血液學(xué)及檢驗(yàn)試驗(yàn)教學(xué)筆記(20210316004400)

1、實(shí)驗(yàn)十三自溶+糾正、高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)、Coomb s試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一自身溶血試驗(yàn)及其糾正試驗(yàn)autohemolysis test and correcti ng test【目的】 掌握自溶+糾正、高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)、Coo mb s試驗(yàn)的RBC孵RBC因耗能，體積增大而破宅1.原理：方法及結(jié)果判斷及臨床應(yīng)用正常人有輕微的溶HS、非遺傳性球形RBC溶血性貧血，自身溶血孵 RBC能；RBC 供應(yīng)正常“自身溶血不同程度糾葡萄糖、2. 器材和試劑：(1) 無菌 0.556mol/L ( 100g/l )葡萄糖液(2) 無菌N.S(3) 1g/l肝素水溶液(4) 氰化高鐵Hb轉(zhuǎn)化液(5) 無菌小瓶(5m

2、l)，內(nèi)加0.3ml肝素，50C烘干滅菌(6) 無菌注射器和吸管3. 步驟和方法(1) 試管中加葡萄糖 20mg 109mol/L枸櫞酸鈉液0.2ml，血1.8ml(2) 125g離心5min,調(diào)血細(xì)胞：血漿為1： 1。(3) 取抗凝血1ml，加亞硝酸鈉葡萄糖混合液和亞甲藍(lán)各0.5ml， 混勻，37C水浴3h。(4) 取血0.1ml，加磷酸鹽緩沖液10ml，2min后，635nm比色得吸 光度為SA(5) 用未加亞硝酸鈉葡萄糖血，做上步試驗(yàn)，得吸光度為Bo1J. I6-彳3I取 0.1ml+9.9mlHb血漿 0.2ml+4.8mlHb轉(zhuǎn)化液轉(zhuǎn)化液540nm比色，計(jì)算溶血率1 RBC 比容 1

3、 I=X測(cè)定管讀數(shù)X 100未保溫全血管讀數(shù)X 4(% )注：未保溫全血管稀釋100倍，測(cè)定管稀釋25倍，故乘以4。4. 臨床意義：正常人：應(yīng)75%雜合子：多在7431%純合子：多V 30%5. 注意事項(xiàng)：RBC比積V 30%寸，還原率顯著下降，故需調(diào)整血細(xì)胞和血漿比。 以ACD乍抗凝劑時(shí)，其與血液之比為1： 9,過量則pH下降。一般要求St比B大8倍以上。不穩(wěn)定Hb易被氧化造成假陽性。(2)幾種溶血性疾病的結(jié)果:疾病NaCI葡萄糖ATPHS明顯糾正明顯糾正G-6-PD缺乏正常or稍f部分糾正部分糾正HK缺乏稍f糾正糾正不穩(wěn)定Hb病稍f糾正糾正PK缺乏fff不糾正明顯糾正AIHA伴球形 RBC

4、增多f不定明顯糾正實(shí)驗(yàn)二高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)methemogob in reducti on test MHb-RT1. 原理：當(dāng)RBC內(nèi)G6PD含量正常時(shí)，由磷酸戊糖代謝途徑生成的NADPH可作為MHb的還原酶的輔酶，在美藍(lán)的參與下，MHb被還原成Hb=如G6PD缺乏，還原速度減慢，或不能還原。通過測(cè)定還原速度間接反應(yīng)G6PD勺活性。Hb ( Fe2+ )亞硝酸鈉戶 MHb ( Fe3+ 廠+ Hb (Fe2+ )H美藍(lán)2. 器材與試劑(1) 亞硝酸鈉和葡萄糖混合液(2) 亞甲藍(lán)(3) 磷酸鹽緩沖液3. 方法及計(jì)算：(1) 試管中加葡萄糖20mg 109mol/L枸櫞酸鈉液0.2ml，血1.

5、8ml。125g離心5min,調(diào)血細(xì)胞：血漿為1： 1。(2) 取抗凝血1ml，加亞硝酸鈉葡萄糖混合液和亞甲藍(lán)各0.5ml，混勻,37C水浴3h(3) 取血0.1ml，加磷酸鹽緩沖液10ml, 2min后，635nm比色得吸光度為SA(4) 用未加亞硝酸鈉葡萄糖血，做上步試驗(yàn)，得吸光度為B。4. 參考值：正常人：應(yīng)75%雜合子：多在 7431%純合子：多V 30%5. 注意事項(xiàng)：RBC比積V 30%寸，還原率顯著下降，故需調(diào)整血細(xì)胞和血漿比。以ACD乍抗凝劑時(shí)，其與血液之比為1： 9,過量則pH下降。 一般要求St比B大8倍以上。不穩(wěn)定Hb易被氧化造成假陽性。3. 臨床意義：設(shè)問實(shí)驗(yàn)三抗人球蛋

6、白試驗(yàn) Coombs test1. 原理：不完全抗體(IgG)在鹽水介質(zhì)中不能使 RBC凝集，只附著在RBC 上(致敏RBC，此種抗體是人類球蛋白，如果用家兔抗人球蛋白加入，可 使致敏RBC發(fā)生凝集。用于檢測(cè)體內(nèi)不完全抗體的試驗(yàn)。有間重接和直接試驗(yàn) 兩種。2. 方法與步驟間接抗人球蛋白試驗(yàn)：檢查血清中的不完全抗體D-RBC待檢血清致敏RBC抗人球蛋白R(shí)BC凝集管號(hào)PDd待測(cè)患者血清2滴10%：D-RBC1滴1滴抗D血清1滴1滴10%Od- RBC1滴混勻，37C水育1h, 810倍生理鹽水洗滌 3次以上，留壓積 RBC加抗人球蛋白血清 滴，轉(zhuǎn)動(dòng)試管混勻，觀察結(jié)果。P管凝集：血清中含有不完全抗體

7、。如檢查孕婦血清中有無不完全抗體。直接抗人球蛋白試驗(yàn)：檢查RBC上的不完全抗體RBC凝集RBC上有無來自母體的抗體。直接抗人球蛋白試驗(yàn):已致敏RBC抗人球蛋白臨床意義：C上含有不完全抗體。如檢測(cè)新生兒臍血實(shí)驗(yàn)小結(jié)：實(shí)驗(yàn)十四 血小板功能試驗(yàn)，PF3aT試驗(yàn)檢測(cè)一、血小板粘附試驗(yàn)(platelet adhension test，PAdT )常用方法：玻球法、玻璃濾器法、玻柱法BPL原理BPL可粘附于帶負(fù)電荷的非生理性物質(zhì)表面如金屬、玻璃等血液在 特制的玻球內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)，BPL可粘附于玻璃球內(nèi)表面一故血液在玻球內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)后 數(shù)比較轉(zhuǎn)動(dòng)前后血液中BPL數(shù)可了解BPL粘附功能。器材、試劑玻球、轉(zhuǎn)動(dòng)裝置、顯微鏡、牛

8、鮑計(jì)數(shù)板、枸櫞酸鹽抗凝劑、血 小板稀釋液等。操作1 .取血1.8ml + 0.2ml枸櫞酸加入玻球旋轉(zhuǎn) 3rpm/min x 15min2 計(jì)數(shù)粘附前后血小板數(shù)，算出粘附率。臨床意義1、PAdT增高：見于血栓前狀態(tài)和血栓性疾病。2、PAdT減低：見于血管性血友病、巨大 BPL綜合征、BPL無力癥、尿毒癥、異 常蛋白血癥、MDS AL等。參考值45.34% 79.78%、血小板聚集試驗(yàn)(platelet aggregation test ,PAgT光束原理透過的光PRP致聚劑致聚劑PRP光束記錄光濁度變化血小板聚集曲線器材、試劑血液凝聚儀、血小板聚集誘導(dǎo)劑：3.0卩mol/L腺苷二磷酸鈉鹽 (A

9、DP、腎上腺素、膠原、瑞斯托霉素、花生四烯酸。臨床意義1、增高：反映血小板聚集功能增強(qiáng)。見于血栓前狀態(tài)和血栓性疾病。2、減低：反映血小板聚集功能減低。見于血小板無力癥、貯存池病、尿毒癥、 肝硬化等。BPL聚集分析參數(shù)：2 A 4 A MA TMA T50% Dt(,PF3aT、血小板第 3 因子有效性檢測(cè)(platelet factor 3 acailability test記錄凝固時(shí)間原理PF3是凝血的重要成分；當(dāng) PF3缺乏時(shí)復(fù)鈣時(shí)間延長(zhǎng)。本試驗(yàn)是利用 正人和病人PRP血漿以及PPP血漿相互配合，以白陶土作為活化劑測(cè)定各組標(biāo) 本的RT比較各組差異而了解PF3有否缺陷。組別病人血漿mL正常人

10、血漿mL40%g/L白陶土懸 液(mL)PRPPPPPRPPPP10.10.10.220.10.10.230.10.10.240.10.10.2操作病 PRP1病 PPP2病 PPP3正 PPP4正PPP正 PRP病 PRP正 PRP忙_白陶土懸液臨床意義 超過5秒為PF3有效性減低見于：BPL第3因子缺陷癥、BPL無力癥、巨大BPL 綜合征等。參考值復(fù)鈣時(shí)間1組較2組延長(zhǎng)低于5秒四、實(shí)驗(yàn)小結(jié)：實(shí)驗(yàn)十五 PT、KPTT SCT XM因子篩選試驗(yàn)【目的】 掌握PT、KPTT SCT XM因子篩選試驗(yàn)的原理、方法及結(jié)果判斷。一、硅化的凝血時(shí)間測(cè)定（SCT【原理】 由于本法采用硅化的用品，硅管內(nèi)壁可

11、以阻止接觸活化過程，故硅管 法的凝血時(shí)間較普通試管法為長(zhǎng)?！酒鞑摹?mm直徑玻璃試管（硅化管），滅菌注射器（硅化），水浴箱，秒 表，碘酊棉球，乙醇棉球?！静僮鳌?. 準(zhǔn)備試管 取8mm直徑的硅化玻璃試管3支，編號(hào)為1、2、3,置于 37 r水浴箱中預(yù)溫3min。2. 采血并計(jì)時(shí) 常規(guī)靜脈采血3ml （自血液流入針頭，即開始計(jì)時(shí)），去 掉針頭后分別沿試管壁緩緩注入1ml血液于3支試管內(nèi)，置于37C水浴中。3. 間隔計(jì)時(shí)3min后每間隔0.5min，將第1支試管傾斜1次（傾斜30 度），直至血液凝固。再觀察第 2支試管，第2支試管血液凝固后再觀察第 3 支試管。第3支試管血液凝固時(shí)，立即停止計(jì)時(shí)。

12、4. 計(jì)算 計(jì)算從血液進(jìn)入針頭到第 3支試管血液凝固所需要的時(shí)間，即 凝血時(shí)間?！咀⒁馐马?xiàng)】 硅管法的注意事項(xiàng)與試管法相同?！緟⒖贾怠?532min。二、血漿凝血酶原時(shí)間測(cè)定（PT）【原理】 在受檢血漿中加入足量的凝血活酶和鈣離子，測(cè)定血漿凝固的時(shí)間， 即為血漿凝血酶原時(shí)間（prothromb in time , PT ）。本試驗(yàn)是外源性凝血系 統(tǒng)常用的篩檢試驗(yàn)?！酒鞑摹?水浴箱，滅菌注射器，硅化試管或塑料管，離心機(jī)，秒表，碘酊棉球，乙醇棉球。【試劑】1. 25mmol/L氯化鈣凝血活酶試劑。商品試劑，用前按要求用蒸餾水溶解 混勻。2 .正常人凍干混合血漿。多為商品試劑，用25個(gè)以上正常人血液

13、經(jīng)109mmol/L枸櫞酸鈉抗凝（血液與抗凝劑之比為9 : 1）, 3000r/min 離心10min,分離血漿后，混合分裝為每瓶1ml,凍干保存。3. 109mmol/L枸櫞酸鈉溶液?！静僮鳌?. 采血并分離血漿 常規(guī)靜脈采血1.8ml，加入含有109mmol/L枸櫞酸鈉 溶液0.2ml的硅化試管或塑料管中，充分混勻，3000r/min離心10min,分離血 漿。2 .平衡溫度將氯化鈣凝血活酶溶液和正常人混合凍干血漿置室溫中15mi n。3 .預(yù)溫 將氯化鈣凝血活酶溶液和正常人混合凍干血漿、待測(cè)血漿，置 37C水浴中預(yù)溫5min。4 .測(cè)定 取小試1支，加入正常人混合凍干血漿 0.1ml，3

14、7 T水浴預(yù)溫 30s，再加入預(yù)溫的25mmol/L氯化鈣凝血活酶溶液 0.2ml，混勻，立即啟動(dòng)秒 表計(jì)時(shí)。5. 計(jì)時(shí) 不斷地輕輕傾斜試管，觀察試管內(nèi)液體的流動(dòng)情況，當(dāng)液體流動(dòng)緩慢趨于停止時(shí)，終止計(jì)時(shí)，并記錄所需時(shí)間。重復(fù)測(cè)定23次，取其平均值。6. 測(cè)定待測(cè)血漿以同樣方法測(cè)定待測(cè)血漿的凝血酶原時(shí)間（重復(fù)23次測(cè)定，取其平均值）。7 .結(jié)果報(bào)告 以直接測(cè)定的時(shí)間（PT報(bào)告，同時(shí)，報(bào)告正?；旌蟽?干血漿PT。以PT比值（PTR報(bào)告，PTR待測(cè)血漿PT/正常人混合凍干血漿 PT。以國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）報(bào)告，INR=PTR （ISI為氯化鈣凝血活酶試劑 國(guó)際敏感指數(shù)）?！咀⒁馐马?xiàng)】1 所用試管

15、必須潔凈、干燥、無劃痕。2 .采血要順利，血液與抗凝劑比例（9 : 1）要準(zhǔn)確?？鼓浞?，充分 混勻，決不能有血凝塊。3. 采血后宜在1h內(nèi)完成測(cè)定，4C冰箱內(nèi)保存不應(yīng)超過 4h, 20C下可 保存14d， 70C下可保存6個(gè)月。4 .先測(cè)定正常人混合凍干血漿的凝血酶原時(shí)間，其結(jié)果在正常允許范圍 內(nèi)后才能測(cè)定待測(cè)血漿。5. 水浴溫度要控制在（37.0 0.5 ）C,溫度過高或過低都可影響測(cè)定結(jié) 果。6. 血細(xì)胞比容（Het）小于0.2或大于0.5時(shí)，抗凝劑的用量應(yīng)做調(diào)整。 抗凝劑（ml） = （100 Het）x血液（ml）x 0.00185。7 .由于每次使用的氯化鈣凝血活酶活性不盡相同，

16、測(cè)定的條件也略變 動(dòng)，故每次測(cè)定均需有正常對(duì)照。8.氯化鈣凝血活酶必須注明國(guó)際敏感指數(shù)（ISI ）。【參考值】PT: 1113s （超過正常對(duì)照 3s有意義）。PTR 0.851.15。 INR: 0.8 1.5。三、活化部分凝血活酶時(shí)間測(cè)定【原理】 在37 r條件下，以白陶土（激活劑）激活幻、劉因子，以腦磷脂（部分凝血活酶）代替血小板第 3因子，在參與下，測(cè)定血漿凝固所需的 時(shí)間。本試驗(yàn)是內(nèi)源性凝血系統(tǒng)靈敏和常用的篩檢試驗(yàn)?！酒鞑摹?水浴箱，滅菌注射器，硅化玻璃試管或塑料管，離心機(jī)，秒表，碘酊 棉球，乙醇棉球。【試劑】1. 109mmol/L枸櫞酸鈉溶液。2. APTT試劑（含白陶土或鞣酸及

17、腦磷脂）液體試劑混勻后可直接使用， 凍干試劑需用蒸餾水溶解再使用。3. 25mmol/L氯化鈣溶液。4 .正常人混合凍干血漿多為商品試劑，用25個(gè)以上正常人血漿經(jīng)109mmol/L枸櫞酸鈉溶液抗凝（血液與抗凝劑之比為9 ： 1），3000r/min離心10min,分離血漿后，混合分裝為每瓶1ml,凍干保存。【操作】1. 采血并分離血漿 常規(guī)靜脈采血1.8ml，加入含有109mmol/L枸櫞酸鈉 溶液0.2ml的硅化試管或塑料管中，充分混勻，3000r/min離心10min,分離血 漿。2. 平衡溫度 用蒸餾水溶解正常人混合凍干血漿，于室溫下靜置15 min 以上，充分混勻。3 .預(yù)溫活化 于試

18、管中加入正常人凍干血漿和APTT試劑各0.1ml，混勻，37C水浴中預(yù)溫3 min，預(yù)溫過程中，輕輕振搖數(shù)次。4. 加鈣計(jì)時(shí) 于試管中加入預(yù)溫至37E的25mmol/L氯化鈣溶液0.1ml， 混勻，并立即計(jì)時(shí)，置水浴中不斷振搖。20s后，不時(shí)地緩慢傾斜試管，觀察 試管內(nèi)液體的流動(dòng)狀態(tài)，當(dāng)液體停止流動(dòng)時(shí)停止計(jì)時(shí)，記錄時(shí)間，重復(fù)檢測(cè)23次，取平均值。5. 測(cè)定待測(cè)血漿 以同樣方法測(cè)定待檢血漿的 APTT（重復(fù)測(cè)定23 次, 取平均值）?！咀⒁馐马?xiàng)】1. 采血要順利，血液與抗凝劑要充分混勻。2. 采血后應(yīng)盡快檢測(cè)，最遲不應(yīng)超過2h。被檢血漿放置過久，凝固時(shí)間 有縮短的傾向。3. 血漿加APTT式劑后預(yù)溫時(shí)間不得少于 3min。4. 血液離心速度要達(dá)到 3 000r/min，時(shí)間為10min,以便盡可能除去血 小板。5. 活化劑因規(guī)格不一，其致活能力不同，因此參考值有差異。如果正常 人混合凍干血漿APTT明顯延長(zhǎng)，則提示APTT試劑質(zhì)量不佳。6. 檢測(cè)前應(yīng)先測(cè)定正常人混合血漿，如果其APTT在允許范圍內(nèi)方能測(cè)定 待檢標(biāo)本。否則，應(yīng)重新配制 APTT試劑。【參考值】25.0735.