組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書

1、實(shí)驗(yàn)一 組培 器皿及器械的洗滌、滅菌及環(huán)境的消毒一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生了解并掌握 組織培養(yǎng)用 實(shí)驗(yàn)器皿及器械的洗滌、 滅菌，環(huán) 境的消毒方法。二、實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)儀器及器械的清洗、消毒和滅菌是組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵所在，是外植體 免受污染的前提。由于滅菌劑的種類不同， 所以選擇消毒劑既要考慮良好的消毒、 殺菌作用，同時易被蒸餾水沖洗掉。無菌的環(huán)境是植物組織培養(yǎng)成功的前提， 因?yàn)榻^大多數(shù)操作程序要求在無菌 條件下進(jìn)行。三、實(shí)驗(yàn)操作步驟（一）器皿與用具的洗滌1、玻璃器皿的洗滌新購置的玻璃器皿或多或少都含有游離的堿性物質(zhì)。 使用前要先用 1%稀 HCL 浸泡一夜，再用肥皂水洗凈，清水沖洗后，再用蒸餾水

2、沖洗 1 次，晾干后備用。 用過的玻璃器皿，用清水沖洗，蒸餾水沖洗一次，干后備用即可。對于已被污染的玻璃器皿則必須在高壓蒸汽滅菌后， 倒去殘?jiān)妹⑺⑷?瓶壁上的培養(yǎng)液和病斑后，再用清水沖洗干凈，蒸餾水沖淋一遍，晾干備用，切 忌不可用水直接沖洗， 否則會造成培養(yǎng)環(huán)境的污染。 清洗后的玻璃器皿， 瓶壁應(yīng) 透明發(fā)亮，內(nèi)外壁水膜均一，不掛水珠。2、金屬用具的洗滌新購置的金屬用具表面上有一層油膩， 需擦凈油膩后再用熱肥皂水洗凈，清 水沖洗后，擦干備用。用過的金屬用具，用清水洗凈，擦干備用即可。3、每人清洗部分玻璃器皿清水洗凈浸入洗衣粉溶液中洗刷清水反復(fù)沖洗蒸餾水淋一遍烘干 備用。對于較臟玻璃器皿的洗

3、滌：采用先堿后酸的方法，即用洗衣粉洗刷后沖洗干 凈晾干浸入酪酸洗液(一種強(qiáng)氧化劑，去污能力強(qiáng)，配制方法：重鉻酸鉀 40克，溶解在500ml在水中，然后徐徐加入450ml粗制濃硫酸)，浸泡時間視 器皿的骯臟程度而定清水反復(fù)沖洗干凈蒸餾水淋洗一遍烘干備用。對于帶有石蠟或膠布的器皿：先將其除去，再用常規(guī)洗滌，石蠟用水煮沸數(shù) 次即可去掉，膠布粘著物則需用洗衣粉液煮沸數(shù)小時， 再用水沖洗，涼干后浸入 洗液，以后的步驟同前。(二) 玻璃器皿、用具及環(huán)境的滅菌1、玻璃器皿和用具的滅菌(1) 采用干熱滅菌法：將洗干凈晾干后的培養(yǎng)皿、三角瓶、吸管等玻璃用具和解剖針、解剖刀、鑷 子等金屬器具，用紙包好，放進(jìn)電熱烘

4、干箱，當(dāng)溫度升至100C時，啟動箱內(nèi)鼓風(fēng)機(jī)，使電熱箱內(nèi)的溫度均勻。當(dāng)溫度升至150C時，定時控制40min (或120C 定時120min),達(dá)到滅菌目的。(2) 采用高壓蒸汽滅菌法：即用手提式高壓滅菌鍋，在1.2個大氣壓下保持1520分鐘。有些如聚丙 烯、聚甲基戊烯等類型的塑料用具也可以進(jìn)行高溫消毒。(3) 灼燒滅菌：用于無菌操作的鑷子、解剖刀等用具除高壓蒸汽滅菌外，在接種過程中還常 常采用灼燒滅菌，將鑷子、解剖刀等從浸入 95%酉精中取出，置于酒精燈火焰上 灼燒，借助酒精瞬間燃燒產(chǎn)生高熱來達(dá)到殺菌等目的。操作過程中要反復(fù)浸泡、 灼燒、放涼、使用，操作完畢后，用具應(yīng)擦拭干凈后再放置。2、環(huán)境

5、的消毒(1)地面、墻壁和工作臺的滅菌每次使用前，將配好的20%ff潔爾滅(苯扎溴銨)溶液倒入噴霧器中，對接 種室地面、墻壁、角落均勻地噴霧。在噴房頂時 間，注意不要讓藥液滴入眼睛。 然后開啟紫外燈開關(guān)，照射1530mi n, 般紫外線消毒后不要立即進(jìn)入，應(yīng)在 關(guān)閉紫外燈 15-20min 后進(jìn)入室內(nèi)。（2）無菌室和培養(yǎng)室的滅菌 消毒滅菌的方法：首先將房子關(guān)閉，定期用甲醛和高錳酸鉀2：1 的比例定期熏蒸滅菌 24h 或用 70%的酒精或 0.5%苯酚噴霧降塵和消毒。 操作時要戴好口罩 和手套，用甲醛與高錳酸鉀配比時要注意避開煙霧， 封閉消毒期間不宜進(jìn)入消毒 空間。三、 實(shí)驗(yàn)報告1 將本次實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

6、整理成實(shí)驗(yàn)報告。2. 試闡述為什么要對器皿和用具進(jìn)行嚴(yán)格的洗滌和滅菌？實(shí)驗(yàn)二 培養(yǎng)基母液的配制與保存（MS培養(yǎng)基）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^學(xué)習(xí)MS培養(yǎng)基母液的配制與保存，掌握培養(yǎng)基母液濃度的換算、配制 與母液的保存方法。二、實(shí)驗(yàn)原理 培養(yǎng)基制備之前，為了使用方便和用量準(zhǔn)確，常常將大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物類、 激素類分別配制成比培養(yǎng)基配方需要量大若干倍的母液。 當(dāng)制 備培養(yǎng)基時，只需要按預(yù)先計算好的量吸取母液即可。三、實(shí)驗(yàn)儀器、用具及試劑（一）實(shí)驗(yàn)儀器、器皿及用具電子天平（感量為 O.OOOIg、0.01g）,燒杯（1000ml, 100ml, 50ml）、量 筒（1000ml，100ml，50

7、ml）、容量瓶（1000ml, 500ml，200 ml，100ml, 50ml）、 棕色或白色廣口瓶（1000ml, 500ml, 200 ml, 100ml）、藥匙、玻璃棒、稱量紙、 標(biāo)簽、冰箱。（二）試劑MS培養(yǎng)基所需各種試劑、IAA、IBA、NAA 6-BA、2,4-D、GA3、KT、蒸餾 水、重蒸餾水。四、實(shí)驗(yàn)步驟與方法母液的配制是按所使用藥品的類別，而分別配成大量元素、微量元素、維生 素、鈣鹽、鎂鹽和鐵鹽等。配制母液時特別要注意無機(jī)鹽成分在一起，可能產(chǎn)生 的化學(xué)反應(yīng)，如CaT和SO42-,Ca2+,Mg2+和PQ3-起溶解后，會產(chǎn)生硫酸鈣或磷酸鈣 的不溶物沉淀，因此不能配在一起作母

8、液貯存，應(yīng)分別配制和保存。配制母液時要用雙重蒸餾水等純度較高的水，藥品應(yīng)采用化學(xué)純或分析純 級，藥品的稱量及定容都要準(zhǔn)確，各種藥品先以少量蒸餾水使其充分溶解，然后按培 養(yǎng)基一 上的排列順序混合?，F(xiàn)以MS培養(yǎng)基（Murashige和Skoog,1962）為例敘述如下：（一）、大量元素母液（濃縮10倍）的配制MS培養(yǎng)基配方中大量元素共有5種（表1-1 ），按照培養(yǎng)基配方的用量，各 種化合物擴(kuò)大10倍，用電子天平分別稱好，分別用 50ml燒杯稱量，加30-40ml 蒸餾水溶解。5種化合物分別充分溶解后，按 順序混合定容在1000ml量筒中， 注意在混合定容時，一定要最后加入氯化鈣，因?yàn)槁然}與磷酸二

9、氫鉀形成磷酸 三鈣，磷酸鈣之類是不溶于水的沉淀（也可將鈣鹽與鎂鹽單獨(dú)配成母液存放），將配好的定容溶液倒入1000ml廣口瓶中，貼好標(biāo)簽保存于冰箱的冷藏室中。配置培養(yǎng)基時，每配表 1-1 Murashige1L培養(yǎng)基取此母液100ml。和Skoog大量元素的稱量及定容化合物名稱培養(yǎng)基配方用量（mg/L）擴(kuò)大10倍稱量（mg）用于定容KNG190019000NHNO3165016500MgSQ 7H2O(無水 MgSO)370 (190)3700 (1900)KHPO1701700CaCl2 - 2H2Q(無水 CaCb)440 (330)4400 (3300)（二）、微量元素母液（濃縮100倍）

10、的配制MS培養(yǎng)基配方中微量元素共有 7種（表1-2 ），按表中稱取用量，用感量為 0.0001g電子天平，分別稱取后，均放入1000ml的一個燒杯中，加蒸餾水溶解， 然后定容到1L容量瓶。貼好標(biāo)簽，放入冰箱保存。配置培養(yǎng)基時，每配制1L培養(yǎng)基取此母液10ml。表1-2微量元素母液各化合物用量化合物名稱培養(yǎng)基配方用量（mg/L）擴(kuò)大100倍稱量（mg）用于定容MnSO 4HzO (MnSQ - H2O)22.3(16.9)2230(1690)ZnSQ - 7fO8.6860CuSO 5HQ0.0252.5HBO6.2620NqMoO 2HO0.2525KI0.8383C0CI2 - 6HO0.0

11、252.5（三）、鐵鹽母液（濃縮200倍）的配制目前常用的鐵鹽是硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物，必須單獨(dú)配成母液。這種螯合物使用起來方便，比較穩(wěn)定，又不易發(fā)生沉淀。配制方法是：用感 量為O.OIg的電子天平稱取硫酸亞鐵2.78g和乙二胺四乙酸二鈉3.73g分別溶解 在200ml蒸餾水中，兩種溶液混合定容至 500ml，用棕色廣口瓶盛裝，貼標(biāo)簽， 放入冰箱保存。注意：兩種鹽用熱水分別溶解，然后混合，放置于室溫下10小時 以上看是否有沉淀產(chǎn)生，然后才能使用。配置培養(yǎng)基時，每配制1L培養(yǎng)基取此 母液5ml。（四）、有機(jī)物母液（濃縮100倍）的配制在MS培養(yǎng)基中，有機(jī)物配方成 份有維生素和氨基酸（

12、表1-3）。按表1-3 中的用量用電子天平進(jìn)行稱量，分別溶解，混合定容至 100 ml。貼標(biāo)簽，放入 冰箱保存。配置培養(yǎng)基時，每配制1L培養(yǎng)基取此母液10ml。表1-3有機(jī)物母液的稱量化合物名稱培養(yǎng)基配方用量（mg/L）擴(kuò)大100倍稱量（mg）VB（硫胺素）0.44.0VB （鹽酸吡哆醇）0.55.0(NaOH 溶解)VB (煙酸)0.55.0(NaOH 溶解)肌醇1001000甘氨酸220（五）、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（激素）母液的配制（濃度1mg/ml）激素的使用比較靈活，要根據(jù)培養(yǎng)的植物種類和目的而定。為了操作方便， 節(jié)約時間，激素也可如同配制上述母液一樣，先配成濃縮母液（1mg/ml），這樣 配

13、制培養(yǎng)基時只要稍加計算，按需要量取即可。生長調(diào)節(jié)物質(zhì)一般不溶于水，可先用少量不同的溶劑來溶解。 例如，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA ），赤霉素（GA，2, 4-D等生長素和玉米素（Ze） 可先用少量95%酒精助溶，然后再加蒸餾水定容至刻度。激動素（KT）和6-芐 基嘌呤（6-BA）可先溶于少量1mol/L的鹽酸中，葉酸需用少量稀氨水溶解（見 附表2）。用電子天平分別稱量各種生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 50mg并先用相應(yīng)的少量有機(jī)溶劑 進(jìn)行助溶，再加蒸餾水定容至50ml，可得到濃度為1mg/ml的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)母液, 即配制的母液每毫升含有生長調(diào)節(jié)物質(zhì) I.Omg。貼好標(biāo)簽，寫明配制的激素濃度， 存于冰箱

14、保存（04C）。配制培養(yǎng)基時，如每升（1000ml）需添加的生長調(diào)節(jié)劑物質(zhì)為0.5mg時，則 取0.5ml母液即可。注意：各種母液配制好后應(yīng)存放在 4C冰箱中，使用中防止污染和沉淀（貯 存溫度過低時會產(chǎn)生針狀結(jié)晶），發(fā)現(xiàn)有沉淀或霉團(tuán)時，則不能繼續(xù)使用。五、實(shí)驗(yàn)報告1、將本次實(shí)驗(yàn)內(nèi)容整理成實(shí)驗(yàn)報告。2、制備母液時應(yīng)注意哪些問題？為什么？3、 根據(jù)所給母液濃度、蔗糖、瓊脂用量、PH值，按MS配方計算各種母液 吸取量，填入下表：表1-5按MS配方需要量和母液濃度計算各種母液吸取量并填入下表藥品名稱MS配方需要量母液濃度-配制培養(yǎng)基母液吸取量/ml1000ml500 ml300mlF .曰.: 人量元

15、糸10倍液微量兀素1000倍液鐵鹽5ml/LVB（硫胺素）0.4mg/L1mg/LVB6 （煙酸）0.5mg/L1mg/LVB （鹽酸吡哆醇）0.5mg/L1mg/L甘氨酸2mg/L2mg/L肌醇100mg/L20mg/L2，4-D0.5mg/L1mg/LKT1mg/L0.5mg/L蔗糖20g/L瓊脂8g/L實(shí)驗(yàn)三 MS固體培養(yǎng)基的配制及滅菌、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^MS培養(yǎng)基的配制，學(xué)習(xí)培養(yǎng)基配制與滅菌的操作方法。、實(shí)驗(yàn)原理植物材料培養(yǎng)要獲得成功，并正常生長，培養(yǎng)基的組成成分是一個決定性因 素，不同植物要求不同的培養(yǎng)基，因此，在進(jìn)行大量工作之前，對不同培養(yǎng)基應(yīng) 進(jìn)行分析、比較、試驗(yàn)，選擇一個符合實(shí)驗(yàn)材料

16、需要的適宜培養(yǎng)基。大多數(shù)植物組織培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基由無機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)、碳源、維生素、生長調(diào) 節(jié)物質(zhì)和有機(jī)附加物等五類物質(zhì)組成。、實(shí)驗(yàn)儀器、用具及試劑（一）實(shí)驗(yàn)儀器、器皿及用具移液管（槍）、量筒（50ml、500ml）、電爐（或微波爐）、pH值試紙（或 酸度計）、不銹鋼鍋、培養(yǎng)瓶、標(biāo)簽、記號筆、高壓滅菌鍋、 燒杯（ 300ml 、 500ml、 1000ml）、封口膜等。（二）試劑配制 MS培養(yǎng)基的各種母液、6-BA（ 1mg/ml）、2, 4-D （1mg/ml）、0.1NNaoH0.lNHCl 、瓊脂、蔗糖、蒸餾水。四、實(shí)驗(yàn)步驟與方法（一）培養(yǎng)基的配制與分裝1、計算各種母液的用量（按配制1000m

17、lMS培養(yǎng)基計算）根據(jù)配方計算母液用量,以此配方為例： 1L MS+2, 4-D 1.0 mg/L +6-BA 0.5 mg/L +3%蔗糖+ 0.8%瓊脂, PH=5.8。通過計算得：大量元素（10倍）取100ml、微量元素（100倍）取10ml、有 機(jī)物（100倍）取 10ml、鐵鹽（200倍）取 5ml、2, 4-D 取 1.0ml、6-BA取 0.5ml、 蔗糖30g、瓊脂8g。2、每組取 50ml 的燒杯一只,按上述用量用量筒或移液管（不能混用）,量 取或吸取各種母液,放于燒杯中,同時加上激素,備用。3、每組取1000ml的燒杯一只，加300ml蒸餾水，加入瓊脂8g，在石棉網(wǎng) 上加熱

18、熔解，稱取30g蔗糖放入溶解的瓊脂中，同時加入取好的各種母液，用玻 璃棒不斷攪拌混合，并加蒸餾水至 1000ml。4、調(diào)整pH:將培養(yǎng)基攪勻，用PH試紙或PH計測其PH值，可用0.1NHCI 或 0.1NNaOH調(diào)至 5.8。5、培養(yǎng)基分裝、封口：把配制好的培養(yǎng)基趁熱分裝到培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基應(yīng) 占試管或三角瓶的 1/4-1/3 左右為宜；注意不要將培養(yǎng)基沾到管壁上， 以免引起 污染。分裝后立即用封口膜或其他封口物品包扎瓶口， 注明培養(yǎng)基的名稱與配制 時間等。（二）培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基中含有大量的有機(jī)物， 特別含糖量較高， 是各種微生物滋生、 繁殖的 理想場所。 而接種材料需在無菌的條件下培養(yǎng)很長時

19、間， 如果培養(yǎng)基被微生物所 污染便達(dá)不到培養(yǎng)的預(yù)期結(jié)果。 因此，培養(yǎng)基的滅菌是植物組織培養(yǎng)中十分重要 的環(huán)節(jié)。培養(yǎng)基滅菌的方法有多種，這里主要用的是高壓蒸汽滅菌法。1、高壓蒸汽滅菌法將分裝好的培養(yǎng)基及需滅菌的各種用具、 蒸餾水等，放入高壓滅菌鍋的消毒 桶內(nèi)，將外層鍋內(nèi)加水，水位高度不超過支柱高度。蓋好鍋蓋，上好螺絲。加熱 后，當(dāng)壓力表指針移至0.5kg/cm2，扭開放氣閥排出冷氣，使壓力表指針回復(fù)零 位，關(guān)好放氣閥門繼續(xù)加熱。當(dāng)指針移至 1.11.2kg/cm 2時，將火調(diào)小，保持 該壓力1520min(在121C下保持1520min)，切斷電源，緩慢放出蒸汽，即 達(dá)到消毒目的。當(dāng)壓力逐漸降低

20、到零后，才能打開鍋蓋，從鍋中取出滅菌物品， 放入白磁盤，存放于培養(yǎng)室待用。此時鍋及鍋內(nèi)物品都很燙，操作時需戴加厚棉 手套。高壓蒸汽滅菌注意事項(xiàng)：(1) 鍋內(nèi)冷氣必須排盡，否則壓力表指針雖達(dá)到一定壓力，但由于鍋內(nèi)冷 空氣的存在并達(dá)不到應(yīng)有的溫度因而影響滅菌效果。(2) 當(dāng)達(dá)到一定壓力后，注意在保持壓力過程中，嚴(yán)格控制時間，時間過 長會使一些化學(xué)物質(zhì)遭到破壞影響培養(yǎng)基成分，時間短則達(dá)不到滅菌效果。(3) 三角瓶中的液體不超過總體積的 70%否則當(dāng)溫度超過100C時，培養(yǎng) 基會噴溢，造成培養(yǎng)瓶和包頭紙的污染。2、干熱滅菌法(1)洗滌。把組織培養(yǎng)的培養(yǎng)皿、三角瓶、試管等玻璃器皿進(jìn)行徹底清洗。(2)滅菌

21、。把洗滌干凈的玻璃器皿放到烘箱中，在150C溫度下，干熱滅菌1h,或120C 2h。滅菌完畢，待冷卻后取出。五、完成實(shí)驗(yàn)報告1、實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行，按上述方法每組配制1000 ml培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方：MS+2,4-D 1.0 mg/L +6-BA0.5 mg/L + 3% 蔗糖 +0.8%瓊脂)。先配母液，再配培養(yǎng) 基，火菌，備用。2、高壓滅菌時應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？3、計算下列培養(yǎng)基各種母液的用量(ml)培養(yǎng)基MS+NAAO.mg/L+6-BA1.0mg/L +2% 蔗糖(1000ml)1/2MS+NAA1.5mg/L +6-BA2.0mg/L +5% 蔗糖(1000ml)MS+NAA1.0mg/L+6

22、-BA2.0mg/L +3% 蔗糖(500ml)人量元糸微量元素有機(jī)物Fe鹽6-BANAA蔗糖(g)實(shí)驗(yàn)四 外植體的消毒與滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)會外植體的選擇和處理方法，掌握選擇表面滅菌劑的要求，熟練掌握外植 體的滅菌方法、接種前的準(zhǔn)備工作和接種技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理接種用的材料表面，常常附有多種多樣的微生物，這些微生物一旦帶進(jìn)培養(yǎng) 基，就會迅速滋生，使實(shí)驗(yàn)前功盡棄。因此，材料在接種前必須進(jìn)行滅菌。滅菌 時，既要將材料上附著的微生物殺死，同時又不能傷及材料。經(jīng)常使用的滅菌劑有酒精（7075%、次氯酸鈉、過氧化氫、漂白粉、溴 水和低濃度的氯化汞等。 使用這些滅菌劑， 都能起到表面殺菌的作用。 但氯化汞

23、滅菌后，汞離子在材料上不易去掉，必須將材料用無菌水多清洗幾次。消毒劑的種類不同，消毒滅菌的效果不同。因此，選擇消毒劑，既要考慮具 有良好的消毒、 滅菌作用， 同時又易被蒸餾水沖洗干凈或能自行分解的物質(zhì)。 使 用時需要考慮使用濃度和處理時間。三、實(shí)驗(yàn)儀器、用具及試劑（一）實(shí)驗(yàn)儀器、器皿及用具接種工具、 無菌杯、 燒杯、外植體材料、 培養(yǎng)皿、 培養(yǎng)基、 脫脂棉、手推車、 剪刀、鑷子、洗衣粉、毛筆、工作服、拖鞋、記號筆、香皂。（二）試劑70%酒精、 2.0%次氯酸鈉、 10%次氯酸鈣 ，0.1%升汞、無菌水四、實(shí)驗(yàn)方法步驟1、外植體的采集春夏季節(jié)，選擇健壯、 無病蟲害癥狀的外植體。 取材部位最好是幼

24、齡植株的 幼嫩部位。2、外植體的預(yù)處理去掉外植體不用的部位； 剩余部分按培養(yǎng)要求剪成大小合適的材料； 將材料 刷洗干凈；置于流水下沖洗 6 24 小時（ 因材料種類不同而定 ）。3、外植體的滅菌：在超凈工作臺上進(jìn)行。把培養(yǎng)材料放進(jìn)70%勺酒精中浸泡約30s，再在0.1%的升汞中浸泡lOmin, 或在 10%的漂白粉上清液中浸泡 10l5min ，浸泡時可進(jìn)行攪動，使植物材料與 滅菌劑有良好的接觸；然后用無菌水沖洗 35 次。（ 1 ）花藥的滅菌用于組織培養(yǎng)的花藥， 按小孢子發(fā)育時期要求， 實(shí)際上大多沒有成熟， 花藥 外面有萼片、花瓣或穎片、稃片包裹著，通常處于無菌狀態(tài)。所以一般用 70%酒 精

25、對整個花蕾或幼穗浸泡數(shù)秒， 用無菌水清洗 2或 3次，然后將整個花蕾浸泡在 飽和漂白粉上清液中10min,或2.0%次氯酸鈉消毒10min,或用0.1%升汞處理 5-10min左右，處理后用無菌水清洗 35次，然后剝?nèi)〗M織接種。（2）果實(shí)及種子的滅菌根據(jù)果皮或種皮的軟硬結(jié)實(shí)程度及干凈程度而異。對于果實(shí)，一般用2%勺次氯酸鈉溶液浸泡10min,用無菌水沖洗2或3次, 然后解剖內(nèi)部的種子或組織接種；種皮較厚且堅(jiān)硬 的種子，通常用 10%的次氯酸 鈣或 0.1%0.2%升汞浸泡 2030min 或數(shù)小時，或者常規(guī)消毒后無菌水浸泡 30min 至數(shù)小時。另外也可以用砂布打磨、溫水或開水浸煮 5min

26、左右以軟化種 皮。進(jìn)行胚或胚乳培養(yǎng)時，可去掉堅(jiān)硬勺種皮后進(jìn)行常規(guī)消毒。（ 3）莖尖、莖段、葉柄及葉片勺滅菌滅菌方法與花藥勺滅菌方法相同。 對于莖葉， 因?yàn)楸┞对诳罩校?且生有毛或 刺等附屬物，所以滅菌前洗滌至關(guān)重要，尤其是多年生木本材料，要用洗衣粉、 肥皂水等進(jìn)行洗滌，然后用自來水長時間流水沖洗（0.52h）,之后用吸水紙將水吸干，再用 70%酒精漂洗。然后，根據(jù)材料勺老、嫩和枝條勺堅(jiān)硬程度，用 1.010%次氯酸鈉溶液浸泡615min,或用0.1%升汞消毒515min,用無菌水 沖洗 35 次，用無菌紙吸干后進(jìn)行接種。（ 4）根和貯藏器官勺消毒這類材料大多埋于土中, 材料上常有損傷及帶有泥土

27、。 滅菌比較困難。 滅菌 前,要用自來水沖洗, 并用毛刷或毛筆將表面凹凸不平處及芽鱗或苞片處刷洗干 凈,再用刀切去損傷或難以清洗干凈勺部位,用吸水紙吸干后用70%酒精漂洗一下，再用0.10.2%的氯化汞浸泡510min,或用28%次氯酸鈉溶液浸 5 15min,接著用無菌水清洗35次及用無菌濾紙吸干水分，進(jìn)一步切削與消毒液 直接接觸的外部組織,然后接種。在消毒過程中,進(jìn)行抽氣減壓,有助于消毒劑 滲入,可使外植體徹底消毒。五、實(shí)驗(yàn)報告1 、如何對外植體材料進(jìn)行消毒滅菌處理？2、對外植體材料進(jìn)行消毒滅菌應(yīng)注意哪些問題？實(shí)驗(yàn)五、外植體的無菌操作技術(shù)（接種）、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^在超凈工作臺上進(jìn)行無菌操作訓(xùn)練

28、， 使學(xué)生初步掌握組織培養(yǎng)的無菌操 作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理植物組織培養(yǎng)要求嚴(yán)格的無菌條件和無菌操作技術(shù)。 無菌操作是植物組織培 養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)，因?yàn)榕囵B(yǎng)基含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)， 不僅適宜培養(yǎng)材料的生長發(fā)育， 更適合微生物的滋生。 一旦微生物接觸到培養(yǎng)基， 就會迅速生長和繁殖， 不僅大 量消耗營養(yǎng)物質(zhì)， 其繁殖過程中還會形成有毒有害物質(zhì)直接危害植物組織， 甚至 直接利用和消耗植物材料，導(dǎo)致組織壞死直至失去培養(yǎng)價值。三、實(shí)驗(yàn)材料與用具（一）材料任意一種植物的莖尖。（二）實(shí)驗(yàn)儀器、器皿及用具超凈工作臺、接種工具 （ 主要是剪刀、鑷子、解剖刀等 ） 、植物材料（已滅過 菌）、已配制好的培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)四）、酒精

29、燈 （或干熱滅菌器）、酒精噴壺 、天 平、脫脂棉、記號筆、白大褂、工作帽、拖鞋等。（三）試劑70%的酒精、 95%的酒精、無菌水、 2%次氯酸鈉四、實(shí)驗(yàn)方法步驟（一）無菌操作前的準(zhǔn)備工作1、培養(yǎng)室、無菌操作室的清掃和滅菌 （ 參照實(shí)驗(yàn)二 ）2、配制培養(yǎng)基（參照實(shí)驗(yàn)四）3、培養(yǎng)基、接種工具等滅菌（參照實(shí)驗(yàn)二）（二）打開超凈工作臺和無菌操作室的紫外燈，照射3Omin。（三）30min 后，關(guān)閉紫外燈。（四）工作人員接種前用香皂洗凈雙手， 一般洗兩次， 于緩沖間內(nèi)穿上滅菌 的白大褂、 戴上工作帽、換上拖鞋， 將所用物品 （培養(yǎng)基、接種工具、 脫脂棉等） 帶進(jìn)接種室。（五）用 70%的酒精棉球擦拭（或

30、噴霧）工作臺和雙手。（六）將接種器械及其它所用物品放進(jìn)工作臺（將初步洗滌及切割的材料放 入燒杯，帶入超凈工作臺上，用消毒劑滅菌，再用無菌水沖洗，最后瀝去水分， 取出放置在滅過菌的干燥濾紙上）。（七）接種前先用 70%酒精擦拭（或噴霧）培養(yǎng)瓶，然后解開并拿走培養(yǎng)瓶 封口膜，使培養(yǎng)瓶傾斜，并將瓶口置酒精燈火焰區(qū)，轉(zhuǎn)動瓶口烘烤數(shù)秒鐘。（八）左手將培養(yǎng)瓶幾乎水平拿著，用右手拿鑷子夾一塊植物材料（滅過菌 的）送入瓶內(nèi)，輕輕插入培養(yǎng)基上，再將瓶口置酒精燈火焰區(qū)烘烤數(shù)秒鐘后，迅 速蓋上封口膜，綁好瓶口。 （ 每人接種 5-10 瓶）。如果是進(jìn)行培養(yǎng)材料的轉(zhuǎn)接，對培養(yǎng)材料要進(jìn)行合理的分割，然后再接種。操作期間

31、應(yīng)經(jīng)常用 70%酒精擦拭（或噴霧）工作臺和雙手；接種器械應(yīng)反復(fù)在 95%的酒精中浸泡和在火焰 （或干熱滅菌器） 上滅菌，以防止交叉污染。（九）在培養(yǎng)瓶外標(biāo)清培養(yǎng)基編號、培養(yǎng)材料、接種日期，送入培養(yǎng)室。（十）接種結(jié)束后，清理和關(guān)閉超凈工作臺。五、完成實(shí)驗(yàn)報告1、以任意一種植物莖尖為材料，每位同學(xué)接種 3瓶，58芽/瓶。接種一 周后，觀察接種材料的污染情況，并分析發(fā)生污染的原因。2、無菌操作的技術(shù)關(guān)鍵是什么？3、接種時應(yīng)該從哪些方面避免污染？實(shí)驗(yàn)六 園藝植物的莖尖、 莖段培養(yǎng)及微體快速繁殖技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^本次試驗(yàn)，熟練掌握外植體的表面滅菌方法，并鞏固掌握無菌操作的 基本要領(lǐng)， 重點(diǎn)掌握園藝植物

32、的器官的離體培養(yǎng)的基本程序； 同時，掌握園藝植 物微體快繁培養(yǎng)基的設(shè)計和配制。二、實(shí)驗(yàn)原理植物莖尖處于比較幼嫩的部位，其細(xì)胞具有旺盛的生命力，易于培養(yǎng)而獲 得成功。莖尖培養(yǎng)根據(jù)其目的不同， 取材的大小有較大的差異， 較小的僅為十至 幾十微米的莖尖分生組織（獲得無病毒苗） ，較大的可利用幾十毫米的莖尖甚至 更大的芽， 莖尖越大培養(yǎng)越易獲得成功。 如果進(jìn)行植物快速繁殖， 則采用較大的 莖尖，以帶有葉原基的生長為宜，這樣既能提高成活率，又能加快繁殖速度。三、實(shí)驗(yàn)材料及用具（一）實(shí)驗(yàn)材料 選取品種性狀典型，生長健壯無病蟲的園藝植物（葡萄、楊樹、月季、香石 竹、蘭花）優(yōu)良單株的嫩莖切段， 也可以用 頂芽

33、或側(cè)芽。（二）設(shè)備、儀器及用具超凈工作臺、 滅菌鍋、解剖刀、長把鑷子、酒精燈、燒杯、培養(yǎng)皿、移液管、 培養(yǎng)瓶（三）試劑MS 、B5 、White 培養(yǎng)基母液、 70%酒精、 0.1%升汞、 1mg/ml IBA 、1mg/ml 6-BA、 1mg/ml NAA無菌水四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 實(shí)驗(yàn)材料的篩選與處理2. 外植體的誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)3. 無根芽苗的生根培養(yǎng)五、方法和步驟（一）實(shí)驗(yàn)材料的篩選與處理1、培養(yǎng)基的篩選 :通過查閱文獻(xiàn)資料， 根據(jù)所選擇的培養(yǎng)材料每小組同學(xué)任 選其中一種基本培養(yǎng)基， 并確定添加的激素種類和濃度， 制定用于培養(yǎng)的分化培 養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。2、培養(yǎng)基 的配制：參照實(shí)

34、驗(yàn)四3、實(shí)驗(yàn)材料的篩選與滅菌處理各實(shí)驗(yàn)小組在查閱文獻(xiàn)資料的基礎(chǔ)上，分別選擇易于培養(yǎng)的任意一種園藝植物的嫩莖切段510cm，除去葉片，流水沖洗1530mins,浸入75%勺酒精消毒1530秒鐘（視材料的幼嫩程度而定）,無 菌水浸洗后用0.1%的HgCI2浸泡810mins,用無菌水浸洗34遍，用消毒的 濾紙吸干表面水分，備用。（二）外植體的誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)1、無菌外植體的建立： 在無菌條件下,于超凈工作臺上將莖段切成 0.5 1.0cm的帶節(jié)切斷，接種于分化培養(yǎng)基中，每小組接種10瓶，每個培養(yǎng)瓶接種5 6個嫩莖切段，于2426C、20004000lx光照強(qiáng)度下培養(yǎng)，每日光照16h。培 養(yǎng) 15 20

35、 天后，可見一些綠色的芽點(diǎn)和不定芽出現(xiàn)，再培養(yǎng)一段時間后，將出 現(xiàn)叢生苗。2、莖芽的誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)： 為了擴(kuò)大繁殖， 將初次培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)物切割成有 23 個芽的芽叢轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中，每瓶放置34 個芽叢，每小組接種 10瓶，于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。3、 無根芽苗的生根培養(yǎng)：待幼芽長至34cm長時，從芽叢基部剪下并切 割分離單個芽，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)， 一個月后可形成良好的根系。六 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析1、統(tǒng)計初代培養(yǎng)中外植體材料的培養(yǎng)成活率和接種污染率（每瓶按照接種 外植體數(shù)量分別統(tǒng)計） ，并分析造成污染的原因。2、統(tǒng)計繼代培養(yǎng)試管苗的增殖率，并分析激素種類和濃度對試管苗增殖的 影響。分化培養(yǎng)基

36、：MS+6-BA 1.0mg/L+ NAA 0.02mg/L 。實(shí)驗(yàn)七 花藥的離體培養(yǎng)技術(shù)、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)植物花藥的采集、滅菌、接種、培養(yǎng)等一整套花藥培養(yǎng)的具體方法。二、實(shí)驗(yàn)原理花藥培養(yǎng)是植物育種的一種有效方法， 即用離體花藥培養(yǎng)的方法， 使其中的 花粉發(fā)育成一個完整的植株， 由于花粉細(xì)胞的染色體數(shù)目僅為花粉母細(xì)胞或體細(xì) 胞染色體數(shù)目的一半， 稱為單倍體植物。通過這一途徑獲得單倍體后再使之加倍， 就能得到大量無分離的純合二倍體， 從而實(shí)現(xiàn)對雜種后代的早期選擇， 縮短育種 年限。在單倍體細(xì)胞中只有 1個染色體組，表現(xiàn)型和基因型一致， 一旦發(fā)生突變， 無論是顯性還是隱性， 均可在當(dāng)代表現(xiàn)， 從而為準(zhǔn)

37、確研究性狀遺傳規(guī)律和雜種優(yōu) 勢的利用打下基礎(chǔ)。因此單倍體是體細(xì)胞遺傳研究和突變育種的理想材料。 同時， 有的植物花藥培養(yǎng)還能有效脫除母株所帶病毒，獲得無病毒苗。三、實(shí)驗(yàn)材料與用具（一）實(shí)驗(yàn)材料 蘋果、梨、草莓、小麥、玉米、水稻、楊樹、茄子或油菜等植物的花蕾，根據(jù)季節(jié)選擇其中23種。（二）設(shè)備、儀器及用具超凈工作臺、 滅菌鍋、解剖刀、長把鑷子、酒精燈、燒杯、培養(yǎng)皿、移液管、培養(yǎng)瓶、紗布、塑料袋、三角瓶、冰箱、顯微鏡、醋酸洋紅、載玻片、蓋玻片、 各種滅菌、接種、培養(yǎng)用具和器皿等（三）試劑MS 、B5、White 培養(yǎng)基母液、 75%酒精、 0.1%升汞、 1mg/L IBA、1mg/L 6-BA、

38、1mg/L NAA 無菌水。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容每 4 人為一個實(shí)驗(yàn)小組，根據(jù)專業(yè)特點(diǎn)及開課季節(jié)選擇適宜的植物花藥， 完成花藥的預(yù)處理、滅菌、接種及培養(yǎng)過程。五、實(shí)驗(yàn)方法和步驟（一）鏡檢確定花粉發(fā)育期： 本實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)前先采集處于適宜時期的花蕾利用醋酸洋紅壓片法進(jìn)行鏡檢， 確定花粉適宜發(fā)育時期。（二）材料預(yù)處理 采集花粉發(fā)育處于單核中期至晚期的新鮮花蕾，用濕紗布包好放入塑料袋， 置于35C冰箱中預(yù)處理35天，可提高胚狀體的誘導(dǎo)率。（三）培養(yǎng)基制備以MS或N6為基本培養(yǎng)基，通過查閱文獻(xiàn)資料和了解不同激素對植物花藥培 養(yǎng)的誘導(dǎo)作用，各小組篩選確定 2 種適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基（蔗糖 3 6%）和 1 種適 宜的分

39、化培養(yǎng)基（蔗糖 3%）（配制方法參照實(shí)驗(yàn)四）。（四）花藥滅菌及接種 花蕾用自來水及蒸餾水沖洗干凈后在無菌條件下用 75%的酒精浸泡 1020s f無菌水清洗f 0.1%升汞溶液滅菌815min無菌水沖洗35遍無菌濾紙吸 干水分f取出花藥接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（注意不要破壞花藥），每瓶接種2030 個花藥，每個實(shí)驗(yàn)小組每種誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種各 10瓶。（五）初代培養(yǎng) 先將培養(yǎng)瓶置于暗處培養(yǎng) 57 天，再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度 1500 2000IX,每天光照14h，溫度2528C,以誘導(dǎo)形成胚狀體或愈傷組織。（六）誘導(dǎo)分化及再生當(dāng)愈傷組織長到23mm寸，將其及時轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，進(jìn)行植株的分化培 養(yǎng)，誘導(dǎo)

40、再生植株。六 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析1、定時觀察并記錄胚狀體或愈傷組織的誘導(dǎo)情況，統(tǒng)計愈傷組織的誘導(dǎo)率，并比較分析兩種誘導(dǎo)培養(yǎng)基對花藥培養(yǎng)的影響2、觀察并記錄愈傷組織的分化狀態(tài)，統(tǒng)計分化率附錄一、酒精稀釋簡便方法原理是稀釋前后純酒精量相等。即：原酒精體積分?jǐn)?shù)X取用體積=稀釋后的體積分?jǐn)?shù)X稀釋后的體積比如原酒精體積分?jǐn)?shù)為95%,欲配成70%酒精。配制方法為：取95%酒精 70ml （稀釋后的酒精體積分?jǐn)?shù)數(shù)值），加蒸餾水至95ml （原酒精體積分?jǐn)?shù)數(shù)值） 搖勻，即為70%的酒精。附表二、常用生長調(diào)節(jié)劑物質(zhì)和維生素特征表名稱縮寫分子式相對分子量溶劑2, 4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenox

41、 yacetic acid )2,4-DC8H6O3CI2221.04乙醇吲哚乙酸(indole-3-acetic acid)IAAC10H9NO2175.181mol/L NaOH3吲哚丁酸(indole-3-butyric acid)IBAC12H13NO2203.231mol/L NaOHa萘乙酸(anaphthalene acetic acid)NAAC12H10O2186.201mol/L NaOH&苯氧乙酸( naphthoxy acetic acid)性NOAC12H 10。3202.201mol/L NaOH腺嘌吟（adenine）A, Ad, AdeC5H5N5 3H2O18

42、9.13H2O硫酸腺嘌吟(adenine sulphate)AdSO4(C5H5N5)2 H2SO4 2H2O404.37H2O6-芐基腺嘌吟BA , BAP , 6-BAC12H11N 5225.261mol/L NaOH(6-benzyladenine,benzy-laminopurine)異戊烯基腺嘌呤(2-isopentenyl adenine)2ip,IPAC10H13N5203.251mol/L NaOH激動素，動力精（Kinetin）KTC10H9N5O215.211mol/L NaOH玉米素（Ziatin ）ZT,Zt,ZC10H13N5O219.21mol/L NaOH噻苯隆

43、(thidiazuron)TDZ220.2乙醇赤霉素(gibberellin,gibberellic acid)GA 3C19H22O6346.4乙醇脫落酸(abscisic acid)ABAC15H20O4264.31mol/L NaOH秋水仙素（colchicine）C22H25NO6399.4H2O附錄三各種培養(yǎng)基成分表（單位：mg/L）化合物成分培養(yǎng)基White(1963)MS(1962)B5(1966)Nitsch(1969)N6(1974)MT(1969)Heller(1953)ER(1965)RM(1965)KC(1946)NT(1971)Read(1984)MgSO4 7H2o

44、7503702501851853702503703702501233370NaH2PO4 2出019150125CaCl2 2H2O44015016616644075440400220440KCI65750AICI30.03KNO380190025009502830190019001900950202Na2 EDTA 2出037.337.3M oO30.001NH4NO31650720165012004950825400KH2PO417068400170340170250680408NaN03600Na2SO4200(NH 4)2SO4134463500132Ca(NO3)2 4出030010

45、00FeS04 7H2O27.827.827.827.827.827.82527.8Na2 EDTA37.337.337.337.337.337.3FeNa EDTA56MnSO4 4H2o522.3254.422.30.12.2322.37.522.316.9MnSO4 2H2o10KI0.750.830.750.80.830.010.830.83FeCb 6H2O1NiCl2 6H2O0.03CoCl2 6H2O0.0250.0250.0250.00250.0250.025ZnSO4 7H2O38.62101.518.65.68.6CuSO4 5H2O0.010.0250.0250.0250.0250.030.00250.0250.0250.025H3BO31.56.23101.66.