醋酸菌的誘變育種及工藝條件的優(yōu)化

1、 大 學(xué) 畢 業(yè) 論 文 醋酸菌的誘變育種及工藝條件的優(yōu)化醋酸菌的誘變育種及工藝條件的優(yōu)化 breeding of acetic acid bacteria and the optimization of process conditions 2011 年 6 月 01 日 煙臺大學(xué) 醋酸菌的誘變育種及工藝條件的優(yōu)化醋酸菌的誘變育種及工藝條件的優(yōu)化 煙臺大學(xué)畢業(yè)論文任務(wù)書煙臺大學(xué)畢業(yè)論文任務(wù)書 院（系）：化學(xué)生物理工學(xué)院 姓名 畢業(yè)論文題目醋酸菌的誘變育種及工藝條件的優(yōu)化 指導(dǎo)教師 具體要求(主要內(nèi)容、基本要求、主要參考資料等)： 1）認(rèn)真查閱相關(guān)資料，弄清實驗?zāi)康?、意義，搞好整體設(shè)計 2）認(rèn)

2、真探索實驗方法，找出實驗的關(guān)鍵 3）熟練實驗操作技術(shù)，保證實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性 4）實驗數(shù)據(jù)真實可靠，文獻(xiàn)引用要合理，論文撰寫要規(guī)范 主要參考文獻(xiàn)： 1 馮 靜, 施慶珊, 歐陽友生, 陳儀本. 醋酸菌多相分類研究進(jìn)展. 微生物學(xué)通 報 sep 20, 2009, 36(9): 13901396. 2 m. ameyama, e.shinagawa, k.matsushita and adachi: agr.biol.chem, 2010, 48: 3099 進(jìn)度安排： 第 12 周：確定論文題目，布置文獻(xiàn)查閱相關(guān)事宜。閱讀、整理文獻(xiàn)，寫開題報 告。 第 34 周：進(jìn)入實驗室，熟悉環(huán)境、實驗儀器。

3、 第 512 周：預(yù)試驗。正式試驗，及整理實驗數(shù)據(jù)。 第 1314 周：論文初稿。 第 15 周：論文修改及定稿。 指導(dǎo)教師（簽字）： 年 月 日 院（系）意見： 教學(xué)院長（主任） （簽字）： 年 月 日 備注： 摘要 本實驗從陜西農(nóng)家醋醅和實驗室自制果醋中分離得到兩種菌種 a1和 b，以 其為出發(fā)菌種，進(jìn)行誘變以期得到高產(chǎn)酸量的菌株。結(jié)果表明：采用紫外誘變處理， 得到 a11和 b11菌株，分別比親株產(chǎn)酸量提高 18 %和 4.9 %。因起始酒精度、發(fā)酵溫 度、溶氧量（搖床轉(zhuǎn)速）對醋酸菌的發(fā)酵產(chǎn)量有較大的影響。故對 a11和 b11菌株進(jìn) 行單因素優(yōu)化，最終得到的最佳條件是： a11 ：初始

4、酒精含量 5 %、搖床轉(zhuǎn)速 150 r/min、發(fā)酵溫度 28； b11 ：初始酒精含量 6 %、搖床轉(zhuǎn)速 150 r/min、發(fā)酵溫度 30。 關(guān)鍵詞：醋酸菌；分離；紫外線（uv）誘變；單因素試驗 abstract: in this study, we got two kinds of strains, a1 and b, from shan xi peasant vinegar and laboratory fermented homemade fruit vinegar in the experiment. started by them as bacteria, we hope to

5、get strains that could make high yield on acid consumption. the results show that: we got a11 and b11 strains by the ultraviolet mutation processing, and their consumption of acid increased by 18% and 4.9 %. starting alcohol degrees, fermentation temperature and oxygen (the speed of the wave bed) ha

6、ve great influence on the acetic acid bacteria fermentation yields. we made single factor optimization on a11 and b11 strains, and we got the best condition is: a11: 5 % of the initial alcohol content, rotation speed 150 r/ min, fermentation temperature 28 ; b11: 6 % of the initial alcohol content,

7、rotation speed 150 r/min, fermentation temperature 30 . key words: acetic acid bacteria, separation, ultraviolet (uv) mutagenesis, single factor test 目目錄錄 1 前前 言言.1 1.1 概述.1 1.1.1 醋酸菌的簡介.1 1.1.2 醋酸菌的培養(yǎng)及保藏.1 1.2 誘變育種.1 1.2.1 物理誘變紫外線誘變.2 1.2.2化學(xué)誘變甲基磺酸乙酯(ems)誘變.2 1.3 醋酸菌生產(chǎn)性能的研究進(jìn)展.3 1.3.1 影響醋酸菌生長的生態(tài)因子.3

8、 1.3.2 生產(chǎn)性能的有關(guān)研究.3 1.4 果醋的營養(yǎng)保健功能.4 1.5 研究的目的和意義.4 1.6 課題創(chuàng)新點(diǎn).4 2 材料與方法材料與方法.5 2.1 主要材料.5 2.1.1 樣品.5 2.1.2 醋酸菌培養(yǎng)基.5 2.1.3 主要儀器設(shè)備.5 2.2 主要操作方法.5 2.2.1 醋酸菌的分離與純化.5 2.2.2 誘變方法.5 2.2.3 單因素試驗.6 2.2.4 醋酸菌的鑒定及檢測方法.7 2.2.5 醋酸菌的生長曲線.7 3 結(jié)果與分析結(jié)果與分析.8 3.1 醋酸菌原始菌株的篩選.8 3.1.1 分離篩選.8 3.1.2 醋酸菌菌株的定性鑒定.8 3.1.3 醋酸菌生長曲

9、線的繪制.10 3.2 誘變育種.11 3.2.1 紫外線誘變的菌株篩選.11 3.2.2 ems 誘變的結(jié)果篩選 .15 3.3 醋酸菌產(chǎn)酸量的影響因素.17 3.3.1 單因素試驗設(shè)計.17 3.3.2 單因素實驗設(shè)計檢驗.21 3.3.3 小結(jié).22 4 結(jié)結(jié) 論論.23 結(jié)論與展望結(jié)論與展望.24 參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn).25 致致 謝謝.26 1 前 言 1.1 概述 1.1.1 醋酸菌的簡介 醋酸菌是一大群革蘭氏染色陰性、嚴(yán)格好氧的細(xì)菌的總稱。醋酸菌最顯著的特征 是，在有氧條件下，能將乙醇氧化為乙酸(asia 屬除外)。在將乙醇氧化為乙酸后，大 部分醋酸菌還可進(jìn)一步將乙酸或乙酸鹽氧化為c

10、o2 和h2o1。根據(jù)能否將乙酸鹽和乳 酸鹽氧化為co2 和h2o 的能力及鞭毛類型，將醋酸菌分為醋桿菌（acetobacter）和 葡萄糖氧化桿菌（gluconbacter）2。醋酸菌具有多種形態(tài)特征，細(xì)胞從橢圓到桿狀， 單生、成對或成鏈排列。細(xì)胞大小為（0.8 m1.2 m） （1.5 m2.5 m） 。細(xì)胞運(yùn) 動或不運(yùn)動，若運(yùn)動則具有周生鞭毛或極生鞭毛這兩種類型鞭毛。專性好氧，是需氧 細(xì)菌的代表，其中一些能產(chǎn)生色素或纖維素36。 1.1.2 醋酸菌的培養(yǎng)及保藏 醋酸菌適宜的碳源是葡萄糖、果糖等六碳糖，其次是蔗糖和麥芽糖等，不能直接 利用淀粉、糊精等多糖類。酒精、甘油和乳酸是極其適宜的碳源

11、。培養(yǎng)醋酸菌的培養(yǎng) 基需要含糖和酵母膏(vb)，另外添加酒精以適應(yīng)代謝，加碳酸鈣以中和其代謝所生成 的醋酸，保證其繁殖的旺盛。常用培養(yǎng)方式有兩種：（1）原菌試管培養(yǎng)，是將培養(yǎng) 基做成試管斜面，接種后于30 32 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，保存于0 4 冰箱， 一般在半月內(nèi)傳代一次。 （2）三角瓶擴(kuò)大培養(yǎng)，是將液體培養(yǎng)基裝入三角瓶中，無菌 操作加入酒精，每只試管斜面接34瓶于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d 7 d，也可搖床培養(yǎng)24 h，一般測定酸度達(dá)到1.5 %2 %即成熟。 在食醋的生產(chǎn)中，醋酸菌菌種多半采用固體斜面的方式進(jìn)行保藏。但是用這種方 法保藏的醋酸菌退化快，生產(chǎn)性能也不穩(wěn)定7-9。因此可以將菌

12、種接入20 %甘油中， 用凍干管零下20 保藏，如此可以保藏約六個月，可以防止多次傳代引起的菌種退 化。 1.2 誘變育種 誘變育種是通過誘變劑處理菌株，是當(dāng)前菌種選育的一種重要方法10。提高菌 種的突變率，擴(kuò)大變異幅度，從中選出具有優(yōu)良特性的變異菌株。誘變育種和其他育 種方法比較，具有速度快、收效大、方法簡便等優(yōu)點(diǎn)，在生產(chǎn)中應(yīng)用極其廣泛。但是 誘發(fā)突變?nèi)狈Χㄏ蛐?1，因此誘發(fā)突變必須經(jīng)過大規(guī)模的篩選才能得到顯著的效果。 誘變育種技術(shù)包括兩個環(huán)節(jié)：一是以合適的誘變劑處理大量而分散的微生物細(xì)胞 懸浮液，在引起絕大多數(shù)細(xì)胞致死的同時，使個體在惡劣環(huán)境中的變異頻率大大提高； 二是設(shè)計一種有效的篩選方

13、法淘汰負(fù)向變異菌株，并把正變株中少數(shù)變異幅度最大的 具有優(yōu)良性狀的菌株巧妙地挑選出來12。可以說目前工業(yè)上所用的高產(chǎn)菌株大部分 都是通過這種方法獲得的，而且這種方法在抗生素菌種改良中仍是方便、經(jīng)濟(jì)有效的， 尤其適用于對那些遺傳背景、生物合成途徑還不甚清楚的抗生素產(chǎn)生菌；使用該法可 以阻斷不必要的酶活力，起到解除負(fù)調(diào)控、增加基因劑量的作用，不僅可使抗生素產(chǎn) 量得到提高，而且可能使其利用原材料的成本得到降低。 成功的誘變育種需要：1）處理可用于篩選的大的微生物群體；2）預(yù)期的特性突 變率高；3）可以用視力診斷或簡單測定鑒別突變的有效方法。 1.2.1 物理誘變紫外線誘變 物理因素中目前使用得最方便

14、且十分有效是紫外線，而其此種誘變方法有很多先 例，可以予以借鑒。用紫外線誘變醋酸菌，能使其產(chǎn)量有穩(wěn)定的提高13。 紫外線是波長 136390 nm 的短于紫外波長的射線，它是一種非電離輻射，能使 被照射物質(zhì)的分子或原子中的內(nèi)層電子提高能級躍遷到能量高的外層軌道（稱為激發(fā)） ，導(dǎo)致分子的理化變化。紫外線輻射最主要的則是引起 dna 形成嘧啶二聚體，他會 阻礙雙鏈的解鏈和復(fù)制，阻礙堿基的正常配對，從而導(dǎo)致基因突變14。它的遺傳效 應(yīng)主要是引起 gcat 的轉(zhuǎn)換或移碼突變。由于存在光復(fù)活作用，即白光照射能活 化光激活酶并將嘧啶二聚體解而使 dna 恢復(fù)正常，故輻照和處理后的培養(yǎng)應(yīng)避免可 見光照射（應(yīng)

15、在紅光下操作）15。 測定紫外光的劑量有直接法（以爾格/平方毫米表示絕對劑量）和間接法（以輻 照時間或致死率作為相對劑量）兩種。微生物所受射線的劑量決定于燈的功率、照射 距離和時間16。如果功率和距離是固定的話，則劑量就和照射的時間成正比，故照 射時間的長短可作為相對劑量。一般用 15w 的紫外燈，距離固定在 30 cm 左右，挑 選出致死率達(dá)到 90 %99.9 %所需的輻射時間進(jìn)行誘變處理。 但各類微生物所需的最適時間不同，一般營養(yǎng)體需要輻照 35 min，芽孢要 10 min，芽孢桿菌的營養(yǎng)體則要 13 min，革蘭氏陽性菌和無芽孢菌較易殺死，用 30 s， 放線菌的分生孢子用 30 s

16、2 min 17。 輔射同時要有電磁攪拌設(shè)備，以求照射均勻，尤其在菌液濃度較大或菌體、孢子 等較大而重時很容易在處理期間發(fā)生沉降，此時電磁攪拌更顯重要。照射前紫外燈宜 先開燈預(yù)熱 2030 min，使光波穩(wěn)定。 1.2.2化學(xué)誘變甲基磺酸乙酯(ems)誘變 ems，即甲基磺酸乙酯，是一種烷化劑，自 1953 年 kolmark 首次發(fā)現(xiàn) ems 的 誘變作用后，ems 便被廣泛地應(yīng)用于動物、植物和微生物育種中，并取得了顯著的 成果。但其尚未應(yīng)用于醋酸菌的誘變育種，故對其在此領(lǐng)域應(yīng)用的研究具有一定的科 研價值。 （1） ems 誘變育種原理 甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulpho

17、nate，簡稱 ems)，是一種改變 dna 結(jié)構(gòu)烷化劑， 對生物系統(tǒng)作用的重點(diǎn)主要是核酸，對修復(fù)酶的鈍化也有一定的作用它與 dna 中的 磷酸嘌呤、嘧啶作用，使之突變。主要原因是烷化劑具有一個或多個活性烷基，這些 烷基能被轉(zhuǎn)移到其他分子上置換氫原子，發(fā)生烷化作用。烷基化位點(diǎn)主要在 g(鳥嘌 呤)的 n7 位置上，由于上 n7 的烷基化，使之成為帶一個正電荷的季銨基團(tuán)。這個季 銨基團(tuán)產(chǎn)生兩個效應(yīng):一是促進(jìn)第一位氨基上氫解離。使 g 不再與 c 配對而與 t 配對， 從而造成 gc-at 轉(zhuǎn)換。二是 n7 成為季銨基團(tuán)后，減弱了 n9 位上的 n-糖苷鍵， 而產(chǎn)生了去嘌呤作用。大部分的無嘌呤位點(diǎn)

18、都可以被無嘌呤內(nèi)切酶系統(tǒng)所修復(fù)，但是 有時復(fù)制在修復(fù)之前進(jìn)行，則在無堿基位置上可以通過插入任何一個堿基，在第二輪 復(fù)制以后，則原來的 gc 對可以變?yōu)槿魏螇A基對 gc、cg、at、ta，既 有轉(zhuǎn)換，又有顛換。此外，它也可與核苷結(jié)構(gòu)的磷酸反應(yīng)，形成酯類而將核苷酸從磷 酸與糖分子之間切斷，產(chǎn)生染色體的缺失?？傊瑝A基熔化后易從 dna 鏈上裂解下 來，造成 dna 的堿基缺失及修補(bǔ)，從而引起突變18-20 。 （2） ems 誘變突變體的鑒定 目前常用的鑒定方法有：形態(tài)學(xué)方法、細(xì)胞學(xué)方法、誘變與離體培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合 方法、生理生化方法、現(xiàn)代分子生物學(xué)方法、遺傳學(xué)方法等21，特別是隨著分子生 物學(xué)的發(fā)

19、展，人們逐漸將從分子水平對變異體進(jìn)行早期鑒定，其中分子標(biāo)記輔助選擇 技術(shù)具有準(zhǔn)確、有效等優(yōu)點(diǎn)，從而減少了選擇群體和縮短育種時間。 （3）ems 誘變前景 在今后一段時期內(nèi)，如何提高誘變頻率和選擇效率仍是 ems 研究的關(guān)鍵問題，我 們在進(jìn)一步發(fā)揮誘變育種的特長與優(yōu)勢的同時，有必要從各個方面進(jìn)行深入研究誘發(fā) 突變的機(jī)理，以提高誘變頻率，并結(jié)合分子標(biāo)記及其它生物標(biāo)記技術(shù)，提高選擇效率。 1.3 醋酸菌生產(chǎn)性能的研究進(jìn)展 1.3.1 影響醋酸菌生長的生態(tài)因子 醋酸菌的生長需要適宜的生態(tài)環(huán)境，不同的生態(tài)環(huán)境，必將影響其正常的活動規(guī) 律及其代謝能力，影響醋酸菌生長的因素主要表現(xiàn)在以下幾個方面： （1）

20、溫度 溫度是醋酸菌代謝的主要調(diào)節(jié)因素，是醋酸菌生長繁殖和產(chǎn)酸的必要條件。醋酸 菌的最適生長溫度為 2537。但是微生物生長速度最快時的溫度未必是發(fā)酵積累 產(chǎn)物最多的溫度22。 （2） 初始酒精濃度 酒精是醋酸菌生長代謝所需能量的提供者，但較高的酒精濃度對醋酸菌的生命活 動有一定的抑制作用23，因此，在醋酸發(fā)酵過程中要根據(jù)醋酸菌耐酒精的能力，將 酒精濃度控制在一定的范圍內(nèi)。 （3） 溶氧量 醋酸菌為嚴(yán)格好氧微生物，只有在有氧的條件下才能生長。生產(chǎn)中只有通氣良好， 才能正常發(fā)酵。在含有較高濃度乙醇和醋酸的環(huán)境中，菌種對缺氧非常敏感，中斷供 氧會造成菌體死亡。 1.3.2 生產(chǎn)性能的有關(guān)研究 醋酸菌

21、只有在合適的條件下才能生長和發(fā)酵良好，故在人工培養(yǎng)醋酸菌時，要了 解菌種性能以控制合適的發(fā)育和發(fā)酵條件，取得較好的發(fā)酵效果。黃仲華等對所分離 出的優(yōu)勢醋酸菌進(jìn)行了耐乙醇能力、分解乙酸鹽能力、耐食鹽能力和耐高溫能力的試 驗研究；祖國仁、施安輝等對分離出的優(yōu)勢醋酸菌進(jìn)行了產(chǎn)酸速度、耐酒精度、耐溫 度、酒精轉(zhuǎn)化率等性能的試驗研究；國外用多種不同菌種混合發(fā)酵，不僅發(fā)酵速度加 快，還能形成其他有機(jī)酸與酯類物質(zhì)，增強(qiáng)了產(chǎn)品的香味和固形物成分。 1.4 果醋的營養(yǎng)保健功能 食醋含有豐富的有機(jī)酸、糖分、氨基酸、b 族維生素和水溶性鈣、磷、鐵、鋅、 等礦物質(zhì)，以及醇、醛、酚、酯等微量成分?，F(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)、醫(yī)藥學(xué)研究

22、表明，醋對人 體健康有很多益處24 水果中含有豐富的糖資源，是釀醋用的上等原料，與糧食醋相比，果醋的營養(yǎng)成 分更為豐富25。果醋中富含有機(jī)酸、醇、酷類等以及維生素、氨基酸和礦物質(zhì)，這 使得果醋具有豐富的營養(yǎng)價值，且有多種保健功能，如可預(yù)防高血壓、高血脂，促進(jìn) 血液循環(huán)、增強(qiáng)鈣質(zhì)吸收、延緩衰老、開胃消食等功效29。 1.5 研究的目的和意義 我國是水果生產(chǎn)大國，而且果醋及果醋飲料逐漸興起為第四代飲料產(chǎn)品，將有巨 大的市場發(fā)展?jié)摿?。但水果實際加工量很低，水果加工滯后于種植業(yè)的發(fā)展。開發(fā)高 質(zhì)量的果醋及果醋飲料，不但可以節(jié)約糧食，充分利用水果資源，還可以解決水果銷 路難的問題，增加果農(nóng)收入。同時，開

23、發(fā)高質(zhì)量的果醋及果醋飲料對提高我國水果資 源綜合利用價值，發(fā)展我國的水果加工業(yè)有一定的幫助。綜上總結(jié)則選育高產(chǎn)醋酸菌 為重中之重。 正如所有發(fā)酵工業(yè)主要是利用微生物的轉(zhuǎn)化作用一樣，食醋中微生物及其酶的作 用對發(fā)酵制品質(zhì)量及風(fēng)味也有重要的影響。總結(jié)目前食醋生產(chǎn)現(xiàn)狀，存在如下問題： (1) 菌種的產(chǎn)酸量不夠高，因此導(dǎo)致大生產(chǎn)過程中原料的損失較多，導(dǎo)致成本高； (2) 菌株發(fā)酵過程代謝產(chǎn)物過于單一，導(dǎo)致成品醋的口感不良； (3) 醋酸發(fā)酵條件的不確定，造成發(fā)酵浪費(fèi)。 故此，微生物高產(chǎn)菌種的選育及其優(yōu)良特性的充分發(fā)揮，對釀醋工業(yè)尤為關(guān)鍵。 傳統(tǒng)食醋釀造在漫長一個歷史時期，是利用自然界野生的有益微生物，

24、產(chǎn)品質(zhì)量高低 不一，質(zhì)量沒法保持穩(wěn)定 。因此設(shè)法提高醋酸菌的生產(chǎn)質(zhì)量是當(dāng)務(wù)之急。 1.6 課題創(chuàng)新點(diǎn) 傳統(tǒng)的誘變方式主要有亞硝酸誘變處理、吖啶橙誘變處理、5-溴尿嘧啶誘變處理、 2-氨基腺嘌呤誘變處理、鹽酸羥胺誘變處理及紫外線誘變處理等，都取得了不錯了效 果。本課題首先是采用了傳統(tǒng)的紫外誘變處理菌種，第二種誘變方法是采用了甲基磺 酸乙酯（ems）誘變育種，ems 誘變其他菌株如酵母菌或者植物如玉米等已有很多 先例，但是用于醋酸菌的誘變育種是首例，經(jīng)過對其他實驗的總結(jié)進(jìn)行醋酸菌的 ems 誘變的嘗試實驗設(shè)計，其誘變結(jié)果充分驗證了此種育種方法用于醋酸菌株的可 行性。 2 材料與方法 2.1 主要材

25、料 2.1.1 樣品 陜西農(nóng)家醋醋醅、實驗室自制果醋以及分離出的菌種 2.1.2 醋酸菌培養(yǎng)基 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：1 % 酵母粉，1 % 葡萄糖，ph 4.5，0.1 mpa 滅菌 20 min，使用前 加入 3 % （v/v）無水乙醇。 分離培養(yǎng)基：1 % 酵母粉，1 % 葡萄糖，1 % 碳酸鈣，1.5 % 瓊脂，ph 4.5，0.1 mpa 滅菌 20 min，使用前加入 3 % （v/v）無水乙醇，分裝制成 caco3平板分離培 養(yǎng)基。 斜面保藏培養(yǎng)基：1 % 酵母粉，1 % 葡萄糖，1 % 碳酸鈣，1.5 % 瓊脂，ph 4.5，0.1 mpa 滅菌 20 min，使用前加入 3 %（v/v

26、）無水乙醇，擺成斜面即為菌種保 藏培養(yǎng)基。 產(chǎn)酸實驗培養(yǎng)基：豆芽汁，1 % 葡萄糖，滅菌后加入 4 %（v/v）無水乙醇。 2.1.3 主要儀器設(shè)備 hzq-f160 振蕩培養(yǎng)箱 中國哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司 恒溫培養(yǎng)箱 上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司 d-ms-直流磁力攪拌器 天津市華興科學(xué)儀器廠 yc-260-l 醫(yī)用冷藏箱 ba200 生物顯微鏡 2.2 主要操作方法 2.2.1 醋酸菌的分離與純化 取 10 g 研磨好的曲樣，10 ml 果醋分別放入富集(基礎(chǔ))培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床培養(yǎng) 48 h，得到 10-1的稀釋液，10 倍梯度稀釋，取 10-3，10-4，10-5稀釋度的樣品稀釋液

27、涂 布于平板分離培養(yǎng)基上，每一稀釋度涂布三個平板，每個平板用 0.1 ml 稀釋液，涂 好后 300.5 倒置培養(yǎng) 48 h，挑取 hc 值（溶鈣圈與菌落直徑之比）較大，菌落豐 厚的單菌落。然后進(jìn)行劃線分離得到純種菌株，接種于斜面保藏培養(yǎng)基中，300.5 培養(yǎng) 24 h 后保藏于 4 冰箱備用。 2.2.2 誘變方法 2.2.2.1 紫外誘變 采用紫外線照射誘變的方法，對分離出的菌 a 和菌 b 進(jìn)行形狀改良。誘變篩選 流程如下： 始發(fā)菌株 活化 紫外線（uv）誘變處理 分離純化 初篩 復(fù)篩 菌種保 藏 誘變處理過程大致如下： （1）制備菌懸液：將培養(yǎng)好的斜面上的菌株用 5 ml0.85 %的

28、無菌生理鹽水洗下， 輕輕震蕩，使菌苔打散成乳白色懸濁狀，配成一定濃度（1108 cfu/ ml）的菌懸液， 將菌懸液注入無菌培養(yǎng)皿中，置于磁力攪拌器上，攪拌十分鐘，制成單細(xì)胞菌懸液。 （2）紫外誘變：取以上制備好的平皿置于超凈工作臺中，距紫外燈 30 cm 處，先不 打開皿蓋。紫外燈打開預(yù)熱 20 分鐘，以穩(wěn)定光波。然后打開皿蓋使菌液暴露在波長 為 253.7 nm，15 w 的紫外光下照射，磁力攪拌，力求使細(xì)胞均勻吸收紫外光波。采 用不同的照射時間（10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s） 。 （3）涂布分離：避光十倍稀釋涂布，用黑布包住培養(yǎng)26，防止回復(fù)突變，與同步培

29、養(yǎng)的野生型菌株進(jìn)行比較。 （4）制作致死率曲線：計算致死率(誘變后減少的菌落數(shù)誘變前的菌落數(shù)100 %)， 做出致死率-照射時間曲線。依據(jù)大量資料，醋酸桿菌在偏低誘變劑劑量（70 %80 % 致死率）的情況下發(fā)生正突變的幾率較高，故由圖均選擇 75 %致死率時的誘變劑劑 量進(jìn)行誘變。 （5）初篩：以最佳照射時間處理菌懸液，取 0.5 ml 進(jìn)行系列梯度稀釋，進(jìn)行平 板涂布后 300.5倒置培養(yǎng) 48 h。選擇 hc 值大的菌株進(jìn)行定性實驗。 （6）復(fù)篩：以標(biāo)準(zhǔn) naoh 滴定法測定總酸量，根據(jù)總酸量高低確定優(yōu)良菌種。 2.2.2.2 ems 誘變 采用化學(xué)試劑 ems 誘變方法，對分離出的菌

30、a 和菌 b 進(jìn)行形狀改良.誘變篩選 流程如下： 始發(fā)菌株 活化 甲基磺酸乙酯（ems）誘變處理 分離純化 初篩 復(fù) 篩 菌種保藏 誘變處理過程如下： （1）制備菌懸液：將培養(yǎng)好的斜面上的菌株用 5 ml0.85 %的無菌生理鹽水洗下， 輕輕震蕩，使菌苔打散成乳白色懸濁狀，配成一定濃度（1108 cfu/ ml）的菌懸液。 （2）ems 誘變處理：取等量菌懸液加入無菌離心管中，每管 2 ml，離心棄去上 清液后加入 2 ml ph7.0 的磷酸緩沖溶液。加入 40 l ems 原液,放入 300.5 搖床 培養(yǎng)，采用不同的反應(yīng)時間（10 min、20 min、30 min、40 min、50

31、min、60 min） ， 加入 2 ml 5 %硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)。 （3）涂布分離：離心棄去上清液并用無菌生理鹽水洗滌離心三次后稀釋涂布，培 養(yǎng)。與同步培養(yǎng)的野生型菌株進(jìn)行比較，計算致死率，作出致死率-照射時間曲線。 （4）初篩：溶鈣圈法，及醋酸菌的定性定量實驗。 （5）復(fù)篩：以標(biāo)準(zhǔn) naoh 滴定法測定總酸量，根據(jù)總酸量高低確定優(yōu)良菌種。 2.2.3 單因素試驗 (1) 溫度對醋酸產(chǎn)量的影響 分別向溫度為 25、28、30、32、35的產(chǎn)酸培養(yǎng)基中接入接種量為 5 % 的菌種，搖床培養(yǎng)，醋酸發(fā)酵結(jié)束測定其產(chǎn)酸量，并分析不同溫度對醋酸菌醋酸發(fā)酵 的影響。 (2) 溶氧量對醋酸產(chǎn)量的影響

32、 按照以確定溫度的優(yōu)化條件將醋酸菌按 5 %的接種量接入產(chǎn)酸培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速 為 120 r/min、130 r/min、140 r/min、150 r/min、160 r/min、170 r/min 下振蕩培養(yǎng)，醋 酸發(fā)酵結(jié)束測定其產(chǎn)酸量，并分析不同溶氧量對醋酸菌醋酸發(fā)酵的影響。 (3) 初始酒精度對醋酸產(chǎn)量的影響 按照以確定溫度和溶氧量的優(yōu)化條件，分別向初始酒精度為 3 %、4 %、5 %、6 %、7 %、8 %（v/v）的產(chǎn)酸培養(yǎng)基中接入菌種，搖床培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束測定其產(chǎn)酸量， 并分析不同酒度對醋酸菌醋酸發(fā)酵的影響。 2.2.4 醋酸菌的鑒定及檢測方法 2.2.4.1 鑒定方法 (一)采用

33、碳酸鈣平板，根據(jù)是否有透明圈產(chǎn)生來判斷是否產(chǎn)酸，分離出 hc 值較大的醋酸菌，然后進(jìn)行革蘭氏染色及定性實驗來具體確定是否為醋桿菌屬醋酸菌。 (二)革蘭氏染色：將上述試管斜面上的菌株連續(xù)活化 2 次，在第 2 次活化 24 h30 h 后，進(jìn)行革蘭氏染色，枯草芽孢桿菌作陽性對照、大腸桿菌作陰性對照。 (三)定性試驗：將上述斜面菌株活化 2 次，在第 2 次培養(yǎng) 48 h 后，接種于裝 有 10 ml 產(chǎn)酸試驗培養(yǎng)液的(18180) mm 的試管中（各接兩支） ，300.5 靜置培養(yǎng)， 培養(yǎng) 4 d 時各取出一支，3000 r/min 離心 5 min，除去菌體，用氫氧化鈉中和，加入 10 %氯化

34、鐵 23 滴，在火焰上煮沸，能形成紅褐色溶液者為產(chǎn)醋酸的菌株27。 2.2.4.2 檢測方法 酸度的測定：標(biāo)準(zhǔn) naoh 溶液滴定法28。 總酸的測定：酸堿滴定法29。 2.2.5 醋酸菌的生長曲線 菌株接種于產(chǎn)酸培養(yǎng)基中，30 120 r/min 振蕩培養(yǎng)，每天補(bǔ)加 1 %（v/v）無水 酒精，每天取樣用血球計數(shù)板進(jìn)行菌體計數(shù)，繪制醋酸菌的生長曲線，從而確定產(chǎn)酸 定量測定的時間，應(yīng)在對數(shù)中后期或穩(wěn)定前期進(jìn)行產(chǎn)酸量測定。 3 結(jié)果與分析 3.1 醋酸菌原始菌株的篩選 3.1.1 分離篩選 經(jīng)過對醋醅和果醋的富集培養(yǎng)、分離純化和篩選得到如下菌株，其形態(tài)特征見表 1 和表 2。 表表 1 醋醅中的

35、產(chǎn)酸菌形態(tài)醋醅中的產(chǎn)酸菌形態(tài) tab. 1vinegar grains in the form of acid bacteria 菌體形態(tài) morphology 菌落特征 colony characteristics 編號 number基本形態(tài) the basic form 形狀 shape 表面 surface 邊緣 edge 隆起形狀 bulge shape 顏色 color hc 值 hc value 1# 橢圓，對生 ellipse, opposite 斑點(diǎn) spotted 光滑 smooth 整齊 tidy 突起 convex 乳黃色 cream 41 2# 短桿，對生 short

36、iron, opposite 圓形 round 不光滑 not smooth 不整齊 irregular 突起 convex 白色 white 52 3# 橢圓，對生 ellipse, opposite 圓形 round 光滑 smooth 整齊 tidy 扁平 flat 乳白色 milky 3.92.7 4# 橢圓，對生 ellipse, opposite 缺刻 nick 不光滑 not smooth 不整齊 irregular 扁平 flat 乳白色 milky 5.65 表表 2 2自制果醋中產(chǎn)酸菌的形態(tài)自制果醋中產(chǎn)酸菌的形態(tài) tab.2the morphology of strains

37、 of vinegar made in laboratory 菌體形態(tài) morphology 固體培養(yǎng)菌落特征 colony characteristics of solid culture 編號 number 基本形態(tài) the basic form 形狀 shape 表面 surface 邊緣 edge 隆起形狀 bulge shape 顏色 color hc 值 hc value b 橢圓，對生 ellipse，opposit e 圓形 round 光滑 smooth 整齊 tidy 突起 convex 乳黃色 cream 2.81.2 3.1.2 醋酸菌菌株的定性鑒定 3.1.2.1 形

38、態(tài)特征 醋酸菌具有多種形態(tài)特征，細(xì)胞從橢圓形的到桿狀，單生的、成對或成鏈排列， 菌落特征為乳白色或乳黃色，圓形或斑點(diǎn)狀，表面濕潤，邊緣比較整齊。優(yōu)良的醋酸 菌產(chǎn)酸量較高，這可以通過溶解碳酸鈣產(chǎn)生的溶鈣圈的直徑與菌落直徑之比來判斷， 可以看出 1#、2#菌種的 hc 值比較大，即產(chǎn)酸量可能會比較大，其他兩種菌的 hc 值 比較小，但是 2#菌種菌落表面不光滑，不符合醋酸菌菌落特征。而且具體產(chǎn)酸量的 大小與 hc 值之比是否符合還有待驗證。 3.1.2.2 生理生化實驗 挑選出產(chǎn)透明圈的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，其染色結(jié)果如下各圖所示： 圖圖 1鏡檢結(jié)果鏡檢結(jié)果 1# 圖圖 2鏡檢結(jié)果鏡檢結(jié)果 2# f

39、ig.1microscopic exam result of 1# fig.2microscopic exam result of 2# 圖圖 3 鏡檢結(jié)果鏡檢結(jié)果 3# 圖圖 4鏡檢結(jié)果鏡檢結(jié)果 4# 圖圖 5鏡檢結(jié)果鏡檢結(jié)果 b fig.3 microscopicexam fig.4microscopic exam fig.5microscopic exam result of 3# result of 4# result of b 從圖 1 到圖 5 五個照片中可以看出：1#、2#、b 三株菌均為革蘭氏陰性菌，且形 狀為棒狀短桿菌或桿菌且都為對生的，與醋酸菌的特征相符。根據(jù)氧化葡萄糖生成

40、葡 糖酸能力的強(qiáng)弱，將醋酸菌分為葡糖桿菌屬和醋桿菌屬，定性實驗即從這兩種醋酸菌 中鑒別出醋桿菌屬醋酸菌。根據(jù)醋酸鐵溶液呈紅褐色這一現(xiàn)象可以區(qū)分。由圖 6、圖 7、圖 8 可以看出上述挑選的菌株只有 1#、b 兩種菌有紅褐色溶液產(chǎn)生。將 1#改標(biāo)記 為 a，即該實驗的結(jié)果為選育出 a、b 兩種醋酸菌。 b 圖圖 6 6 實驗結(jié)果實驗結(jié)果 1# 圖圖 7 定性實驗結(jié)果定性實驗結(jié)果 b fig.6 results of 1 # fig. 7results of 圖圖 8 實驗結(jié)果實驗結(jié)果 2# fig. 8 results of 2# 3.1.3 醋酸菌生長曲線的繪制 (1)用顯微鏡直接計數(shù)法測得的

41、菌 a 的生長曲線： 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 02468 圖圖 9菌菌 a 生長曲線生長曲線 fig.9the growth curve of a 時間/d log10(菌體數(shù)目) 由圖 9 可知，在開始的 1 d 內(nèi)，醋酸菌增長較緩慢，此時醋酸菌處于延遲期；從 第 2 d 開始醋酸菌數(shù)量激增，到第 4 d 醋酸菌數(shù)達(dá)到最大，這段時間內(nèi)醋酸菌處于對 數(shù)生長期；第 4 d 到第 5 d 醋酸菌數(shù)雖略有下降，但變化不大，此時醋酸菌處于穩(wěn)定 期；從第 5 d 起醋酸菌處于衰亡期，活菌數(shù)不斷下降。在穩(wěn)定前期（即第 4 d）滴定 測其產(chǎn)酸量為 27.42 g/l

42、。 (2) 用顯微鏡直接計數(shù)法測得的菌 b 的生長曲線： 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 051015 圖圖 10菌菌 b 的生長曲線的生長曲線 fig. 10the growth curve of b 由圖 10 可知，在開始的 1 d 內(nèi)，醋酸菌增長較緩慢，此時醋酸菌處于延遲期； 從第 2 d 開始醋酸菌數(shù)量激增，到第 8 d 醋酸菌的數(shù)目達(dá)到最大，這段時間內(nèi)醋酸菌 處于對數(shù)生長期；第 8 d 到第 12 d 醋酸菌的數(shù)目雖略有下降，但變化不大，此時醋酸 菌處于穩(wěn)定期；從第 12 d 起醋酸菌處于衰亡期，活菌數(shù)不斷下降。在穩(wěn)定前期（即 第 8 d）滴定測其產(chǎn)

43、酸量為 64.65 g/l。 3.2 誘變育種 3.2.1 紫外線誘變的菌株篩選 3.2.1.1 紫外線誘變致死率曲線及最佳誘變時間的確定 菌種 a 的致死率-照射時間曲線如下圖所示： log10(菌體數(shù)目) 時間/d 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 020406080 圖圖 11紫外誘變對紫外誘變對 a 菌致死率的影響菌致死率的影響 fig.11the death rate of a by using uv mutagenesis 由圖 11 可以看出，在 13 s 的時菌 a 的致死率達(dá)到 75 %，因此選定 13 s 為最佳 誘變時間。 用同樣的方法對菌 b 進(jìn)行紫外誘變

44、，致死率-照射時間曲線如下圖： 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 020406080 圖圖 12 紫外誘變對紫外誘變對 b 菌致死率的影響菌致死率的影響 fig.12 the death rate of b by using uv mutagenesis 由圖 12 可以看出，在 25 s 時 b 的致死率為 75 %，因此選擇 25 s 為最佳誘變時 間對該菌種進(jìn)行誘變。 3.2.1.2 紫外誘變后的初篩 在最佳誘變時間對兩種菌株進(jìn)行誘變，根據(jù) hc 值的大小進(jìn)行初篩。菌體誘變前 和誘變后的形態(tài)見表 3。 表表 3誘變前后醋酸菌的形態(tài)誘變前后醋酸菌的形態(tài) tab.3th

45、e form of acetic acid bacteria before and after mutation 編號 number 菌體形態(tài) morphology 固體培養(yǎng)菌落特征 colony characteristics of solid culture 時間/s 致死率/% 致死率% 時間/s 致死率% 時間/s 致死率% 時間/s 時間/s 致死率% 基本形態(tài) the basic form 形狀 shape 表面 surface 邊緣 edge 隆起形狀 bulge shape 顏色 color hc 值 hc value a 橢圓，對生 ellipse, opposite 斑點(diǎn)

46、spotted 光滑 smooth 整齊 tidy 突起 convex 乳黃色 cream 41 a11橢圓，對生 ellipse， opposite 斑點(diǎn) spotted 光滑 smooth 整齊 tidy 突起 convex 乳黃色 cream 51.3 b橢圓，對生 ellipse, opposite 圓形 round 光滑 smooth 整齊 tidy 突起 convex 乳黃色 cream 2.81.2 b11橢圓，對生 ellipse， opposite 圓形 round 光滑 smooth 整齊 tidy 突起 convex 乳黃色 cream 4.51.3 b12橢圓，對生 e

47、llipse， opposite 圓形 round 光滑 smooth 整齊 tidy 突起 convex 乳黃色 cream 4.01.5 b13橢圓，對生 ellipse， opposite 圓形 round 光滑 smooth 整齊 tidy 突起 convex 乳黃色 cream 4.21.8 通過表 3 的對比發(fā)現(xiàn)，誘變后的 hc 值明顯變大。此類菌株有可能為高產(chǎn)醋酸菌， 故挑選此類菌株進(jìn)行定性實驗。對 a11、b11、b12、b13進(jìn)行定性實驗結(jié)果如下圖所示： 圖圖 13 a11實驗結(jié)果實驗結(jié)果 圖圖 14 b11實驗結(jié)果實驗結(jié)果 fig.13results of a11 fig.

48、 14 results of b11 圖圖 15 b12實驗結(jié)果實驗結(jié)果 圖圖 16 b13實驗結(jié)果實驗結(jié)果 fig.15results of b12 fig.16 results of b13 由圖 13、圖 14、圖 15、圖 16 的實驗結(jié)果可以看出，定性實驗培養(yǎng)液均變?yōu)榧t 褐色溶液，并與對照培養(yǎng)液形成鮮明對比，故此四種菌均為醋酸菌。但是僅憑定性實 驗和 hc 值的大小并不能確定產(chǎn)酸量的變化情況，須通過對如上的幾種菌進(jìn)行復(fù)篩實 驗以驗證誘變的效果。 3.2.1.3 復(fù)篩 紫外誘變得到四種新菌種 a11、b11、b12、b13，將四種菌接入定量實驗培養(yǎng)基， 于 300.5 下 120 r/

49、min 搖床培養(yǎng)，待菌種到達(dá)穩(wěn)定期后，立即用 0.1 mol/l 的氫氧 化鈉溶液滴定酸度。紫外誘變前和誘變后的菌株的生長曲線如下： 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 02468 系列1 系列2 圖圖 17a、a11生長曲線生長曲線 fig.17the growth curve of a and a11 8 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 05101520 系列1 系列2 系列3 系列4 圖圖 18b、b11、b12、b13生長曲線生長曲線 fig.18the growth curve of b、b11 、b12 a

50、nd b13 圖 17 中系列 1 為誘變前菌株 a，系列 2 為誘變后所得菌株 a11。如圖可以看出， 誘變前后兩株菌的生長期基本沒有變化，只是誘變后的繁殖力增強(qiáng)，因此在對數(shù)期， 菌株的數(shù)目增大的幅度比較大。與此同時，產(chǎn)生的結(jié)果可能是在保證培養(yǎng)基中營養(yǎng)物 質(zhì)足夠用的前提下，產(chǎn)酸量會發(fā)生較大的變化。 圖 18 中系列 1、2、3、4 分別為 b、b11、b12、b13。如圖所示誘變后產(chǎn)生的三株 醋酸菌的生長期基本與誘變前一致，只是繁殖力有所提高，因此單位時間內(nèi)產(chǎn)生的菌 體數(shù)目比誘變前有提高。另外，除了 b12在對數(shù)期的增殖速率減小外其他的均變化不 明顯，因此，在保證培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)充足的條件

51、下，產(chǎn)酸量均有可能增加。 對以上挑選的菌株進(jìn)行總酸的測定，其誘變前后的產(chǎn)酸量見表 4。 時間/d log10(菌體數(shù)目) log10(菌體數(shù)目) 時間/d 表表 4 4誘變前后醋酸菌產(chǎn)酸量比較誘變前后醋酸菌產(chǎn)酸量比較 tab. 4mutation acid production of acetic acid bacteria before and after comparison 編號 number 產(chǎn)酸量/(g/l) the amount of acetic acid (g/l) a27.42 a1132.36 b64.65 b1167.80 b1262.83 b1367.26 由表 4 可

52、以看出，誘變后所得的菌種的產(chǎn)酸量發(fā)生了明顯的提高。a 菌株的產(chǎn)酸 量有了很大的提高，在原來的基礎(chǔ)上提高了約 18 %，b 菌株誘變產(chǎn)生的新菌株中 b11 的產(chǎn)酸量提高最大,約為 4.9 %，b13次之，b12發(fā)生負(fù)向突變，產(chǎn)酸量降低。 3.2.2 ems 誘變的結(jié)果篩選 3.2.2.1 ems 誘變致死率曲線及最佳誘變時間的確定 對菌 a、菌 b 進(jìn)行 ems 誘變，做出致死率-反應(yīng)時間曲線，選擇最佳誘變時間進(jìn) 行誘變 。 （1）菌 a 的致死率曲線如下： 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 020406080 圖圖 19菌菌 a 致死率曲線致死率曲線 fig.19leth

53、ality curve of a 由圖 19 可以看出，在約 17 min 時菌 a 致死率為 75 %，因此選擇此時刻為最佳 誘變時間對菌株 a 進(jìn)行 ems 誘變。 （2）菌 b 致死率曲線如下： 致死率% 時間/min 致死率% 致死率% 時間/min 時間 /min 時間/min 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 010203040506070 圖圖 20b 致死率曲線致死率曲線 fig.20lethality curve of b 由圖 20 得菌 b 在約 10 min 時致死率為 75 %，因此選擇此時刻為最佳誘變時間 進(jìn)行 ems 誘變。 3.2.2.2 ems

54、誘變后的初篩 在最佳誘變時間對兩種菌株進(jìn)行誘變，根據(jù) hc 值的大小對誘變后的菌株進(jìn)行初 篩。其誘變前和誘變后的結(jié)果見表 5。 表表 5誘變前后醋酸菌的形態(tài)誘變前后醋酸菌的形態(tài) tab.5the form of acetic acid bacteria before and after mutation 菌體形態(tài) morphology 固體培養(yǎng)菌落特征 colony characteristics of solid culture 編號 number 基本形態(tài) the basic form 形狀 shape 表面 surface 邊緣 edge 隆起形狀 bulge shape 顏色 colo

55、r hc 值 hc value a橢圓，對生 ellipse, opposite 斑點(diǎn) spotted 光滑 smooth 整齊 tidy 突起 convex 乳黃色 cream 41 a21 橢圓，對生 ellipse， opposite 斑點(diǎn) spotted 光滑 smooth 整齊 tidy 突起 convex 乳黃色 cream 5.01.2 b橢圓，對生 ellipse, opposite 圓形 round 光滑 smooth 整齊 tidy 突起 convex 乳黃色 cream 2.81.2 b21橢圓，對生 ellipse， opposite 圓形 round 光滑 smoot

56、h 整齊 tidy 突起 convex 乳黃色 cream 5.51.5 b22橢圓，對生 ellipse， opposite 圓形 round 光滑 smooth 整齊 tidy 突起 convex 乳黃色 cream 5.01.5 由表 5 可以看出，誘變后所得到的三株菌 a21、b21、b22的 hc 值比誘變前有一定 的改變，即說明誘變后的菌株的產(chǎn)酸量可能會提高，至于 hc 值與誘變后的產(chǎn)酸量變 化是否吻合還需要經(jīng)過后期的復(fù)篩實驗予以確認(rèn)。 對挑選出的 a21、b21、b22進(jìn)行定性實驗，其定性結(jié)果如下： 時間/min 致死率% 致死率% 時間/min 時間 /min 圖 21 左側(cè)試

57、管為定性實驗結(jié)果，右側(cè)為未加熱的對照組，其他兩圖均左側(cè)為對 照組，右圖為定性實驗結(jié)果。由實驗結(jié)果可以看出：a21、b21、b22三株菌種均為醋 桿菌屬。 3.2.2.3 復(fù)篩實驗 ems 誘變得到的新菌種 a21、b21、b22，現(xiàn)需要通過復(fù)篩實驗選出高產(chǎn)菌株。將 結(jié)果同誘變前進(jìn)行比較，以驗證誘變的效果。 表表 6 6誘變前后醋酸菌產(chǎn)酸量比較誘變前后醋酸菌產(chǎn)酸量比較 tab.6mutation acid production of acetic acid bacteria before and after comparison 編號 number 產(chǎn)酸量（g/l） the amount of

58、acetic acid (g/l) a27.42 a2131.40 b64.65 b2165.65 b2263.65 由表 6 可以看出，在誘變后，菌 a、菌 b 的產(chǎn)酸量都有所提高，其中菌 a 的產(chǎn) 酸量發(fā)生了較大的變化，而且為正向突變，提高了 14.5 %，菌 b 雖然有變化，但是 變化不大。而且 b22還發(fā)生了反向突變。但總的結(jié)果還是提高了菌株的產(chǎn)酸量。 圖圖 22 b21實驗結(jié)果實驗結(jié)果 fig.22 result s of b21 圖圖 21 a21實驗結(jié)果實驗結(jié)果 fig.21 results of a21 圖圖 23 b22實驗結(jié)果實驗結(jié)果 fig.23 results of b

59、22 3.3 醋酸菌產(chǎn)酸量的影響因素 3.3.1 單因素試驗設(shè)計 （1）溫度對醋酸產(chǎn)量的影響 將菌種接入產(chǎn)酸培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行酸堿滴定，分別得到結(jié)果如下 表： 表表 7a11耐溫度試驗設(shè)計及結(jié)果耐溫度試驗設(shè)計及結(jié)果 tab.7test design and results of temperature-resistant by a11 試驗號 test no. 溫度/ temp/ 乙醇濃度/% alcohol /% 溶氧量/r/min speed/ r/min 時間/h time / h 產(chǎn)酸量/g/ml total acidity / g/ml 125312014426.53 2

60、28312014435.13 330312014429.98 432312014425.26 535312014418.55 表表 8 b11耐溫度實驗設(shè)計及結(jié)果耐溫度實驗設(shè)計及結(jié)果 tab.8test design and results of temperature-resistant by b11 試驗號 test no. 溫度/ temp/ 乙醇濃度/% alcohol /% 溶氧量/ r/min speed/ r/min 時間/h time / h 產(chǎn)酸量/g/ml total acidity / g/ml 125312026427.9 228312026431.97 3303120