梔子果實中環(huán)烯醚萜苷類護(hù)肝解毒功效研究

1、梔子果實中環(huán)烯醚萜苷類護(hù)肝解毒功效研究摘要：環(huán)烯醚萜苷類是梔子果實中的主要有效成分，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展， 其在護(hù)肝養(yǎng)肝中的功效逐漸引起人們的關(guān)注和重視。梔子是一種常用中藥，是一種茜草科植物，其別名又叫做黃梔子、山梔等。 梔子適應(yīng)性較強，在我國很多地方都有種植，在南方主要以野生為主，大多分布在江西、湖南、浙江、福建以及四川等地。 最早在神農(nóng)本草經(jīng)中就有梔子作為藥用植物的記載，隨后其在藥學(xué)上的功效被不斷補充和完善。 本草經(jīng)集注中記載“梔子性寒，味苦，歸心、肝、肺、胃三焦經(jīng)”，主要治療黃疸、煩心、目赤腫痛等熱性癥狀疾病?，F(xiàn)代對梔子化學(xué)藥用的研究開始于上個世紀(jì)， 從研究成果上看， 現(xiàn)代科技已經(jīng)分離鑒定

2、出梔子中的幾十種化學(xué)成分， 其中有 40多種化合物具有明顯的化學(xué)藥用特性， 比如黃酮類、環(huán)烯醚菇類、有機酸酷類、 d- 甘露醇、幽醇類及色素等。 而梔子果實中的有效成分環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)， 更是在治療肝臟疾病方面有很好的療效，能起到保肝利膽、清熱解毒、 抗菌消炎的作用。1. 梔子果實中的環(huán)烯醚萜苷類有效成分梔子果實中的環(huán)烯醚萜苷類有效成分主要有：梔子苷、京尼平-1- B、龍膽雙糖苷、山桅苷甲酯、雞矢藤次苷甲酯、經(jīng)異桅子苷、去乙酞基車前草酸苷甲酯、桅子苷酸、山桅酯、桅子新苷、去乙酞基車前草酸等幾種。2. 梔子果實中的環(huán)烯醚萜苷類的鑒定2.1 儀器與材料本研究中用到的儀器主要是：SB-3200 超聲

3、波清洗器、Eeppendorf 高速離心機、Hi-tech 的去離子水水2h/次；獲得的萃取液ephadexTMLH-20 、 HKM- 電熱恒溫干燥箱、 DZF-6020 真空干燥箱、 waters 半制備型高效液相 色譜儀、lOOOul定量環(huán)、2487檢測器、反相硅膠RP-18、SENCO旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(1000ml/10L )、 大孔吸附樹脂D101、Dionex分析型高效液相色譜儀、DJ-O4B中藥粉碎機材料：色譜純乙腈、分析純甲醇、分析純乙醇、自制去離子水( 機進(jìn)行去離子水經(jīng)過微孔濾膜) 、桅子。2.2 有效成分萃取用 100ml 50%的酒精對 3000g 梔子干燥粉進(jìn)行萃取，回流兩次

4、，進(jìn)行過濾處理，然后用離心機離心10min，3000rpm ;對其進(jìn)行壓力釋放并濃縮，進(jìn)行溫度為60C的真空干燥，獲得的提取粉的質(zhì)量為798.99g,計算物質(zhì)的得率為 26.63%。2.3大孔吸附樹脂的準(zhǔn)備大孔吸附樹脂顧名思義不是利用陰陽離子交換集團(tuán)進(jìn)行吸附，而是利用本身的大孔構(gòu)造，通過這種大孔有選擇性的從水溶液中吸附有效物質(zhì)。這種大孔物質(zhì)吸附性好，比常規(guī)的交換樹脂好解析，另外這種樹脂的強度大，還可以重復(fù)使用,因為孔結(jié)構(gòu)，其流體阻力相對的較小等。本研究利用大孔吸附樹脂將環(huán)烯醚菇貳類化合物從梔子中萃取，達(dá)到初步純化。將150g萃取物溶解在2000ml水溶劑中，充分混勻，利用1500g已經(jīng)準(zhǔn)備好的

5、 D101大孔吸附樹脂進(jìn)行層析，層析萃取的過程為2h,然后再用1500ml洗脫液進(jìn)行洗脫，之后用有機溶劑600ml酒精進(jìn)行沖洗，60 C行真空干燥乙醇洗脫后的部分，最終獲得總環(huán)烯醚菇苷類物質(zhì)50.48g,計算得率是9.3%。2.4葡聚糖凝膠柱層析上世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一種新型的層析技術(shù)一葡聚糖凝膠色譜技術(shù)。該技術(shù)操作沒有難度，最大的優(yōu)點是整個層析的過程不需要有機溶劑，利用其本身具有分子篩原理進(jìn)行層信息，從而達(dá)到萃取的作用。本研究利用初步提取的環(huán)烯醚菇苷粉末3.0g,充分溶解于水,將樣品加入到 LH-20葡聚糖凝膠柱上柱。完成上柱后，用30%甲醇作為洗脫液進(jìn)行洗脫,50ml作為一個流份，一共收

6、集了20份。根據(jù)高效液相色譜圖進(jìn)行合理的整理，高效液相色譜的采用梯度洗脫，用LichrosPherC iscolumn。高效液相色譜的流動相是CH3COOH:CH 3CN=0.1:100 , CH3C00H:H20=0.1:100。將20份流份分成5種粉末，具體如下：粉末1是將獲得的2-4合并的流份進(jìn)行干燥,最終得到的粉末，對這些粉末進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其含有的主要是H和J, 一共270mg;粉末2是將5-7合并的流份進(jìn)行干燥，最終得到的粉末，對這些粉末進(jìn)行物質(zhì)含量檢測，粉末總重687mg, B、C、D和F是其主要含有的化學(xué)物質(zhì)；粉末3是將獲得的8-9合并的流份進(jìn)行干燥，最終得到的總重 789mg粉

7、末，對這些粉末進(jìn)行檢測，A是其主要含有的物質(zhì)。然后利用MS-HNMR和.3cNMR進(jìn)行波普分析，獲得的數(shù)據(jù)為桅子苷； 粉末4是將流份10-11合并,然后干燥共獲得112mg，經(jīng)過檢測分析，該粉末含有的化合物主要是G物質(zhì)。粉末5是將流份1-2合并，然后干燥共獲得278mg，經(jīng)過檢測分析，該粉末含有的化合物主要是E物質(zhì)和I物質(zhì)2.5反相硅膠柱層析用10%乙腈溶解經(jīng)過大孔樹脂提取，葡聚糖凝膠柱層析獲得的粉末2，乙腈-粉末2溶液在離心機進(jìn)行高速離心，離心10min,15000rpm，然后將所得的離心上清液體作為上樣液,在反相硅膠中壓柱上柱，該層析用正常的流速，流動相為乙腈一水(10:90,v/v)進(jìn)行

8、洗脫,個流份10min，共獲得50份。將HCLP分析合并，色譜條件同上，最終得到的粉末6是11-20流份合并，進(jìn)行干燥，對這些粉末進(jìn)行檢測，F(xiàn)和少量D是其主要含有的物質(zhì)。計算物質(zhì) F的純度為79% （峰面積歸一化法計算）；粉末7是21-25流份合并，進(jìn)行干燥，對這些粉末進(jìn)行檢測，D和少量F是其主要含有的物質(zhì)。計算物質(zhì)D的純度為81% （峰面積歸一化法計算）；粉末8是26-30流份合并，進(jìn)行干燥，對這些粉末進(jìn)行檢測,C是其主要含有的物質(zhì)。計算物質(zhì) C的純度為87% （峰面積歸一化法計算）；粉末9是34-O流份合并，進(jìn)行干燥，總重為185mg ,對這些粉末進(jìn)行檢測，B是其主要含有的物質(zhì)。計算該物質(zhì)

9、的純度為98% （峰面積歸一化法計算）；利用MS-IHNMR和-3CNM波普分析，將分析的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，最終確定為京尼平-1- P-龍膽雙糖苷。2.6半制備型反相高效液相色譜把經(jīng)過大孔吸附樹脂-葡聚糖凝膠處理后得到的粉末與5%的乙腈混合，使其充分溶解,并用半制備型反相高效液相色譜儀對其進(jìn)行分離純化?？傻玫交衔颒和J，含量分別為92mg和25mg=通過高效液相色譜對其進(jìn)行純度檢測，可知兩種化合物純度均在 99%上，對其進(jìn)行MS HNMf和n 13CNMR分析，可知，H化合物為山梔苷，J化合物為乙?；嚽安菟?。把經(jīng)過大孔吸附樹脂-葡聚糖凝膠處理后得到的粉末與6%的乙腈當(dāng)中，使其充分溶解,并用半制

10、備型反相高效液相色譜儀對其進(jìn)行分離純化。通過高效液相色譜對其純度進(jìn)行檢 測，檢測結(jié)果大于 99%對其進(jìn)行 MS hNMR和13CNM分析，可知，改化合物為梔子苷酸。把經(jīng)過大孔吸附樹脂-葡聚糖凝膠處理后得到的粉末與 5%的乙腈混合，使其充分溶解,并用半制備型反相高效液相色譜儀對其進(jìn)行分離純化。可得到化合物I和E,含量分別為41mg99%以上，對其和118mg3通過高效液相色譜對其進(jìn)行純度檢測，可知兩種化合物純度均在 進(jìn)行MS FhNMR和13CNMR分析，可知，I化合物為梔子新苷，E化合物為羥異桅子苷。把經(jīng)過大孔吸附樹脂-葡聚糖凝膠-反相硅膠柱層析處理后得到的粉末與8%勺乙腈混通過高效液相色合，

11、使其充分溶解，并用半制備型反相高效液相色譜儀對其進(jìn)行分離純化。譜對其進(jìn)行純度檢測，可知該化合物純度在99%以上，對其進(jìn)行 MS FhNMR和 13CNM分析,可知，該化合物為去乙?；嚽安菟彳占柞?。把經(jīng)過大孔吸附樹脂 -葡聚糖凝膠 - 反相硅膠柱層析處理后得到的粉末與8%的乙腈混合，使其充分溶解， 并用半制備型反相高效液相色譜儀對其進(jìn)行分離純化。通過高效液相色譜對其進(jìn)行純度檢測，可知該化合物純度在99%以上，對其進(jìn)行 MS FhNMF和13CNM分析,可知，該化合物為去雞屎藤次苷甲酯。把經(jīng)過大孔吸附樹脂 - 葡聚糖凝膠 -反相硅膠柱層析處理后得到的粉末與8%的乙腈混合，使其充分溶解， 并用半制

12、備型反相高效液相色譜儀對其進(jìn)行分離純化。通過高效液相色譜對其進(jìn)行純度檢測，可知該化合物純度在99%以上，對其進(jìn)行 MS 1HNMf和n 13CNM分析,可知，該化合物為山梔苷甲酯。3. 梔子果實中的環(huán)烯醚萜類護(hù)肝養(yǎng)胃藥理作用在梔子植物類中， 包含著多種環(huán)烯醚萜類化合物成分，其中的環(huán)烯醚萜烷類、 環(huán)烯醚萜國際上已經(jīng)確定了環(huán)烯醚萜類的苷類、環(huán)烯醚萜二縮醛酯類和裂環(huán)烯醚萜苷類是應(yīng)用較多?；竟羌埽⑼ㄟ^對其環(huán)氧化、烴基化或者借助莽草酸能將其轉(zhuǎn)換成各種不同的芳香酸酯， 得到多種化合物，豐富其藥理活性的研究成為未來發(fā)展的主要趨勢。3.1 對消化系統(tǒng)的作用3.1.1 利膽作用 梔子能起到很強的膽囊收縮功效

13、，具有明顯的利膽排石效果，其藥理而京尼平苷的利膽機作用明顯高于水的效果， 可以達(dá)到高脂餐所起的效應(yīng)。 這主要是梔子果實中的環(huán)烯醚萜苷類 在起作用。 在實驗中，通過大鼠給藥，可以發(fā)現(xiàn)大鼠的膽汁分泌明顯。理是借助水解成京尼平來起作用的。 實驗中通過靜脈注射京尼平可出現(xiàn)利膽功效。3.1.2 對急性胰腺炎的作用人的機體可以借助生物酶的作用產(chǎn)生大量的氧自由基，這些自由基能夠與多不飽和脂肪酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)， 從而形成一種脂質(zhì)過氧化物。 脂質(zhì)過氧化物可以將活性氧作用到機體中產(chǎn) 生出非自由基性的脂類分解產(chǎn)物， 同時還可以發(fā)生鏈?zhǔn)椒磻?yīng)， 讓活性氧發(fā)揮更大的作用。 因SAP重癥胰腺炎)大鼠具此, 初始的活性氧能導(dǎo)致

14、多種脂類分解產(chǎn)物的形成。而這些產(chǎn)物有些對機體有害，可能引起機體功能障礙，有些則作為其他媒介繼續(xù)發(fā)揮作用。梔子提取液對有明顯降低血清及組織中脂質(zhì)過氧化物活性水平的作用, 這對維護(hù)機體自身的抗氧化能力減輕SAP時氧自由基及其級聯(lián)反應(yīng)對機體造成的損傷，減輕胰腺損傷具有明顯的正向影響。酸性磷酸酶為線粒體，琥珀酰脫氫酶(SDH)為溶酶體，細(xì)胞色素 P450為線粒體標(biāo)志酶,分析梔子對急性胰腺炎的治療效果。 其結(jié)果顯示： 胰腺腺細(xì)胞中的線粒體在急性胰腺炎后會 出現(xiàn)功能障礙， 此時施加梔子對其進(jìn)行作用后， 線粒體有氧代謝可以得到回復(fù)或者達(dá)到正常狀態(tài)。琥珀酰脫氫酶（SDH）溶酶體中釋放的酶可以促進(jìn)胰腺自身消化。

15、梔子對其作用后，其酶釋放減少，膜流動恢復(fù)正常。另外，梔子作用，細(xì)胞色素 P450 含量也有所提高，說明此時細(xì)胞的代謝功能有所恢復(fù)。 因此，梔子具有增強胰腺炎時胰腺的抗病能力。3.2 護(hù)肝作用梔子提取物可以有效的增強動物的丫、Z蛋白量，提高結(jié)扎總膽管的GOT同時，用不用炮制方法制成的梔子， 其保肝效果也不完全相同，其中，生梔子的保肝效果最高，而炒炭制品則完全不具有保肝作用。 說明梔子的護(hù)肝作用與其加工溫度有關(guān)， 當(dāng)溫度過高時， 其護(hù)肝成分受到影響，當(dāng)溫度高于200C時，其護(hù)肝成分被徹底破壞， 護(hù)肝功效消失。研究發(fā)現(xiàn),梔子中的有效護(hù)肝成分主要為梔子苷。 在實際中， 以生梔子作為治療急性黃疸性肝炎的

16、主要藥品。梔子中的熊果酸還具有降低血清轉(zhuǎn)氨酶的供銷， 對抑制肝癌細(xì)胞具有很好的治療效果。3.3 對胃功能的影響通過灌胃的方式， 將梔子生藥或者炮制品的水煎物作用于小鼠， 來測試小鼠在饑餓狀態(tài)下胃酸分泌以及胃蛋白酶活性的變化。 實驗結(jié)果說明梔子生品能有效抑制這兩者生成，而炮制品的效果相對要弱， 但是如果是姜制品反而能促進(jìn)胃酸的分泌。 梔子中的京尼平苷也可以抑制胃酸分泌， 而在各種引起胃酸分泌亢進(jìn)的藥物中， 京尼平苷對抑制碳酰膽堿有很好的效果。對大鼠注射京尼平，可以發(fā)現(xiàn)其能有效抑制毛果蕓香堿所致的亢進(jìn)運動, 并使胃張力減少。因此認(rèn)為京尼平對胃機能呈抗膽堿性的抑制作用。4. 梔子果實中環(huán)烯醚萜苷類其

17、他藥理作用4.1 對心血管系統(tǒng)的作用4.1.1 降壓作用 梔子的水性提取物或者醇提取物在心血管降壓效果上也比較明顯，驗中不論是通過口服還是靜脈注射都可以達(dá)到降壓的效果。兩種方式相比較， 靜脈注射起效快，但持續(xù)時間較短。另外，在實驗中， 發(fā)現(xiàn)梔子針對腎上腺素的升壓以及抑制頸動脈血流的加壓反射無法起到降壓的作用， 表明其降壓作用與組胺釋放無關(guān)。 當(dāng)梔子與普魯卡因同時注射時， 兩者不會相互干擾， 表明梔子的降壓作用也不受傳入神經(jīng)纖維影響。而一旦切斷雙側(cè)迷走神經(jīng)， 則降壓效果會隨之降低或不再起作用。 說明梔子所起的降壓主要是作用在中樞神經(jīng)部位。4.1.2 防治動脈粥樣硬化及抗血栓作用 在臨床手術(shù)中，經(jīng)

18、常會出現(xiàn)血管損傷愈合時細(xì) 胞生長而造成的血管阻塞， 進(jìn)而引起動脈粥樣硬化或者血栓形成。 試驗中可發(fā)現(xiàn)梔子果實中的一種提取物能有效緩解與防治動脈粥樣硬化， 并能起到抗血栓形成的作用， 這主要是由于該提取物能夠促進(jìn)血管損傷部位的細(xì)胞原始纖維組織的生長，從而讓內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮一定的作用。另外， 對牛動脈內(nèi)皮細(xì)胞層酸不溶性部分的結(jié)合研究中，利用生物測定而分離出的甘油和 D- 甘露醇可以刺激不溶性物質(zhì)的結(jié)合，說明梔子提取物中有很好的活性成分。但是這種活性成分對牛動脈血管平滑肌無效果。4.2 對中樞神經(jīng)的作用4.2.1 鎮(zhèn)靜作用 通過對小鼠用梔子生品及炮制品的水煎液、異戊巴比妥注射液，等體積生理鹽水研究鎮(zhèn)靜效

19、果進(jìn)行對比， 發(fā)現(xiàn)梔子生品及炮制品的水煎液的鎮(zhèn)靜效果明顯強于其它兩種，能有效延長小鼠的睡眠時間，而水煎液的鎮(zhèn)靜效果在200 C以下時與溫度的高低呈正向線性關(guān)系。4.2.2 鎮(zhèn)痛作用 為了加強對比，實驗對象選擇了雄性昆明小鼠，并對小鼠禁食16 小時，期間可以飲水。然后將小鼠分成 4 個實驗組，并注射 0.16%醋酸溶液，觀察一刻鐘內(nèi)小鼠的扭體數(shù)，將結(jié)果與模型組對比，最后做 t 檢測。實驗結(jié)果說明 1g 的梔子浸膏可以有效減少小鼠扭體反應(yīng)的次數(shù)， 說明梔子浸膏對醋酸誘發(fā)的疼痛反應(yīng)有抑制作用。4.2.3 解熱作用 臨床治療發(fā)熱癥狀時， 利用梔子生品與各種炮制品的提取液分別通過灌胃與皮下注射方式， 都可以起到較好的降熱效果， 而梔子生品提取液的治療效果更好， 臨床中的應(yīng)用也證實了實驗效果。4.3 抗炎和治療軟組織損傷作用在軟組織損傷方面， 梔子對小鼠與家兔具有不同效果的抗炎消腫作用。在治療小鼠耳殼腫脹以及甲醛導(dǎo)致的腳趾炎癥中，分別用梔子醋酸乙酯提取物和90%乙醇提取物，都可以起到一定的抗炎效果， 但是乙