研究。 1.4 dna 分子標(biāo)記在花卉研究中的應(yīng)用及進(jìn)展 1.4.1 種質(zhì)資源鑒定 長(zhǎng)期以來(lái)，各種花卉異地相互引種栽培，雜交及突變，品種名和品種分類(lèi)十分混亂。 因此，對(duì)現(xiàn)有花卉品種準(zhǔn)確的鑒定和分析十分重要，而分子標(biāo)記技術(shù)為品種鑒定提供了 新手段。ballard18等對(duì) 22 個(gè)月季的栽培品種進(jìn)行了

30、 rflp 和 rapd 分析，鑒定出其中的 20 個(gè)月季品種，結(jié)果表明，所有以抗病和感病為親本的 4 倍體月季品種表現(xiàn)出較高的遺 傳多態(tài)性，所以抗病和感病的雜交后代適合遺傳圖譜的建立。明軍19等利用梅花 aflp 多態(tài)位點(diǎn)信息，從 178 個(gè)梅花品種及近緣（品）種構(gòu)成的群體中，選取了 52 個(gè)品種樣品 進(jìn)行了梅花品種資源核心種質(zhì)的構(gòu)建。 于燕莉20采用 rapd 標(biāo)記方法對(duì)金銀花中的大毛花金銀花、雞爪花金銀花品系進(jìn)行 鑒定，使用 35 個(gè)隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，結(jié)果大毛花金銀花共擴(kuò)增 dna 譜帶 24 條；雞 爪花金銀花共擴(kuò)增 dna 譜帶 26 條，從而區(qū)分 2 個(gè)形態(tài)極為相似的品系。 1

31、.4.2 遺傳多樣性研究 保護(hù)生物多樣性已成為國(guó)際熱點(diǎn)問(wèn)題，其核心內(nèi)容是遺傳多樣性的保護(hù)。遺傳多樣 性主要是指種內(nèi)不同居群之間或同一居群不同個(gè)體之間的遺傳變異的總和。遺傳多樣性 會(huì)反映在 dna 水平上，因此近年來(lái)，dna 分子標(biāo)記被廣泛地應(yīng)用于植物遺傳多樣性和 遺傳結(jié)構(gòu)的研究中。石勝友21用 8 對(duì)引物對(duì)變?nèi)~海棠 30 個(gè)不同的變異類(lèi)型進(jìn)行了 aflp 分析，從 dna 水平上探明了變?nèi)~海棠的遺傳多樣性是變?nèi)~海棠與隴東海棠和花葉海棠產(chǎn) 生滲入雜交形成的。侯小改利用熒光標(biāo)記 aflp 技術(shù)對(duì) 30 份牡丹栽培品種進(jìn)行了總基因 組 dna 水平上的多態(tài)性檢測(cè)，結(jié)果共獲得 1123 條可統(tǒng)計(jì)的條帶

32、，其中 965 條呈多態(tài)性， 多態(tài)性帶百分率達(dá) 86%，揭示了牡丹栽培種質(zhì)豐富的遺傳多樣性。田曄林22用 rapd 分 子標(biāo)記技術(shù)分析 8 個(gè)一串紅品種 dna 的多態(tài)性，30 個(gè)引物擴(kuò)增出 162 條 dna 譜帶， 119 條是多態(tài)性的，多態(tài)性占 73.5%，這表明了 rapd 技術(shù)是檢測(cè)一串紅品種遺傳多樣性 的有效工具，并為優(yōu)良品種的遺傳改良提供了選配育種親本的依據(jù)。 1.4.3 親緣關(guān)系及分類(lèi)研究 應(yīng)用分子標(biāo)記進(jìn)行植物的分類(lèi)及親緣關(guān)系分析，可以在分子水平上闡明生物系統(tǒng)演 化及分類(lèi)情況，也直接關(guān)系到育種親本的選配和種質(zhì)資源的合理有效利用。王獻(xiàn)23利用 aflp 來(lái)研究紫薇的親緣關(guān)系，結(jié)果

33、表明，矮生品種間的親緣關(guān)系較近，他們中的粉潤(rùn)和 矮生垂枝粉的關(guān)系最近；具有優(yōu)異性狀的品種白蝶飛舞和層云積雪的關(guān)系較近，紅蝶飛 舞和藍(lán)色妖姬的關(guān)系也較近，而與白密香的關(guān)系較遠(yuǎn)；2 個(gè)普通的白花品種紫爪銀薇和白 云映霞的關(guān)系較近。2000 年，周春玲24利用 aflp 技術(shù)，對(duì)菊屬植物 12 個(gè)分類(lèi)群的親緣 關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果表明，所選的 2 個(gè)栽培品種滁菊和亳菊可歸并為一個(gè)品種，該品種 與毛華菊、野菊、甘菊親緣關(guān)系相對(duì)較近，與紫花野菊的親緣關(guān)系次之，而與小紅菊的 親緣關(guān)系相對(duì)最遠(yuǎn)。張俊祥采用 aflp 技術(shù)對(duì)云南省蘭屬的 14 個(gè)種和 3 個(gè)變種中的 38 份 樣本進(jìn)行了親緣關(guān)系分析，16 對(duì)

34、aflp 引物擴(kuò)增的條帶聚類(lèi)結(jié)果表明，云南省國(guó)蘭遺傳 多樣性非常廣泛，相同品種間的不同個(gè)體擴(kuò)增出的條帶模式相差很大。劉小莉25對(duì)報(bào)春 花屬 10 個(gè)種的種間變異進(jìn)行了 issr 分析，將這 10 個(gè)種明顯地聚為了三大類(lèi)。林麗美26 用 rapd 技術(shù)對(duì)百合屬的 4 種商品藥材百合進(jìn)行了鑒定。趙喜華27對(duì) 11 種杜鵑屬植物 進(jìn)行了 rapd 分析，基于 dna 分子水平探討了杜鵑屬植物種間的親緣關(guān)系和系統(tǒng)位置。 于恒秀28利用 issr 引物鑒定芍藥栽培品種間的親緣關(guān)系。蘇雪29應(yīng)用 rapd 技術(shù)對(duì)甘 肅栽培的 16 種紫斑牡丹品種的分類(lèi)進(jìn)行了初步研究。 1.5 花卉分子育種中應(yīng)注意的問(wèn)題

35、花卉分子育種應(yīng)把目的基因的開(kāi)發(fā)利用與花卉基因文庫(kù)的保存緊密地結(jié)合起來(lái)，保 護(hù)花卉遺傳資源的多樣性，防止因分子育種加劇花卉資源遺傳的均一性。以基因工程技 術(shù)為主導(dǎo)的分子育種技術(shù)與傳統(tǒng)育種方法各有所長(zhǎng)，因此花卉分子育種與傳統(tǒng)育種方法 必須緊密結(jié)合，充分發(fā)揮兩者的長(zhǎng)處，以便加速新奇花卉品種選育的進(jìn)程。如可以將外 源目的基因通過(guò)基因工程手段先導(dǎo)入少數(shù)優(yōu)良品種中，然后再通過(guò)雜交育種方法將目的 基因?qū)肫渌贩N或親緣關(guān)系較近花卉中，進(jìn)而擴(kuò)大育種規(guī)模。我國(guó)花卉分子育種進(jìn)展 較慢，而歐美一些國(guó)家進(jìn)展很快，為了加快我國(guó)花卉分子育種的步伐，我們應(yīng)加強(qiáng)國(guó)際 合作，借鑒他們已有的研究成果，少走彎路?；ɑ芊肿佑N需要植

36、物學(xué)、植物栽培學(xué)、 分子生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)、數(shù)量遺傳學(xué)、植物化學(xué)、生物化學(xué)等多學(xué)科共 同協(xié)作才可更好地完成，因此應(yīng)加強(qiáng)部門(mén)、行業(yè)、學(xué)科間的交流與合作。 2 材料與方法 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)于 2012 年 3 月5 月在南京林業(yè)大學(xué)進(jìn)行。供試的東方百合及其雜交后代均來(lái) 自南京林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)室百合試驗(yàn)田。取幼嫩葉片低溫帶回實(shí)驗(yàn)室，液氮冷 凍后-70保存?zhèn)溆谩?2.2 試驗(yàn)方法 2.2.1 基因組 dna 提取 采用改良的 catb 法提取 dna，去 rna 后調(diào)整 dna 濃度至 40 ng/l，-70保存 備用。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) dna 質(zhì)量和完整性；核酸蛋白分析

37、儀檢測(cè) dna 濃度。 2.2.2 pcr 體系及擴(kuò)增 選取了 46(引物序列如表 1 所示)對(duì)多態(tài)性高，重復(fù)性好的的引物，用于 pcr 擴(kuò)增(如 圖 1)。此次 pcr 擴(kuò)增反應(yīng)選取的是 10l 的反應(yīng)體系。其中，ddh2o 3.35l，buffer1l，mg2+1l，dntp0.3l，上、下游引物各 1.6l，taq0.15l 以及 1l 樣本 dna。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4預(yù)變性 8 分鐘，94變性 1 分鐘，35復(fù)性 1 分鐘， 72延伸 1 分 30 秒，5 個(gè)循環(huán)，94變性 1 分鐘，59.3復(fù)性 1 分鐘，71延伸 1 分 30 秒，30 個(gè)循環(huán)，72延伸 8 分鐘。4保存。擴(kuò)增產(chǎn)物采

38、用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。 表1 srap分子標(biāo)記引物名稱(chēng)及序列 tab. 1primers and their sequence of srap 正向引物 名稱(chēng) 引物堿基序列 反向引物 名稱(chēng) 引物堿基序列 me1tga gtc caa acc ggt aaem1gac tgc gta cga att aat me2tga gtc caa acc ggt ccem2gac tgc gta cga att ctg me3tga gtc caa acc gga caem3gac tgc gta cga attcga me4tga gtc caa acc gga ctem4gac tgc gta c

39、ga att atg me5tga gtc caa acc gga ggem5gac tgc gta cga att cca me6tga gtc caa acc gga acem6gac tgc gta cga att tag me7tga gtc caa acc gga cgem7gac tgc gta cga attgag me8tga gtc caa acc gga gaem8gac tgc gta cga att gcc me9tga gtc caa acc ggt tgem9gac tgc gta cga att tca me10tga gtc caa acc ggt gtem10

40、gac tgc gta cga att cat 2.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 研究采用引物名稱(chēng)加片段大小的方式對(duì)作圖所用的 issr 和 srap 標(biāo)記所擴(kuò)增的條帶 進(jìn)行命名，如 me1em3-260 指用 srap 引物 me1em3 擴(kuò)增出的片段長(zhǎng)度為 260bp 的擴(kuò)增 帶，對(duì)獲得的 dna 條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在相同遷移位置，清晰條帶記為 1，模糊或無(wú)條帶 圖 1 srap 引物 me1em6 對(duì)部分 f1代個(gè)體的擴(kuò)增結(jié)果 fig. 1 the results of pcr amplification use the primer of 3a01 of srap me1em6 of part of

41、f1 individual. 表2 srap標(biāo)記的擴(kuò)增情況 tab.2 summary of the detection of srap markers in oriental lily 項(xiàng)目srap 數(shù)據(jù) 篩選出的引物數(shù)目46 擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小范圍0.11.1kb 檢測(cè)出的標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)140 每個(gè)引物擴(kuò)增出多態(tài)性位點(diǎn)的平均數(shù)3.04 記為 0，建立 0、1 原始矩陣。 3 結(jié)果與分析 3.1 srap 擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性條帶分析 選取的 46 對(duì)重復(fù)性好，多態(tài)性明顯的引物對(duì) 32 份供試材料的基因組 dna 進(jìn)行擴(kuò)增， 擴(kuò)增結(jié)果得到 140 條清晰條帶，平均每對(duì)引物產(chǎn)生 3.04 條多態(tài)性條帶。

42、擴(kuò)增產(chǎn)物片段大 小范圍在 0.11.1kb。 3.2 遺傳多樣性分析 32 份供試材料的遺傳相似系數(shù)變化范圍為 0.41420.6286，相似系數(shù)均值為 0.5214。32 份材料的聚類(lèi)分析（如圖 2 所示） ，可以看出，東方百合雜交后代主要分為 2 個(gè)群體，一個(gè)群體和constanta的親緣性較為密切，另一個(gè)則和sorbonne比較密切，總 體上和constanta的親緣性較近。遺傳距離在 0.4800.672 之間。 圖 2 東方百合雜交后代聚類(lèi)圖 fig. 2 oriental lily hybrid clustering 4 討論與展望 我國(guó)百合種間差異明顯、基因資源豐富。同時(shí)也證明

43、srap 標(biāo)記適合于百合屬植物 遺傳多樣性分析，是一種有效、可靠的分子標(biāo)記，聚類(lèi)結(jié)果顯示供試材料表現(xiàn)出一定的 地理相似性。在實(shí)驗(yàn)中要恪守實(shí)驗(yàn)室守則不得違規(guī)操作，注意實(shí)驗(yàn)安全，安全使用各種 實(shí)驗(yàn)試劑。srap 分子標(biāo)記對(duì)百合的育種工作起到了很重要的作用，以基因工程技術(shù)為主 導(dǎo)的分子育種技術(shù)與傳統(tǒng)育種方法各有所長(zhǎng)，因此花卉分子育種與傳統(tǒng)育種方法必須緊 密結(jié)合，充分發(fā)揮兩者的長(zhǎng)處，以便加速新奇花卉品種選育的進(jìn)程。如可以將外源目的 基因通過(guò)基因工程手段先導(dǎo)入少數(shù)優(yōu)良品種中，然后再通過(guò)雜交育種方法將目的基因?qū)?入其它品種或親緣關(guān)系較近花卉中，進(jìn)而擴(kuò)大育種規(guī)模。有要求才有進(jìn)步，所以在試驗(yàn) 中要不斷創(chuàng)新，大

44、膽假設(shè)小心求證，為我國(guó)的花卉育種工作做出貢獻(xiàn)。長(zhǎng)期以來(lái)，形態(tài) 特征一直是百合屬植物分類(lèi)的主要依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)的的 srap 鑒定得到的數(shù)據(jù)和已有的形 態(tài)分類(lèi)結(jié)果大致吻合，為植物分類(lèi)多了一種依據(jù)。本研究為百合雜交后代真實(shí)性鑒定提 供 dna 分子證據(jù)，從而提高選育效率，降低育種成本。 由于本次實(shí)驗(yàn)系本科畢業(yè)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不盡完善，如有機(jī)會(huì)將進(jìn)一步做深入研究， 應(yīng)用分子標(biāo)記進(jìn)行植物的分類(lèi)及親緣關(guān)系分析，可以在分子水平上闡明生物系統(tǒng)演化及 分類(lèi)情況，也直接關(guān)系到育種親本的選配和種質(zhì)資源的合理有效利用。分子標(biāo)記廣泛存 在于基因組的各個(gè)區(qū)域，通過(guò)對(duì)隨機(jī)分布于整個(gè)基因組的分子標(biāo)記的多態(tài)性進(jìn)行比較， 就能夠全面

45、評(píng)估研究對(duì)象的多樣性，并揭示其遺傳本質(zhì)。利用遺傳多樣性的結(jié)果可以 對(duì)物種進(jìn)行聚類(lèi)分析，進(jìn)而了解其系統(tǒng)發(fā)育與親緣關(guān)系。分子標(biāo)記的發(fā)展為研究物種 親緣關(guān)系和系統(tǒng)分類(lèi)提供了有力的手段。 致謝 本文是在導(dǎo)師席夢(mèng)利教授的悉心指導(dǎo)下完成的。從論文的選題、研究方 法的確立及論文的寫(xiě)作，席老師均給予了精心指導(dǎo)，使我受益匪淺。導(dǎo)師深 厚的專(zhuān)業(yè)功底，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度，高效的工作作風(fēng)，豁達(dá)謙虛的處世風(fēng)范， 為我今后的學(xué)習(xí)生活樹(shù)立了榜樣，讓我終生受益，在此謹(jǐn)向席老師表示最衷 心的感謝。 論文工作的順利完成還得益于丁信譽(yù)師兄給予的熱情幫助，從而使試驗(yàn) 設(shè)計(jì)方案更為完善、研究工作頗為順利。 至此論文撰寫(xiě)完全完成之際，謹(jǐn)向所

46、有關(guān)心、支持和幫助我的老師、同 學(xué)和朋友致以誠(chéng)摯的謝意和美好的祝福！ 作者：周明杰 2012 年 5 月于南京 參考文獻(xiàn) 1汪發(fā)瓚,唐進(jìn).中國(guó)植物志十四卷:百合科(一)m.1980,北京:科學(xué)出版社. 2龍雅宜,張金政.百合屬植物資源的保護(hù)與利用j.植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào) 1998,7(1):40-44. 3趙祥云,王樹(shù)棟,陳新霞.百合m.2000，北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社 4吳祝華,施季森,池堅(jiān),等.百合資源與育種研究進(jìn)展j.南京林業(yè)大學(xué)報(bào),2006,30(2): 113-338. 5吳祝華,施季森,席夢(mèng)利,等.百合種質(zhì)資源花粉形態(tài)及親緣關(guān)系研究j.浙江林學(xué)院報(bào), 2007,24(4): 406-412. 6鄧明文,吳祝華,席夢(mèng)利,等岷江百合 issr-pcr 反應(yīng)體系優(yōu)化j.林