免疫學(xué)綜合實(shí)驗(yàn) XX4

1、魚類免疫學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^測定人的ABC血型，魚的血清沉降抗體效價(jià)、白細(xì)胞的分離與鑒定、溶菌酶 活性等實(shí)驗(yàn)的基本實(shí)踐操作，加深對(duì)課堂知識(shí)的理解和體會(huì)，進(jìn)一步掌握魚類免疫 學(xué)的基本理論，熟悉常規(guī)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)基本操作。二、實(shí)驗(yàn)材料（1）實(shí)驗(yàn)材料：鯽（2）實(shí)驗(yàn)工具：微量移液器、稀釋棒（25 pl ）、載玻片、培養(yǎng)皿、離心管、注 射器（2ml、5ml）、手術(shù)剪、酒精燈、顯微鏡、打孔器、大頭針、恒溫箱、冰箱、生 理鹽水、金黃色葡萄球菌、甲醇、吉姆薩染液、肝素鈉、瓊脂等。三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備1、取兩支離心管，一支加入少量肝素，使肝素鈉浸潤管壁，另一支不加。2、在鯽兩鰓之間剪斷腹主動(dòng)脈，頭腹部向下，使血液滴入上

2、述兩試管，混勻, 置于離心管板靜置1小時(shí)備用。四、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（一）ABO血型鑒定（玻片法） 原理：血型就是紅細(xì)胞膜上特異抗原的類型。在 ABC血型系統(tǒng)中，紅細(xì)胞膜上抗原 分A和B兩種抗原，而血清抗體分抗 A和抗B兩種抗體。A抗原加抗A抗體或B抗原加抗B抗體，則產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。血型鑒定是將受試者的紅細(xì)胞加入標(biāo)準(zhǔn)A型血清（含有抗B抗體）與標(biāo)準(zhǔn)B型血清（含有抗A抗體）中，觀察有無凝集現(xiàn)象，從而 測知受試者紅細(xì)胞膜上有無 A或/和B抗原。在ABO血型系統(tǒng)，根據(jù)紅細(xì)胞膜上是否 含A、B抗原而分為A B AB O四型。0a A濾岷A+Mi(+1.取雙凹玻片一塊，用干凈紗布輕拭使之潔凈，在玻片兩端用臘筆標(biāo)明A及

3、B,并 分別各滴入A及B標(biāo)準(zhǔn)血清一滴。2.細(xì)胞懸液制備 從指尖或耳垂取血一滴，加入含1ml生理鹽水的小試管內(nèi)，混勻, 即得約5%紅細(xì)胞懸液。采血時(shí)應(yīng)注意先用 75%酒精消毒指尖或耳垂。3. 用滴管吸取紅細(xì)胞懸液，分別各滴一滴于玻片兩端的血清上，注意勿使滴管與血 清相接觸。4.竹簽兩頭分別混合，攪勻。5.1030min后觀察結(jié)果。如有凝集反應(yīng)可見到呈紅色點(diǎn)狀或小片狀凝集塊浮起。先用肉眼看有無凝集現(xiàn)象，肉眼不易分辨時(shí)，則在低倍顯微鏡下觀察，如有凝集反 應(yīng)，可見紅細(xì)胞聚集成團(tuán)。6.判斷血型 根據(jù)被試者紅細(xì)胞是否被 A, B型標(biāo)準(zhǔn)血清所凝集，判斷其血型。77（二）魚類血清中沉降抗體效價(jià)的測定1、實(shí)驗(yàn)原

4、理利用雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，是將抗原和相應(yīng)抗體分別加入同一凝膠板內(nèi)的相鄰小 孔中，使兩者互相擴(kuò)散，當(dāng)擴(kuò)散到它們的濃度比合適的部位相遇時(shí)，就會(huì)形成抗原 抗體復(fù)合物的沉淀。該沉淀在瓊脂中可呈現(xiàn)一條乳白色沉淀線。如果抗原和抗體不 相對(duì)應(yīng)，則無沉淀線出現(xiàn)。由于沉淀線形成的位置與抗原抗體濃度相關(guān)，抗原濃度 越濃，形成的沉淀線距離抗原孔越遠(yuǎn)；同樣，抗體濃度越濃，形成的沉淀線距抗體 孔越遠(yuǎn)。據(jù)此，固定抗原濃度，稀釋抗體，可測定抗體的效價(jià)。2、實(shí)驗(yàn)步驟稱取1.5g瓊脂粉，溶解于100ml PBS緩沖液中，加熱溶解，配制1.5%的瓊脂 將盛有瓊脂的錐形瓶置于水浴中，保持溶解狀態(tài) 吸取溶化好的瓊脂3ml傾注于載玻片上

5、（載玻片應(yīng)放水平） 待瓊脂凝固，按模板打孔，用大頭針挑出孔內(nèi)的瓊脂，中心孔為抗原孔，四 周孔為抗體孔。打孔后將玻片于酒精燈上烘烤背面（溫度不宜過高，以不燙手為宜）， 使瓊脂與玻片緊貼。 將抗血清和生理鹽水間隔加入圖1的6孔,中心孔加抗原（脂多糖LPS懸液，以 孔內(nèi)溶液不溢出為宜）。（三）魚類常見免疫細(xì)胞的分離和鑒定1、實(shí)驗(yàn)原理魚體中的免疫細(xì)胞是參與機(jī)體天然免疫的重要免疫細(xì)胞，當(dāng)病菌入侵機(jī)體后， 它能迅速地穿過血管壁，游至病菌入侵部位并發(fā)揮其免疫功能。頭腎中含有大量的 免疫細(xì)胞，如單核巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、T/B淋巴細(xì)胞、嗜酸/堿性細(xì)胞等。2、實(shí)驗(yàn)步驟方法一：試驗(yàn)魚先用濃度為150mg/L M

6、S-222深度麻醉，放入解剖盤內(nèi)，噴 75% 的酒精消毒，放入無菌操作臺(tái)中，采用尾椎放血，解剖魚體，找到頭腎，將頭腎分 離后，放入培養(yǎng)皿中，用生理鹽水或PBSg沖液將血液沖洗掉，將頭腎放在另一個(gè)干 凈的培養(yǎng)皿中的100目鋼網(wǎng)上，用注射器的橡膠塞小心研磨，將頭腎打散成單細(xì)胞， 一邊研磨一邊加入PBS每條魚大概加入6-7ml，細(xì)胞的濃度大概為109個(gè)。方法二：將加有抗凝劑的血液1500轉(zhuǎn)離心10min后，用微量移液器吸取抗凝血 中的白細(xì)胞層，加入小試管，然后加入 50 d金黃色葡萄菌液混勻，放于 25 r孵育 45m in。將上述任一懸液用微量移液器吸取，滴加一滴于載玻片一端，以另一載玻片小 心推

7、成血膜，晾干，甲醇固定5min，自然風(fēng)干，然后用吉姆薩染液染色 30min-1h。 觀察并鑒別魚類主要的免疫細(xì)胞類型 （如單核巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、TB淋巴細(xì) 胞、嗜酸/堿性細(xì)胞等）（四）魚類血清中溶解酶物質(zhì)活性的測定1、實(shí)驗(yàn)原理溶菌酶屬于乙酰氨基多糖酶，能裂解革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁肽聚糖分子的伕1, 4 糖苷鍵，而革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁肽聚糖外有一層脂蛋白和脂多糖，所以不直接受溶 菌酶影響。溶菌酶來源于吞噬細(xì)胞的溶酶體， 廣泛存在于淚液、唾液、和血清等處。 溶菌酶活性可通過檢查其對(duì)指定敏感菌株裂解作用來進(jìn)行測定。測定方法有光學(xué)測 定法和平板打孔測定法等。平板打孔測定法是在混有菌液的瓊脂凝膠上打孔，

8、檢品 放在孔內(nèi)，一定時(shí)間后測量溶菌環(huán)的直徑，根據(jù)溶菌環(huán)的大小來推知溶菌酶的含量。2、實(shí)驗(yàn)步驟 將加熱溶化的瓊脂傾注于培養(yǎng)皿內(nèi)，厚度為 2-3mm； 待瓊脂凝固后，加金黃色葡萄球菌液 50-100d并涂布均勻。按模板打孔，用 大頭針挑出孔內(nèi)的瓊脂，在孔內(nèi)加入血清，1, 2號(hào)孔在酒精燈上滅活。將培養(yǎng)皿放 于濕盒上，25 r培育15-18h。 培育后取出培養(yǎng)皿，觀察溶菌環(huán)的大小。人過四十，已然不惑。我們聽過別人的歌，也唱過自己的曲，但誰也逃不過歲月的審視，逃不過現(xiàn)實(shí)的殘酷。如若，把心中的雜念拋開，茍且的日子里，其實(shí)也能無比詩意。借一些時(shí)光，尋一處寧靜，聽聽花開，看看花落，翻一本愛讀的書，悟一段哲人的

9、贈(zèng)言，原來，日升月落，一切還是那么美。洗不凈的浮沉，留給雨天；悟不透的凡事，交給時(shí)間。很多時(shí)候，人生的遺憾，不是因?yàn)闆]有實(shí)現(xiàn)，而是沉于悲傷，錯(cuò)過了打開心結(jié)的時(shí)機(jī)。時(shí)間就像海綿里的水，只要擠總是有的。有人說工作忙、應(yīng)酬多，哪有那么多的閑情逸致??？記得魯迅有句話:不明花語，卻逢花季。一路行走，在漸行漸遠(yuǎn)的時(shí)光中，命運(yùn)會(huì)給你一次次洗牌，但玩牌的始終是你自己。坦白的說，我們遇到困擾，經(jīng)常會(huì)放大自己的苦，虐待自己，然后落個(gè)遍體鱗傷，可憐兮兮地向世界宣告：自己沒救了！可是，那又怎樣？因?yàn)?，大多?shù)人關(guān)心的都是自己。一個(gè)人在成年后，最暢快的事，莫過于經(jīng)過一番努力后，重新認(rèn)識(shí)自己，改變自己。學(xué)會(huì)了獨(dú)自、沉默，不

10、輕易訴說。因?yàn)?，更多的時(shí)候，訴說毫無意義。傷心也好，開心也好，過去了，都是曾經(jīng)。每個(gè)人都要追尋活下去的理由，心懷美好，期待美好，這個(gè)世界，就沒有那么糟糕?；蛟S，你也會(huì)有這樣的情節(jié)，兩個(gè)人坐在一起，雜亂無章的聊天，突然你感到無聊，你渴望安靜，你想一個(gè)人咀嚼內(nèi)心的悲與喜。透過窗格，發(fā)著呆，走著神，搜索不到要附和的詞。那一刻，你明白了，這世間不缺一起品茗的人，缺的是一個(gè)與你同步的靈魂。沒有了期望的懂，還是把故事留給自己吧！每個(gè)人都是一座孤島，顛沛流離，浪跡天涯。有時(shí)候，你以為找到了知己，其實(shí)，你們根本就是兩個(gè)世界的人?；?，只有在凋零的時(shí)候，才懂得永恒就是在落紅中重生；人，只有在落魄的時(shí)候，才明白力量就是在破土中崛起？因?yàn)榉纻?，因?yàn)榻?jīng)歷，我們學(xué)會(huì)了掩飾，掩飾自己內(nèi)心的某些真實(shí)，也在真實(shí)中，揚(yáng)起無懈可擊