臨床微生物實(shí)用手冊(cè)

1、臨床微生物實(shí)用手冊(cè)（內(nèi)部資料）試劑配制1、革蘭氏染液甲液：結(jié)晶紫：1.25g 95酒精：50ml dh2o：450ml乙液：na2co3：6.25g dh2o：500ml堿性碘液：i2：6.0g ki：12.0g naoh（1mol/l）：270ml 待ki完全溶于dh2o，后，再加i2丙酮酒精液： 95酒精：70ml 丙酮： 30ml堿性復(fù)紅水溶液： 堿性復(fù)紅：8g 95%酒精：100l dh2o：900m2、抗酸染液（萋尼）1石炭酸復(fù)紅染液：（1）儲(chǔ)存液 堿性復(fù)紅液：堿性復(fù)紅8g，加95%乙醇至100ml，充分振蕩使復(fù)紅溶解。 5%石炭酸水溶液：4050水浴加熱石炭酸使之融解，取液態(tài)石炭酸

2、5g 溶于90ml熱蒸餾水中，待溶液冷卻至室溫時(shí)，補(bǔ)充蒸餾水至100ml。（2）石炭酸復(fù)紅工作液：經(jīng)定性濾紙過(guò)濾的堿性復(fù)紅儲(chǔ)存液10ml 與5%石炭酸水溶液90ml充分振蕩、混合均勻后，用定性濾紙過(guò)濾。25%鹽酸乙醇脫色液：35%濃鹽酸5ml 與95%乙醇95ml 混合。3亞甲藍(lán)復(fù)染液：（1）儲(chǔ)存液：亞甲藍(lán)0.3g 溶于95%乙醇50ml 中，完全溶解后加蒸餾水至終體積100ml。（2）亞甲藍(lán)復(fù)染液：以蒸餾水5 倍稀釋0.3%亞甲藍(lán)儲(chǔ)存液，經(jīng)充分振蕩、混合均勻后，亞甲藍(lán)的終濃度為0.06%，使用定性濾紙過(guò)濾，即得亞甲藍(lán)染液。3、甲基紅試劑甲基紅：0.2g 95酒精：300ml dh2o：200

3、ml配制：將甲基紅稱入乳缽內(nèi)，加1mol/l naoh 10ml左右（提高甲基紅溶解度），碾磨，加入酒精300ml dh2o 180ml，混勻后，再加入1 mol/l hcl 10ml左右，中和其中的naoh，最后試劑弱帶酸性4、靛基質(zhì)試劑 對(duì)二甲氨基苯甲醛:5.0g 純戊醇或正丁醇:75ml 濃鹽酸:25ml配制：濃鹽酸要待對(duì)二甲氨基苯甲醛溶解于純戊醇后，再一滴滴徐徐加入5、伏波（vp）試劑甲液：a萘酚：6.0g 無(wú)水乙醇： 100ml 乙液：koh：40g 肌酸：0.3g dh2o: 100ml注：甲液應(yīng)儲(chǔ)存于棕色瓶中5、100g/l去氧膽酸鈉溶液 去氧膽酸鈉：5g 0.1 mol/l n

4、aoh：5ml 溶解后加dh2o 45ml于冰箱可保存半月有效。6、氧化酶，細(xì)胞色素氧化酶10g/l鹽酸二甲基對(duì)苯二胺（或）四甲基對(duì)苯二胺）水溶液10g/l a萘酚乙醇液7、硝酸鹽還原試劑甲液：對(duì)氨基苯磺酸：0.8g 5mol/l醋酸：100ml乙液： a萘胺：0.5g 5mol/l醋酸：100ml8、6g/l酚紅指示劑酚紅：3g 1mol/l naoh：10ml 1mol/l hcl：10ml dh2o：480ml配制：將酚紅放入乳缽內(nèi)加naoh研磨，加dh2o 280ml，無(wú)水乙醇200ml混勻后，加入hcl混勻。配好后液體應(yīng)為透明橙紅色。染色1、革蘭氏染色法試劑：結(jié)晶紫 碳酸鈉溶液 堿性

5、碘液 丙酮酸酒精堿性復(fù)紅水溶液方法：1.將標(biāo)本均勻涂布于潔凈玻片上，自然干燥，火焰微熱固定2.滴加結(jié)晶紫（革蘭甲液）和碳酸鈉液（革蘭乙液）各2滴，初染30秒鐘，水洗。3.用堿性碘液2滴固定30秒鐘，水洗4.用丙酮酸酒精脫色至無(wú)蘭色脫落為止（約510秒），水洗。5.用堿性復(fù)紅水溶液復(fù)染5秒鐘，水洗待干鏡檢。結(jié)果：革蘭氏染色陰性細(xì)菌在視野下呈淡紅色。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌呈深紫色注意事項(xiàng)：1.涂片應(yīng)均勻，厚薄適宜，應(yīng)自然干燥后再加微熱固定。以熱而不燙手為易，過(guò)熱易使細(xì)菌變形。2.脫色要至無(wú)蘭色脫落為止。3.復(fù)染時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，以免細(xì)菌均染成g菌。4.枯草桿菌，鏈球菌有時(shí)染成紫紅色，是因?yàn)榧?xì)菌繁殖代謝中有紫色

6、嗜變性，不一定全是染色原因，所以要根據(jù)其菌體形態(tài)加以確定。2、抗酸桿菌染色試劑：石碳酸復(fù)紅溶液 鹽酸酒精溶液 堿性美蘭溶液方法：1.加滿石碳酸復(fù)紅溶液在已固定德標(biāo)本玻片上，加溫23分鐘，使染液即有蒸汽上升又不致沸騰，不時(shí)添加染液，以免在受熱情況下干凅。2.傾出染液，以dh2o沖洗后用鹽酸酒精溶液脫色，直至玻片無(wú)紅色為止。3.dh2o沖洗，用堿性美蘭復(fù)染1分鐘。4.dh2o沖洗，待干鏡檢。結(jié)果：抗酸桿菌被染成紅色，背景為蘭色。結(jié)核、麻風(fēng)桿菌為抗酸陽(yáng)性（奴卡菌及放線菌可呈弱抗酸性）3、龐氏染色法試劑：龐氏染液方法：涂片經(jīng)自然干燥后經(jīng)火焰固定，滴加龐氏染液2滴，靜染35分鐘后，水洗，待干鏡檢。結(jié)果：

7、雙級(jí)體桿菌菌體呈淡蘭色兩端級(jí)體呈深紫蘭色報(bào)告：查見(jiàn)雙級(jí)體桿菌或未查見(jiàn)白喉?xiàng)U菌4、墨汁染色查新型隱球菌試劑：優(yōu)質(zhì)印度墨汁方法：取一滴優(yōu)質(zhì)印度墨汁或國(guó)產(chǎn)優(yōu)質(zhì)墨汁于潔凈載玻片上，加入待檢標(biāo)本（液體標(biāo)本需離心后取沉淀）一滴，與之混合，加蓋玻片于底倍鏡下，將出光調(diào)暗，觀察菌體及其周圍莢膜。陰性結(jié)果：在高倍鏡下可見(jiàn)黑色背景中透明寬厚的莢膜，似暈輪，有較厚的細(xì)胞膜，有時(shí)可見(jiàn)生芽的。內(nèi)有脂質(zhì)顆粒析出。注意：要與白細(xì)胞區(qū)別。白細(xì)胞無(wú)芽出現(xiàn)象、無(wú)莢膜、細(xì)胞壁薄、無(wú)脂質(zhì)顆粒析出。5、細(xì)菌細(xì)胞壁染色法用途：觀察細(xì)菌細(xì)胞壁是否缺損試劑：甲液：100g/l鞣酸水溶液 乙液：5g/l龍膽紫方法：用無(wú)菌生理鹽水涂片，將細(xì)菌均

8、勻涂布于玻片上，待其自然干燥后，滴加甲液固定15分鐘，水洗，滴加乙液染色3分鐘，水洗，自然干燥待檢。結(jié)果：有細(xì)胞壁的細(xì)菌，周邊染成紫色，內(nèi)部無(wú)色，缺壁細(xì)菌染料可進(jìn)入菌體，菌體被染成深紫色。注意事項(xiàng)：1.所用菌種必須是新分離所得菌2.涂片需自然干燥，切勿在火焰上固定6、鞭毛申云氏法（水法）試劑： 200g/l鞣酸 200g/l鉀明礬 1：12飽和石碳酸堿性復(fù)紅酒精液應(yīng)用液：取1，2，3，4液個(gè)2ml，2ml，5ml，1.5ml混勻,用濾紙過(guò)濾后備用方法：1.“訓(xùn)練”菌種：將菌種接種于軟瓊脂平皿中央（點(diǎn)種），37 24h后取平板邊緣擴(kuò)散菌，再轉(zhuǎn)軟瓊脂。反復(fù)幾次（視情況而定）。2.取一潔凈玻片，置于

9、桌面，墊高一端，是與桌面呈15o角左右，用潔凈滴管在玻片中央滴加一滴蒸餾水，用滴管順玻片將液滴摸成卵圓形。3.用接種環(huán)挑取一定量平板邊緣菌，輕輕乳化于玻片高的一端的液滴邊緣，讓其自然往下流動(dòng)5分鐘左右。4.輕輕將玻片放平，滴加與液滴同等量的應(yīng)用，染色5分鐘,用水沿一端（最好是從高的一端）輕輕沖洗，待干鏡檢。結(jié)果：菌體呈深紫紅色鞭毛呈淡紫紅色注意事項(xiàng)：1.所用應(yīng)用液必須新鮮配制，以配制后23天內(nèi)使用為宜。所用器皿，特別是玻片必須潔凈。2.所用代測(cè)菌應(yīng)使用多次反復(fù)轉(zhuǎn)種軟瓊脂后的新鮮菌種3.方法中3項(xiàng)的時(shí)間要嚴(yán)格掌握，此步的原理是用蒸餾水：這種低滲液滲入菌體內(nèi)，使菌體，鞭毛都發(fā)生不同程度的膨脹，時(shí)間

10、太長(zhǎng)菌體易裂正確選擇需要鑒定的細(xì)菌1、血培養(yǎng)：主要病原菌：沙門菌，布氏桿菌，其它革蘭陰性桿菌，金黃色葡萄球菌，肺炎鏈球菌，流感嗜血桿菌以下菌應(yīng)視為非致病菌（除非1次血培養(yǎng)分離出）：芽孢桿菌屬，凝固酶陰性葡萄球菌，草綠色鏈球菌，棒狀革蘭陽(yáng)性桿菌2、腦脊液培養(yǎng)：主要病原菌：b群溶血鏈球菌（新生兒），流感嗜血桿菌（2月-2歲兒童），肺炎鏈球菌，腦膜炎奈瑟氏菌3、咽部標(biāo)本培養(yǎng)（上呼吸道標(biāo)本）：主要病原菌：a群溶血鏈球菌選擇性報(bào)告：溶血隱秘桿菌咽炎中非致病菌：金黃色葡萄球菌，肺炎鏈球菌，流感嗜血桿菌，卡他莫拉菌，溶血鏈球菌，所有革蘭陰性桿菌，所有酵母菌4、痰標(biāo)本（下呼吸道標(biāo)本）主要病原菌：肺炎鏈球菌，克

11、雷伯菌屬，流感嗜血桿菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌非病原菌：酵母菌，草綠色鏈球菌，凝固酶陰性葡萄球菌5、尿培養(yǎng)主要病原菌：大腸埃希菌，變形桿菌，克雷伯菌，其它革蘭陰性桿菌，腸球菌，腐生葡萄球菌，純的金黃色葡萄球菌6、生殖道標(biāo)本培養(yǎng)：主要病原菌：淋病奈瑟菌，滴蟲(chóng)，酵母菌，女性細(xì)菌性陰道病綜合征，孕婦攜帶的b群溶血鏈球菌非病原菌：金黃色葡萄球菌，任何革蘭陰性桿菌（包括大腸桿菌，變形桿菌），b群溶血鏈球菌（僅為孕婦報(bào)告）生殖道標(biāo)本（女）：陰道高位拭子：酵母菌，陰道毛滴蟲(chóng)，細(xì)菌性陰道感染宮頸或?qū)m頸內(nèi)部：淋病奈瑟菌，沙眼衣原體，人乳頭瘤病毒肛門或直腸拭子：淋病奈瑟菌，b群鏈球菌（+陰道拭子）7、膿，吸

12、取物或組織標(biāo)本:主要病原菌：金黃色葡萄球菌，化膿性鏈球菌，其它溶血鏈球菌，銅綠假單胞菌，其它革蘭陰性桿菌非致病菌：凝固酶陰性葡萄球菌，少量棒狀革蘭陽(yáng)性桿菌8、抽吸物組織標(biāo)本的厭氧培養(yǎng)：主要病原菌：金黃色葡萄球菌，化膿性鏈球菌，其它溶血鏈球菌，銅綠假單胞，其它革蘭陰性桿菌，梭狀芽孢桿菌，梭菌屬，擬桿菌屬，其它厭氧菌非致病菌：凝固酶陰性葡萄球菌，少量棒狀革蘭陽(yáng)性桿菌9、糞便培養(yǎng)：主要病原菌：沙門菌，志賀菌，彎曲桿菌，霍亂弧菌，副溶血弧菌，產(chǎn)毒性大腸桿菌，難辨梭菌（常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)不出）常用的細(xì)菌鑒定鏈球菌科（鏈球菌屬和腸球菌屬）的鑒定索引 gpc（橢圓，呈雙、短鏈、長(zhǎng)鏈） 觸酶（-） 溶血 溶血 溶

13、血菌落、菌體特征 膽汁七葉苷 膽汁溶菌試驗(yàn) 桿菌肽 camp 七葉苷 - +optochin（5ug） s 黃色素 + 草鏈 d群 a鏈 馬尿酸鈉 膽汁七葉苷 6.5%nacls(溶菌,15) r +肺鏈 膽汁七葉苷 b鏈 + - + - - - d群 g鏈 腸球菌屬 d鏈 草綠鏈球菌群 d群 阿拉伯糖 甘露醇 山梨醇 乳糖 馬尿酸鈉 糞腸球菌 - + + + + 屎腸球菌 + + - + - 鳥(niǎo)腸球菌 - + + + - 堅(jiān)韌腸球菌 - - - + -微球菌科細(xì)菌的鑒定索引 gpc（圓形，呈葡萄、雙、四聯(lián)狀） + 觸酶 - 微球菌科 鏈球菌科菌落、菌體特征葡萄糖發(fā)酵 - + 四聯(lián)球菌 葡萄球

14、菌屬 玻片法血漿凝固酶 + - 金黃色葡萄球菌 試管法血漿凝固酶 甘露醇發(fā)酵 + - 新生霉素（16mm s） 尿素 麥芽糖發(fā)酵 表葡 腐葡 溶葡 新 s r s 尿 + + -麥 + + +特殊細(xì)菌特點(diǎn)：產(chǎn)單核李斯特菌：主要存在于腦脊液和血中的病原菌規(guī)則的革蘭陽(yáng)性桿菌，長(zhǎng)短不一，溶血但溶血環(huán)不超過(guò)菌落邊緣，觸酶陽(yáng)性，26有動(dòng)力，35無(wú)動(dòng)力芽孢桿菌屬：（主要病原菌：炭疽芽胞桿菌）規(guī)則革蘭陽(yáng)性桿菌&芽孢（不著色）可能炭疽芽胞桿菌：生長(zhǎng)迅速，不溶血，菌落粘在一起，無(wú)動(dòng)力傷寒沙門氏菌標(biāo)本采集：未使用抗生素前提下第一周分離陽(yáng)性血液90%糞便10%第三周分離陽(yáng)性血液50%糞便85%尿25%使用抗生素后：

15、骨髓，玫瑰疹藥物敏感性超廣譜-內(nèi)酰胺酶（esbls）：克雷伯菌屬，大腸艾希氏，特點(diǎn)：質(zhì)粒編碼，非邊界耐藥（青霉素類，頭孢菌素，氨曲南）；通常對(duì)抑制劑（棒酸、他巴唑、他唑巴坦）敏感。治療用藥：碳青酶烯、抑制劑復(fù)合類或頭霉素ampc -內(nèi)酰胺酶：腸桿菌屬，枸櫞酸桿菌屬，特點(diǎn)：染色體、質(zhì)粒編碼，誘導(dǎo)酶，非邊界耐藥（青霉素類，頭孢菌素1，2，3代，頭霉素）對(duì)抑制劑不敏感。治療用藥：碳青酶烯，頭孢4代抗生素：青霉素類抗生素天然青霉素：青霉素g 青霉素v 不產(chǎn)青霉素酶的g+球菌和g-球菌 耐青霉素酶青霉素：苯唑西林 氯唑西林 奈夫西林 氟氯西林 產(chǎn)青霉素酶的g+菌和g-球菌作用機(jī)制青霉素類抗生素作用于細(xì)胞

16、壁合成后階段的酶 阻斷肽聚糖合成的最后階段肽聚糖鏈的組裝和三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。 該階段由下面幾種酶催化完成： 轉(zhuǎn)糖基酶、轉(zhuǎn)肽酶、d-羧肽酶、內(nèi)肽酶 不同-內(nèi)酰胺類抗生素在不同程度上有抑制上述酶的作用頭孢菌素類抗生素第一代頭孢菌素：頭孢噻吩、頭孢唑啉等 對(duì)g+菌有較強(qiáng)作用 第二代頭孢菌素：頭孢呋辛、頭孢克洛等 對(duì)產(chǎn)-內(nèi)酰胺酶的g-桿菌有作用第三代頭孢菌素：頭孢噻肟、頭孢他啶等 對(duì)產(chǎn)-內(nèi)酰胺酶的g-桿菌有較強(qiáng)的作用第四代頭孢菌素：頭孢吡肟、頭孢匹羅等 對(duì)腸桿菌科細(xì)菌和銅綠假單孢菌作用強(qiáng)頭孢菌素類抗生素和青霉素結(jié)合蛋白結(jié)合,抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成。pbp位于質(zhì)膜，不同的頭孢菌素與不同的pbp結(jié)合，發(fā)生不同的

17、效應(yīng)，使菌形成絲狀體或球體，最終溶解死亡。其他-內(nèi)酰胺類抗生素單環(huán)-內(nèi)酰胺類抗生素：氨曲南 對(duì)g-桿菌作用強(qiáng)頭霉素類：頭孢西丁、頭孢替坦、頭孢美唑 對(duì)g+菌和產(chǎn)esbls有較好作用氧頭孢烯類：拉氧頭孢-氧頭孢烯類衍生物 對(duì)產(chǎn)-內(nèi)酰胺酶的g-桿菌有較強(qiáng)的作用，對(duì)產(chǎn)酶的金葡菌也有一定作用碳青霉烯類抗生素：亞胺培南、美洛培南等 對(duì)g-桿菌（除嗜麥芽窄食單胞菌外）有很強(qiáng)的活性-內(nèi)酰胺酶抑制劑- 與-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用能增強(qiáng)后者的抗菌活性克拉維酸 可從鏈霉菌培養(yǎng)液中分離得到舒巴坦 半合成的酶抑制劑他唑巴坦 半合成的酶抑制劑青霉素+ -內(nèi)酰胺酶抑制劑氨基糖苷類抗生素鏈霉素 、卡那霉素 、妥布霉素 、核糖霉

18、素 、巴龍霉素 、新霉素 慶大霉素 、福提霉素阿米卡星、奈替米星、 地貝卡星革蘭陰性桿菌有強(qiáng)大的抗菌活性 ；革蘭陰性球菌效果差；革蘭陽(yáng)性球菌有一定活性大觀霉素、丙大觀霉素：淋病奈瑟菌敏感，解脲脲原體敏感氨基糖苷類抗生素和細(xì)菌核糖體30s小亞基發(fā)生不可逆的結(jié)合，抑制mrna的轉(zhuǎn)錄和蛋白合成；造成遺傳密碼子的錯(cuò)讀，產(chǎn)生無(wú)意義的蛋白質(zhì)；吸附在菌體表面，造成細(xì)胞膜的損傷，導(dǎo)致膜的滲漏，胞內(nèi)的k+、腺嘌呤等物質(zhì)外漏。喹諾酮類抗生素第一代喹諾酮類抗生素：奈啶酸等 大腸桿菌有作用第二代喹諾酮類抗生素：環(huán)丙沙星、氧氟沙 星、諾氟沙星等 對(duì)g+菌和g-菌均有作用第三代喹諾酮類抗生素（超廣譜類抗生素）：左氧氟沙星

19、、司帕沙星等 對(duì)g+菌（如mrs、prsp、腸球菌）作用強(qiáng)于二代4-8倍作用機(jī)制 作用于dna旋轉(zhuǎn)酶,干擾細(xì)菌dna的修復(fù)和重組大環(huán)內(nèi)酯類抗生素常用的有：紅霉素、麥迪霉素等 主要用于g+菌，對(duì)苛養(yǎng)菌及厭養(yǎng)菌有作用，對(duì)衣原體、支原體、立克次體、螺旋體等有抑制作用新一代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素：阿齊霉素、羅紅霉素、克拉霉素、地紅霉素等 較紅霉素有更強(qiáng)的抗菌活性作用機(jī)制 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可逆結(jié)合在細(xì)菌核糖體50s大亞基的23s單位上,抑制肽?；D(zhuǎn)移酶,影響核蛋白位移,抑制細(xì)菌蛋白合成和肽鏈的延伸。四環(huán)素、氯霉素和林可酰胺類抗生素四環(huán)素類抗生素 廣譜抗生素 米諾環(huán)素 多西環(huán)素等 四環(huán)素類抗生素主要與細(xì)菌30s核糖體亞單位結(jié)合，阻滯氨?；D(zhuǎn)移rna與信使rna核蛋白體的受位位點(diǎn)的結(jié)合，阻滯肽鏈延伸，抑制蛋白質(zhì)合成。氯霉素類抗生素 易進(jìn)入腦組織 氯霉素 甲砜霉素 氯