SDS-PAGE法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量實(shí)驗(yàn)

1、SDS-PAGE電泳測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?. 了解SDS-PAGE垂直板型電泳法的基本原理及操作技術(shù)。2. 學(xué)習(xí)并掌握SDSPAGE法測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理SDS-PAGE電泳法，即十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法。1在蛋白質(zhì)混合樣品中各蛋白質(zhì)組分的遷移率主要取決于分子大小和形狀以及所帶電荷多少。在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，SDS（十二烷基硫酸鈉，sodium dodecyl sulfatc）是一種很強(qiáng)的陰離子表面活性劑 ，它以其疏水基和蛋白質(zhì)分子的疏水區(qū)相結(jié)合，形成牢固的帶負(fù)電荷的SDS一 蛋白質(zhì)復(fù)合物。SDS和蛋白質(zhì)的結(jié)合是高密度的，其重量比通常為1.4:1, 由于

2、這種高密度的結(jié)合，新引入的凈電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子原有的凈電荷，從而消除或極大地降低了不同蛋白質(zhì)分子之間原有凈電荷的差異即消除了由于各種蛋白質(zhì)所帶凈電荷的不同對(duì)電泳遷移率的影響；SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物具有均一的電荷密度、相同的荷質(zhì)比。據(jù)流體力學(xué)等方面的研究推測(cè)，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物呈緊密的橢圓形或棒狀結(jié)構(gòu)，棒的短軸恒定，與蛋白質(zhì)種類無(wú)關(guān)，棒長(zhǎng)軸變化，與蛋白質(zhì)分子量成正比。SDS和蛋白質(zhì)結(jié)合后所形成的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，消除了由于天然蛋白質(zhì)分子形狀的不同對(duì)電泳遷移率的影響。根據(jù)上面的分析，SDS和蛋白質(zhì)結(jié)合后使其電泳遷移率僅取決于蛋白質(zhì)分子量的大小，因而可以通過比較未知分子量的蛋白質(zhì)和已知分子量

3、的蛋白質(zhì)分子的遷移率，測(cè)定出未知蛋白質(zhì)的分子量。朱廣廉與楊中漢, SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量. 植物生理學(xué)通訊, 1982(02): 第43-47頁(yè).2. 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15kb200kb之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)值呈直線關(guān)系，符合下列方程： log Mr = K b*mR式中：Mr為蛋白質(zhì)的分子量；K為常數(shù)；b為斜率；mR為相對(duì)遷移率。在條件一定時(shí)，b和K均為常數(shù)。若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。3. 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acryl

4、amide ,Acr）和交聯(lián)劑NN-甲叉雙丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide ,Bis）以29:1的比例在聚合劑過硫酸銨（ammonium persulfate , APS）和催化劑TEMED的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。聚丙烯酰胺凝膠通過濃縮效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)來分離不同分子量的蛋白質(zhì)。課件2013實(shí)驗(yàn)二GPT活性檢測(cè)&PAGE-L22013.5.15，第21頁(yè)4. 濃縮膠的作用（濃縮效應(yīng)）：濃縮膠中的氯離子形成移動(dòng)界面的先導(dǎo)邊界，而電泳液（PH8.3）中的甘氨酸分子則組成尾隨邊界，在移動(dòng)界面的兩邊界之間是電導(dǎo)較低而電位梯度較陡的區(qū)域，它推動(dòng)樣品中的蛋白質(zhì)

5、前移，樣品夾在前導(dǎo)和尾隨離子界面之間，使樣品濃縮，并在分離膠前沿積累；分離膠的作用（分子篩和電荷效應(yīng)）：在PH8.8分離膠中，甘氨酸離子化，遷移率超過蛋白質(zhì)，穿過堆積的多肽并緊隨氯離子之后泳動(dòng)。SDS多肽復(fù)合物從電位梯度界面中解脫開來，在電位和PH值均勻的區(qū)段泳動(dòng)，依Mr大小得到分離。課件2013實(shí)驗(yàn)二GPT活性檢測(cè)&PAGE-L22013.5.15，第24頁(yè)儀器、原料和試劑儀器：垂直板型電泳槽；直流穩(wěn)壓電源；50或100l微量注射器、玻璃板、水浴鍋，染色槽；燒杯；吸量管；常頭滴管等。原料：低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)按照每種蛋白0.51mg/ml樣品溶解液配制。可配制成單一蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液，也可配成混合蛋

6、白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。試劑：（1） 分離膠緩沖液（3 mol Tris-HCl緩沖液 PH8.8）:取36.3 g Tris溶于40 ml 1 mol HCl，調(diào)節(jié)PH至8.8，加入蒸餾水至100ml, 保存于4冰箱中。 （2） 濃縮膠緩沖液（0.5 mol Tris-HCl緩沖液 PH6.8）:取6g Tris溶于40 ml 1 mol HCl，調(diào)節(jié)PH至6.8，加入蒸餾水至100ml, 保存于4冰箱中。（3） 30%分離膠貯液：配制方法與連續(xù)體系相同，稱丙烯酰胺（Acr） 30g及N，N-甲撐雙丙烯酰胺（Bis）0.8g于100ml蒸餾水中加熱溶解，過濾后置棕色試劑瓶中，4保存。（4） 10%濃縮膠

7、貯液：稱Acr 10g及Bis 0.5g于100ml蒸餾水中加熱溶解，過濾后置棕色試劑瓶中，4貯存。（5） 10%SDS溶液：SDS可用去離子水配成10%（W/V）儲(chǔ)存液保存于室溫。（6） 1%TEMED：原液使用，儲(chǔ)存于棕色瓶中，4冰箱中保存。（7） 10%過硫酸銨（AP）：10%（W/V）過硫酸銨現(xiàn)用現(xiàn)配。（8） 電泳緩沖液（Tris-甘氨酸緩沖液PH8.3）:0.25mol Tris（三羥甲基氨基甲烷，MW 121）,0.5% SDS，1.92mol Gly（甘氨酸，MW 75），用1 mol HCl調(diào)節(jié)PH至8.3，臨用前稀釋5倍。（9） SDS電泳樣品緩沖液：50mmol Tris-

8、HCl（PH 6.8）；5%巰基乙醇；2% SDS；0.1%溴酚藍(lán)；10%甘油。（10） 染色液：320 ml 甲醇+630 ml H2O+70 ml冰醋酸混勻后加入Triton X-100 2.5ml，上述溶液在水浴中加熱至60后，加入考馬斯亮藍(lán)R250 1.38mg，攪拌至完全溶解，室溫保存。（11） 脫色液I：280ml乙醇+630ml H2O+70ml冰醋酸混勻后加入Triton X-100 20ml攪拌至完全溶解，室溫保存。（12） 脫色液II：300ml乙醇+630ml H2O+70ml冰醋酸，室溫保存。（13） 瓊脂糖封口膠：取2g 瓊脂糖加入到100ml PH8.3 的電極緩沖

9、液中，沸水浴中加熱至瓊脂糖完全溶解待用。平時(shí)保存于4冰箱中。（14） 上述實(shí)驗(yàn)用蒸餾水均為去離子雙蒸水。 費(fèi)正編，生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)復(fù)旦大學(xué)出版社，第76頁(yè)實(shí)驗(yàn)步驟1安裝夾心式垂直板電泳槽：根據(jù)具體不同型號(hào)要求進(jìn)行操作。主要注意：安裝前，膠條、玻板、槽子都要潔凈干燥；勿用手接觸灌膠面的玻璃。2配膠：根據(jù)所測(cè)蛋白質(zhì)分子量范圍，選擇適宜的分離膠濃度。本實(shí)驗(yàn)采用SDS-PAGE不連續(xù)系統(tǒng)，按下表的配制分離膠和濃縮膠。試劑名稱配制20ml不同濃度分離膠所需各種試劑用量/ml配制10ml濃縮膠所需試劑用量5%7.5%10%15%3%分離膠貯液 （30%Acr-0.8%Bis)3.335.006

10、.6610.00-分離膠緩沖液 （pH8.8Tris-HCl）2.502.502.502.50-濃縮膠貯液 （10%Acr-0.5%Bis）-3.0濃縮膠緩沖液 （pH6.8 Tris-HCl）-1.2510% SDS 0.200.20 0.20 0.20 0.101%TEMED 2.002.002.002.002.00重蒸餾水 11.8710.208.545.204.60混勻后，置真空干燥器中，抽氣10min10%AP0.100.10 0.10 0.10 0.05常用濃度濃縮膠、分離膠配方費(fèi)正編，生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)復(fù)旦大學(xué)出版社，第78頁(yè)3制備凝膠板：（1）分離膠灌制：按表配制20

11、ml 10%分離膠，混勻后用細(xì)長(zhǎng)頭滴管將凝膠液加至長(zhǎng)、短玻璃板間的縫隙內(nèi)，約8cm高，用1ml注射器取少許蒸餾水，沿長(zhǎng)玻璃板板壁緩慢注入，約34mm高，以進(jìn)行水封。約30min后，凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合。傾去水封層的蒸餾水，再用濾紙條吸去多余水分。（2）濃縮膠灌制：按表配制10ml 3%濃縮膠，混勻后用細(xì)長(zhǎng)頭滴管將濃縮膠加到已聚合的分離膠上方，直至距離短玻璃板上緣約0.5cm處，輕輕將樣品槽模板插入濃縮膠內(nèi)，避免帶入氣泡。約30min后凝膠聚合，再放置2030min。待凝膠凝固，小心拔去樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的水分，將pH8.3 Tris-甘氨

12、酸緩沖液倒入上、下貯槽中，應(yīng)沒過短板約0.5cm以上，即可準(zhǔn)備加樣。 4樣品處理及加樣各標(biāo)準(zhǔn)蛋白及待測(cè)蛋白都用樣品溶解液溶解，使?jié)舛葹?.51mg/mL，沸水浴加熱35min，冷卻至室溫備用。處理好的樣品液如經(jīng)長(zhǎng)期存放，使用前應(yīng)在沸水浴中加熱1分鐘，以消除亞穩(wěn)態(tài)聚合。 一般加樣體積為1015L（即210g蛋白質(zhì)）。如樣品較稀，可增加加樣體積。用微量注射器小心將樣品通過緩沖液加到凝膠凹形樣品槽底部，待所有凹形樣品槽內(nèi)都加了樣品，即可開始電泳。5電泳 將直流穩(wěn)壓電泳儀開關(guān)打開，開始時(shí)將電流調(diào)至1520mA。待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，將電流調(diào)至3040 mA。當(dāng)藍(lán)色染料遷移至底部時(shí)，將電流調(diào)回到零，關(guān)閉電

13、源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片輕輕將一塊玻璃撬開移去，在膠板一端切除一角作為標(biāo)記，將膠板移至大培養(yǎng)皿中染色。6染色及脫色將染色液倒入培養(yǎng)皿中，染色1h左右，用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白區(qū)帶清晰，即用直尺分別量取各條帶與凝膠頂端的距離。7. 計(jì)算1.相對(duì)遷移率mR =樣品遷移距離（cm）/染料遷移距離（cm）2.以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)對(duì)相對(duì)遷移率作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測(cè)樣品相對(duì)遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其分子量。注意事項(xiàng) 1. 不是所有的蛋白質(zhì)都能用SDS-凝膠電泳法測(cè)定其分子量，已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)用這種方法測(cè)出的分子量是不可靠的。包括：電荷異常或構(gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔

14、基的蛋白質(zhì)（如某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白如膠原蛋白等。例如組蛋白F1，它本身帶有大量正電荷，因此，盡管結(jié)合了正常比例的SDS，仍不能完全掩蓋其原有正電荷的影響，它的分子量是21,000，但SDS-凝膠電泳測(cè)定的結(jié)果卻是35,000。因此，最好至少用兩種方法來測(cè)定未知樣品的分子量，互相驗(yàn)證。 2有許多蛋白質(zhì)，是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們?cè)赟DS和巰基乙醇的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。因此，對(duì)于這一類蛋白質(zhì)，SDS-凝膠電泳測(cè)定的只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整分子的分子量。為了得到更全面的資料，還必須用其它方法測(cè)定其分子量及分子中肽鏈的數(shù)目

15、等，與SDS-凝膠電泳的結(jié)果互相參照。3. 點(diǎn)樣量和點(diǎn)樣體積對(duì)結(jié)果的影響: 朱廣廉等曾用 5 50 微克的點(diǎn)樣量、10 100 微升的點(diǎn)樣體積進(jìn)行比較，由于該系統(tǒng)有較好的濃縮效應(yīng)，上述點(diǎn)樣范圍對(duì)測(cè)量結(jié)果沒有明顯的影響，但以10微克的點(diǎn)樣量最好，區(qū)帶窄且清楚，便于測(cè)量和照像記錄。另外 , 和點(diǎn)樣體積有關(guān)的是溴酚藍(lán)的含量，若點(diǎn)樣體積小，樣品液中溴酚藍(lán)的含量應(yīng)適當(dāng)?shù)卦黾?；反之，溴酚藍(lán)的含量應(yīng)適當(dāng)?shù)慕档停駝t，溴酚藍(lán)區(qū)帶或者模糊不清，或者太寬，影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。4. 凝膠濃度的影響：按照表選擇分離膠的濃度能得到較滿意的結(jié)果。若膠濃度太低，小分子的蛋白質(zhì)會(huì)跑到溴酚藍(lán)的前面，如用7.5 % 的分離膠，核糖核

16、酸酶就可以與溴酚藍(lán)帶混在一起，7% 以下的分離膠，核糖核酸酶將走到溴酚藍(lán)帶的前面，影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。若分離膠過濃，大分子的樣品泳動(dòng)很慢、遷移率很小，且分子量和遷移率之間的線性關(guān)系變壞、實(shí)驗(yàn)誤差增大。 5. 溫度對(duì)電泳的影響：實(shí)驗(yàn)中觀察到，在13 以下進(jìn)行制膠和電泳，會(huì)發(fā)生SDS的沉淀現(xiàn)象，凝膠和電極緩沖液呈混濁不透明狀態(tài)，電泳時(shí)間延長(zhǎng)、電泳遷移率有所降低，影響結(jié)果的重復(fù)性，朱廣廉等認(rèn)為實(shí)驗(yàn)應(yīng)在13 以上進(jìn)行。朱廣廉與楊中漢, SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量. 植物生理學(xué)通訊, 1982(02): 第43-47頁(yè).參考文獻(xiàn)：1 朱廣廉與楊中漢, SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量. 植物生理學(xué)通訊, 1982(02): 第43-47頁(yè).2 Zilberstein, G., et al., SDS-P