基因工程期末復(fù)習(xí)材料

1、名詞解釋1. 基因工程：通過(guò)基因操作，將目的基因或DNA片段與合適的載體連接轉(zhuǎn)入目標(biāo)生物細(xì)胞， 通過(guò)復(fù)制、 轉(zhuǎn)錄、翻譯外源目的基因以及蛋白質(zhì)的活性表達(dá)， 使轉(zhuǎn)基因生物獲得新的遺 傳性狀的操作。2. 基因克?。?指對(duì)基因進(jìn)行分離和擴(kuò)大繁殖等操作過(guò)程，目的在于獲得大量的基因拷貝3. 載體： 將外源基因引入宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制或表達(dá)的運(yùn)載工具。4. 受體細(xì)胞：能攝取外源重組DNA并使其穩(wěn)定維持和表達(dá)，或有待于實(shí)施遺傳改良的細(xì) 胞。5. 限制性內(nèi)切核酸酶：在細(xì)胞內(nèi)能夠識(shí)別雙鏈 DNA分子中的特定核苷酸序列，并對(duì)DNA分子進(jìn)行切割的一種酶。6. 黏性末端：指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈

2、延伸形成的末端結(jié) 構(gòu)。7. 平末端 ： 限制性內(nèi)切核酸酶在識(shí)別序列的對(duì)稱軸上切割，形成的片段末端。8. 同裂酶： 指來(lái)源不同但識(shí)別相同靶序列的限制性內(nèi)切核酸酶。9. 同尾酶： 指來(lái)源各異， 識(shí)別的靶序列也各不相同， 但切割后能產(chǎn)生相同黏性末端的限制 性內(nèi)切核酸酶。10. 酶的星號(hào)活性： 當(dāng)條件改變時(shí)， 許多限制酶的識(shí)別位點(diǎn)會(huì)改變， 導(dǎo)致識(shí)別與切割序列的 非特異性的現(xiàn)象。11. DNA連接酶：是一種能夠催化雙鏈 DNA上彼此相鄰的3 -OH和5 -P形成磷酸二酯鍵 的核酸酶。12. DNA聚合酶：是指在引物和模板的存在下，將dNTP連續(xù)地加到雙鏈 DNA分子引物鏈的3 -OH末端，催化核苷酸聚合

3、作用的酶。13. 反轉(zhuǎn)錄酶：依賴RNA的DNA聚合酶（RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶）14. 克隆載體：用于攜帶DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制或保存的載體。15. 表達(dá)載體：可攜帶DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯的載體。16. 穿梭載體 ： 可在原核細(xì)胞中復(fù)制，也可在真核細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)的載體17. 質(zhì)粒： 是一種存在于細(xì)菌或真菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA 分子，可自主復(fù)制和表達(dá)。18. 質(zhì)粒的拷貝數(shù)19. 質(zhì)粒的不相容性： 兩個(gè)質(zhì)粒在同一宿主中細(xì)胞不能共存的現(xiàn)象。20. a -互補(bǔ)：lacZ基因產(chǎn)物分為 a鏈和3鏈兩部分，只有當(dāng)兩者都存在時(shí)，才會(huì)表現(xiàn)出 酶活性，該作用稱之為 a-互

4、補(bǔ)作用。21. 插入失活：在一個(gè)基因位點(diǎn)中插入外源 DNA片段，從而使該基因活性喪失的現(xiàn)象。22. 多克隆位點(diǎn) （MCS :包含多個(gè)單一限制性酶切位點(diǎn)的一段很短的DNA序列。23. 瓊脂糖凝膠電泳： 以瓊脂糖為支持物， 在適當(dāng)?shù)臈l件下對(duì)帶電生物大分子進(jìn)行電泳的技 術(shù)，主要用于 DNA分子的分離、純化和鑒定。24. Southern雜交：是先將分布在瓊脂糖凝膠上大小不同的變性DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜上，之后通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)，將濾膜與探針雜交，顯色鑒定。25. 探針： 指能與特定靶分子發(fā)生特異性相互作用， 并能被特殊方法所檢測(cè)的分子。 聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：是以DNA為模板，在引物指導(dǎo)下由 DNA聚合酶催

5、化的對(duì)特定基因片斷進(jìn)行 的體外擴(kuò)增反應(yīng)。26. 引物： 預(yù)擴(kuò)增核酸片段兩端的已知序列，決定特異性。27. 簡(jiǎn)并引物： 由于一個(gè)氨基酸可對(duì)應(yīng)一個(gè)到多個(gè)密碼子， 因此一段氨基酸序列可以有多個(gè) 可能的編碼序列，稱之為簡(jiǎn)并序列。相應(yīng)合成這一段序列作PCRT增體系的引物。28. 目的基因：是基因工程中克隆的目標(biāo) DNA分子，是一段特定序列的 DNA片段，而并不一 定是具有基因完整功能區(qū)的分子。29. 基因文庫(kù)：又稱DNA文庫(kù)，是指某個(gè)生物的基因組DNA或 cDNA片段與適當(dāng)?shù)妮d體在體外重組后， 轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞， 并通過(guò)篩選獲得大量的陽(yáng)性菌落 （或噬菌斑 ） ，所有菌落或噬 菌斑的集合即為該生物的基因文庫(kù)。

6、30. 基因組文庫(kù)：是將某一生物基因組 DNA片段化并全部克隆后所獲得的重組子群體的總 稱，包含了這一生物的全部遺傳信息。31. cDNA文庫(kù)：是將生物特定的組織器官或發(fā)育時(shí)期的全部mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并全部克隆成重組子，在該重組子群集中包含了其全部表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄本。32. 銜接物 ：用化學(xué)方法合成的一段 8-12nt 的含有一個(gè)或數(shù)個(gè)特定限制酶識(shí)別位點(diǎn)序列的 平端雙鏈。33. 轉(zhuǎn)化：指以質(zhì)粒為載體，將外源DNA導(dǎo)入處于感受態(tài)的 E. coli等原核宿主細(xì)胞，并使其獲得新表型的過(guò)程。34. 感受態(tài)細(xì)胞：處于能吸收外源DNA分子生理狀態(tài)的細(xì)胞35. 感染：將以入噬菌體DNA為載體的DNA重組

7、分子包裝成病毒顆粒感染受體菌的過(guò)程； 由噬菌體和細(xì)胞病毒介導(dǎo)的遺傳信息轉(zhuǎn)移過(guò)程也稱為轉(zhuǎn)導(dǎo) （transduction） 。36. 轉(zhuǎn)染： 即轉(zhuǎn)化與感染相結(jié)合，以噬菌體為載體，但不經(jīng)過(guò)蛋白包裝成病毒顆粒，而是用 DNA連接酶使噬菌體DNA環(huán)化，再通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入受體菌。37. 重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子。38. 篩選：經(jīng)過(guò)各種方法將外源 DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞后，獲得所需陽(yáng)性克隆子的過(guò)程稱為克隆子的篩選。39. 閱讀框架：是基因的編碼區(qū)，包含從起始密碼子至終止密碼子之間的cDNA序列。40. 啟動(dòng)子：是RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。41. 增強(qiáng)子：是遠(yuǎn)距離調(diào)節(jié)啟動(dòng)

8、子并提高轉(zhuǎn)錄效率的一段DNA序列。42. 終止子：是為轉(zhuǎn)錄提供終止信號(hào)的一段DNA序列。43. 沉默子：是遠(yuǎn)距離調(diào)節(jié)啟動(dòng)子以降低轉(zhuǎn)錄速率的一段DNA序列。44. 操縱子： 由數(shù)個(gè)功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因及其調(diào)控區(qū) （ 操縱基因、 啟動(dòng)子及其它有調(diào)控功能 的單位 ） 組成。45. 復(fù)制子：是一段包含復(fù)制起始位點(diǎn)和反式因子作用區(qū)在內(nèi)的DNA區(qū)段。46. 植物轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)： 指用于轉(zhuǎn)化的外植體通過(guò)組織培養(yǎng)途徑或其它途徑， 能高效、 穩(wěn)定地再生無(wú)性系，并能接受外源DNA整合，對(duì)轉(zhuǎn)化選擇抗生素敏感的再生系統(tǒng)。47. 胚胎干細(xì)胞 : 是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出的未分化、具有正常二倍體和發(fā)育全能性 的細(xì)胞。48

9、. 細(xì)胞核移植技術(shù) : 是將一個(gè)體細(xì)胞核移植到另一個(gè)體的卵細(xì)胞中去，最終產(chǎn)生一個(gè)與供 體細(xì)胞個(gè)體遺傳性狀一致的動(dòng)物個(gè)體的技術(shù)。 P 223-22449. 基因治療 :是指向目的細(xì)胞引入正常功能的可表達(dá)的基因，從而修正由于基因缺陷所造 成的遺傳性疾病。50. 分子標(biāo)記：能反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，表現(xiàn)為核苷酸序列的任何差異，哪怕是單個(gè)核苷酸的變異。問(wèn)答及填空：1. 基因工程的技術(shù)流程 :? 目的基因克隆? 載體的準(zhǔn)備? 目的基因與載體的連接? 重組DNA轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)? 重組體的篩選與鑒定? 重組體的大量培養(yǎng)，外源基因表達(dá)效應(yīng)分析與開(kāi)發(fā)應(yīng)用2. 基因工程的基本條件

10、: 目的基因、載體、工具酶、受體細(xì)胞(宿主細(xì)胞)3. 基因工程的技術(shù)策略 :(1) .強(qiáng)化基因的表達(dá)，改善生物性狀(2) .關(guān)閉特定基因的表達(dá)，改善生物性狀(3) .基因的異源表達(dá)賦予生物新的功能4. II 型限制性核酸內(nèi)切酶命名原則：1. 用屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成 3 個(gè)字母的略語(yǔ)表示寄主菌的物種名。大腸桿菌( Escherichia coli )用 Eco 表示；流感嗜血菌( Haemophilus influenzae )用 Hin 表示。2. 若該菌有不同的變種或品系，再加上變種或品系的第一個(gè)字母，如EcoRI。3. 如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限制-修復(fù)系統(tǒng)，用

11、羅馬字母表示，如EcoRI,EcoRVo4. 限制酶前面要帶上 R( Restriction)，修飾酶前面要帶上 M( Modification )。 ( 現(xiàn)已省略)5. 產(chǎn)生星活性的原因及影響其酶活性的因素? 導(dǎo)致星號(hào)活性發(fā)生的因素高甘油含量 (5%， V/V) ；限制酶用量過(guò)大(100U/卩g DNA);低離子強(qiáng)度 (pH8.0) ；含有機(jī)溶劑 ( 如二甲基亞砜、乙醇、二甲基乙酰胺等) ；Mrn+、Cu2+、CcT、Zn2+等非M$+的二價(jià)陽(yáng)離子存在。? 抑制星號(hào)活性的方法盡量用較少的酶進(jìn)行完全消化反應(yīng)， 這樣可以避免過(guò)度消化以及過(guò)高的甘油 濃度；盡量避免有機(jī)溶劑的污染；將離子濃度提高到

12、100-150mM；將反應(yīng)緩沖液的pH值降到7.0 ;2+二價(jià)離子用 Mg2+。6. DNA連接酶的種類及作用特點(diǎn)種類：大腸桿菌DNA連接酶、T4DNA連接酶、嗜熱菌 DNA連接酶DNA連接酶催化的連接反應(yīng)特點(diǎn)連接反應(yīng)發(fā)生在一條 DNA鏈的3 -OH端和另一條DNA鏈的5 -P端之間；連接反應(yīng)需要 ATP或NAD和Mf作為輔助因子與激活因子；DNA連接酶不能催化兩單鏈 DNA分子或環(huán)化單鏈DNA分子的連接；只能連接雙鏈 DNA分子的單鏈缺口 (nick)，不能連接雙鏈中的裂口 (gap)。7. 常見(jiàn)工具酶的用途如：DNA聚合酶：? 補(bǔ)齊 5 - 突起端? 合成第二條 cDNA? 除去3-端突起

13、的單鏈 DNA(在無(wú)dNTP時(shí))? 切口移位制備探針?lè)崔D(zhuǎn)錄酶：? 以mRNA為模板合成其互補(bǔ)的 DNA(cDNA)用于構(gòu)建cDNA和基因克隆； ? 對(duì)具5端突出的DNA片段的3凹端進(jìn)行補(bǔ)平和標(biāo)記，制備雜交探針； ? 代替Klenow片段或測(cè)序酶，用于 DNA序列分析。堿性磷酸酶：? DNA或 RNA分子片段5末端的去磷酸化，防止自身連接；在5端標(biāo)記之前，去除DNA或 RNA分子的5末端磷酸基團(tuán)。末端轉(zhuǎn)移酶：? 用于克隆DNA片段，給載體和外源 DNA3末端分別加上互補(bǔ)的同聚物尾巴， 以便二者在體外連接。? 用于DNA片段3末端標(biāo)記，催化a -32P- 3-脫氧核苷酸標(biāo)記 DNA片斷的 3末端；

14、催化生物素等非放射性的標(biāo)記物摻入到DNA片斷的3-末端。? 按照模板合成多聚核糖核苷同聚物。多核苷酸激酶：? DNA 5端磷酸化?標(biāo)記 DNA或 RNA的 5 端8. 質(zhì)粒的基本性質(zhì)： 自主復(fù)制性、不相容性、轉(zhuǎn)移性、攜帶特殊的遺傳標(biāo)記9. 理想質(zhì)粒載體的必備條件和質(zhì)粒載體人工構(gòu)建的策略 理想質(zhì)粒載體的必備條件：? 具有較小的分子質(zhì)量和較高的拷貝數(shù)；? 具有盡可能多限制酶的單一酶切位點(diǎn)；? 具有兩種以上的選擇標(biāo)記基因；? 缺失mob基因；? 插入外源基因的重組質(zhì)粒較易導(dǎo)入宿主細(xì)胞并復(fù)制和表達(dá)。質(zhì)粒人工構(gòu)建的策略 P39-40? 加入合適的選擇標(biāo)記基因，如兩個(gè)以上，易于用作選擇；? 增加或減少合適

15、的酶切位點(diǎn)，便于重組；? 縮短長(zhǎng)度，切去不必要的片段，提高導(dǎo)入效率，增加裝載量；? 改變復(fù)制子 , 變嚴(yán)謹(jǐn)為松弛 , 變少拷貝為多拷貝；? 根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件。10. 入和M13噬菌體的性質(zhì)入噬菌體的性質(zhì)? 是 E.coli 的溫和型噬菌體。? 入噬菌體顆粒中的DNA是一線性dsDNA分子，兩端各有12個(gè)堿基 (5 -GGGCGGCGACCT-)的5凸出黏性末端是互補(bǔ)的。進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞的入DNA通過(guò)兩端的黏性末端配對(duì)形成環(huán)狀的dsDNA這種由黏性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段稱為 cos 位點(diǎn) (cohesive end site) 。? 含有 60 多個(gè)基因，整個(gè)基因組分為三部分

16、11. 入噬菌體載體的構(gòu)建與類型、各種載體承載量的大小。噬菌體載體的構(gòu)建：? 縮短長(zhǎng)度，提高裝載量；? 刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)，增加一些單一的酶切位點(diǎn)；? 加裝選擇標(biāo)記 （ 免疫功能類標(biāo)記和顏色反應(yīng)類標(biāo)記 ） ；? 構(gòu)建琥珀密碼子的突變體。 噬菌體載體的類型： P44-45插入型載體：載體長(zhǎng)度 37kb，插入片段大小 0-14kb （51-37 ）置換型載體：載體長(zhǎng)度 26kb，最小裝載長(zhǎng)度10kb （36-26 ）,最大裝載長(zhǎng)度25kb （51-26 ）12. 提取和純化 DNA的步驟主要有：細(xì)胞裂解和DNA的溶解與保護(hù)；去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)及RNA等雜質(zhì)；DNA的沉淀和純化。13. 如何檢測(cè)

17、、評(píng)價(jià)提取的 DNA質(zhì)量：（一）紫外分光光度法測(cè)定 DNA RNA的濃度和純度? DNA或 RNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在 260nm處有特異的紫外吸收峰，吸收強(qiáng)度不僅與它們 總含量有關(guān)，還與它們的分子形狀、單雙鏈有關(guān)。? 可用OD60/OD280值衡量 DNA/RNA勺純度? 純DNA的OD60/OD280應(yīng)為1.8，大于1.9表明有RNA虧染，小于1.6表明有蛋白質(zhì) 或酚污染；同時(shí) OD60/OD23。應(yīng)大于2.0，小于2.0表明溶液中有殘存的多糖、鹽和 小分子雜質(zhì)等。? 純RNA的OD6o/OD28o應(yīng)介于1.7-2.0 之間，小于1.7說(shuō)明有蛋白質(zhì)或酚的污染，大于2.0表明有異硫氰酸胍殘存

18、；同樣OD6o/OD23。應(yīng)大于2.0，小于2.0表明有小分子及鹽和多糖存在。?（二）瓊脂糖凝膠電泳鑒定?（三）核酸的保存14. DNA電泳的影響因素：? DNA分子大?。悍肿釉酱螅緞?dòng)越慢，遷移速率與線狀DNA分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比。? DNA分子構(gòu)型：超螺旋環(huán)狀線狀切口環(huán)狀。? 凝膠濃度：濃度越高，電泳速率越慢；濃度低的膠線性范圍較寬，濃度高的膠對(duì)小分子 DNA呈較好的線性關(guān)系。? 電場(chǎng)強(qiáng)度：強(qiáng)度高，電泳速度快，但分辨率低。? 凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠（EB）:插入dsDNA造成其負(fù)電荷減少、剛性和長(zhǎng)度增加。對(duì)超螺旋的DNA分子影響較大。15. 分子雜交的主要技術(shù)的原理、步驟及用途，探

19、針的制備方法 分子雜交的基本原理：具有互補(bǔ)特定核苷酸序列的ssDNA或 RNA昆在一起時(shí)，其相應(yīng)同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。把一段已知基因（DNA或RNA）的核酸序列用合適的標(biāo)記物予以標(biāo)記，當(dāng)作探針（probe）,與變性后的單鏈基因組 DNA或 RNA等進(jìn)行雜交。再用合適方法把標(biāo)記物檢測(cè)出來(lái)，就可確定靶核苷酸序列的拷貝數(shù)及表達(dá)豐度等。 探針制備的方法：1. 均勻標(biāo)記：（1）切口平移法標(biāo)記、（2）隨機(jī)引物法（6核苷酸引物標(biāo)記法）、（3） PCRT增標(biāo) 記2. 末端標(biāo)記：5末端標(biāo)記法、3末端標(biāo)記法、T4聚合酶替代法。16. PCR技術(shù)的原理、步驟、體系及引物設(shè)計(jì)的原則PCR技術(shù)的原理：（變性、復(fù)

20、性、半保留復(fù)制）在有DNA單鏈、與DNA單鏈互補(bǔ)的寡核苷酸引物、 dNTPs及DNA聚合酶的情況下，當(dāng)引物與 單鏈的互補(bǔ)區(qū)結(jié)合后，在 DNA聚合酶的催化作用下即可進(jìn)行 DNA單鏈的5 3合成反應(yīng)。 PCR技術(shù)的基本過(guò)程 P79? DNA模板的變性（denatureation）:將待擴(kuò)增 DNA加熱到95C左右，使dsDNA解開(kāi)成 為單鏈并作為模板；? 模板與引物的結(jié)合（退火annealing或復(fù)性）：將體系溫度降至合適溫度（55 C左右）， 使加入的引物與模板 DNA兩端堿基序列互補(bǔ)結(jié)合；? 引物延伸（extension）:將體系溫度升到 72C左右，Taq聚合酶催化dNTP按堿基互 補(bǔ)原則連

21、接在DNA引物3端，使引物延伸，形成兩條與模板互補(bǔ)的新鏈。PCR反應(yīng)的成分：1.緩沖液，2. MgCl 2, 3. dNTPs , 4.引物，5.模板 DNA 6. Taq DNA聚合酶 引物設(shè)計(jì)的 3條基本原則 :引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)； 引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)； 弓I物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)（即錯(cuò)配）。17. 基因文庫(kù)的分類及操作步驟分類：外源DNA片段、載體、宿主基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建程序：? 高純度大相對(duì)分子質(zhì)量基因組DNA的提取和大片段的制備；? 高純度基因組 DNA的部分酶切與脈沖電泳分級(jí)分離；? 載體DNA的制備；? 載體與外源片段的連

22、接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞；? 重組克隆的挑選和保存。18. 基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的優(yōu)缺點(diǎn)? cDNA文庫(kù)的優(yōu)點(diǎn)（與基因組文庫(kù)相比）P 116-117cDNA克隆以mRNA為材料，特別適用于某些 RNA病毒等的基因組結(jié)構(gòu)研究及有關(guān) 基因的克隆分離；cDNA文庫(kù)的篩選比較簡(jiǎn)單易行；假陽(yáng)性的概率比較低；cDNA克隆可進(jìn)行原核表達(dá)；cDNA克隆還可用于真核細(xì)胞 mRNA勺結(jié)構(gòu)和功能研究。? cDNA文庫(kù)的缺點(diǎn)（與基因組文庫(kù)相比）包含的遺傳信息要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于基因組DNA文庫(kù)，并且受細(xì)胞來(lái)源或發(fā)育時(shí)期的影響；不能直接獲得基因內(nèi)含子序列和調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能信息，不能克隆到基因組 DNA中的非轉(zhuǎn)錄區(qū)段序

23、列；cDNA文庫(kù)中，不同克隆的分布狀態(tài)總是反映著mRNA勺分布狀態(tài)，即:高豐度mRNA的cDNA克隆，所占比例較高，分離基因容易；低豐度mRNA勺cDNA克隆，所占比例較低，分離基因困難。19. 外源DNA片段與載體DNA片段連接方式：一、黏性末端的連接（一）同一種酶產(chǎn)生的黏性末端的連接（二）不同種酶產(chǎn)生的黏性末端的連接二、平末端的連接1. 直接連接2. 人工加尾形成“粘性末端”(1) 同聚加尾法(2) 銜接物(linker) 連接法(3) 接頭(adapter)分子連接法三、PCR產(chǎn)物的連接1. 引入酶切位點(diǎn)連接法2. T-A克隆法20. CaCl2法制備細(xì)胞感受態(tài)轉(zhuǎn)化重組DNA的原理及步驟

24、。? 原理：細(xì)菌處于0C的低滲CaCl2溶液中，細(xì)胞膨脹成球形，DNA與 Ca2+結(jié)合形成抗DNase的復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42C短暫熱擊后，細(xì)胞膜形成許多間隙，DNA進(jìn)入細(xì)胞。P139細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞的制備過(guò)程 (CaCl 2):21. 重組子的篩選與鑒定的方法與原理，尤其是插入失活法、-半乳糖苷酶顯色法和核酸雜交法一、載體表型選擇法 :P152-1531. 抗藥性標(biāo)記插入失活選擇法2. 3 -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法二、根據(jù)插入基因的表型選擇法? 原理：外源DNA編碼的基因?qū)λ拗骶晁哂械耐蛔儼l(fā)生體內(nèi)抑制或互補(bǔ)效應(yīng)，從 而使被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞表現(xiàn)出外源基因編碼的表型特征三、DNA電泳檢測(cè)

25、法四、PCR檢測(cè)法? 原理：PCR能在模板序列上擴(kuò)增出預(yù)期DNA片斷。五、核酸雜交檢測(cè)法? 原理：利用標(biāo)記的核酸做探針與轉(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA進(jìn)行分子雜交，可以直接篩選和鑒定目的序列克隆。六、免疫化學(xué)檢測(cè)法 P154-155? 原理：利用抗體作為“探針”來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)入受體菌并且表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基 因。22. 影響外源基因表達(dá)的因素：一、閱讀框架對(duì)轉(zhuǎn)化基因表達(dá)的影響二、順式作用元件對(duì)轉(zhuǎn)化基因表達(dá)的影響三、翻譯過(guò)程對(duì)表達(dá)的影響四、表達(dá)系統(tǒng)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的影響23. 原核與真核生物基因表達(dá)與調(diào)控的特點(diǎn) 原核生物基因表達(dá)調(diào)控的特點(diǎn)：1. 原核生物基因表達(dá)以操縱子為單位。2. 原核生物只有一種 RNA聚合酶。

26、3. 原核生物無(wú)核膜，轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程是偶聯(lián)的。4. 原核生物基因一般不含內(nèi)含子，在原核細(xì)胞中缺乏真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)。5. 原核生物基因表達(dá)的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平 真核生物基因表達(dá)調(diào)控的特點(diǎn)：1. 基因組DNA的存在形式可影響基因表達(dá)，其基因的表達(dá)調(diào)控比原核生物要復(fù)雜得多；2. 真核基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯不是偶聯(lián)在一起的；3. 真核基因表達(dá)的調(diào)控是多層次的；4. 基因表達(dá)具有組織和細(xì)胞類型特異性；5. 不同的真核細(xì)胞在基因表達(dá)調(diào)控中對(duì)信號(hào)分子的反應(yīng)不同。24. 了解植物、動(dòng)物和微生物基因工程的應(yīng)用 植物基因工程的應(yīng)用（一）在植物遺傳改良中的應(yīng)用（二）作為藥物生產(chǎn)的反應(yīng)器 動(dòng)物基因工程的應(yīng)用1. 利

27、用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良動(dòng)物遺傳性狀2. 利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)生物大分子3. 異種器官移植4. 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建醫(yī)學(xué)動(dòng)物模型5. 基因治療 微生物基因工程的應(yīng)用（一）微生物基因工程在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用（二）微生物基因工程在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用（三）微生物基因工程在藥物生產(chǎn)上的應(yīng)用（四）微生物基因工程在環(huán)境保護(hù)上的應(yīng)用25. 常見(jiàn)分子標(biāo)記的種類、原理? 分子標(biāo)記的類型Hibridization-basedmarkers以分子雜交為基礎(chǔ)的DNA標(biāo)記技術(shù)（RFLP標(biāo)記、DNA旨紋技術(shù)、原位雜交）PCR-based markers以PCR反應(yīng)為核心的分子標(biāo)記技術(shù)（RAPE標(biāo)記、SSR標(biāo) 記、SSLP標(biāo)記、SCAR標(biāo)記、

28、AFLP標(biāo)記、STS標(biāo)記）Seque ncing based markers新型的分子標(biāo)記（SNF標(biāo)記、EST標(biāo)記）1. 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 （restriction fragment length polymorphism, RFLP）? 原理：DNA序列上的微小變化，可能引起限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的丟失或產(chǎn)生，導(dǎo)致酶 切片段長(zhǎng)度的變化。2. 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA, RAPD）? 原理：用一個(gè)隨機(jī)引物（8-10個(gè)堿基）非定點(diǎn)地?cái)U(kuò)增基因組 DNA然后用凝膠電泳分 開(kāi)擴(kuò)增片段。3. 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性 （amplified fr

29、agment length polymorphism, AFLP）? 原理：先將基因組 DNA用兩種限制酶切成大小不等的片斷，并與含有粘性末端的人 工接頭相連， 形成不同酶切位點(diǎn)的限制性酶切片段， 然后用與接頭和位點(diǎn)相匹配的 引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物作為進(jìn)一步PCR擴(kuò)增的模板，再選用特異引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳將特異的限制性片段分離。4. 簡(jiǎn)單重復(fù)序列 （simple sequence repeat, SSR）? 原理：根據(jù)兩端序列的保守性，設(shè)計(jì)引物；進(jìn)行 PCR電泳分離，染色顯帶以檢測(cè) 微衛(wèi)星序列多態(tài)性。一、名詞解釋（ 10個(gè)， 20分）二、填空題（ 20 分，

30、每空 1分）三、單項(xiàng)選擇題（ 10題， 10分）四、判斷題（ 10題，10分）五、簡(jiǎn)答題（ 30 分，每小題 6分）六、論述題（ 1 題，10 分）第二章填空題1. 枯草芽孢桿菌蛋白酶；（1）5厶3合成酶的活性；（2）3厶5外切核酸酶2. 堿性磷酸酶； 5端的磷酸基團(tuán)3. DNA聚合酶I： 5 J 3外切核酸酶；5 3合成酶4. S1核酸酶切割；DNA聚合酶補(bǔ)平5. 核酸水解酶 H；RNA6. 5 3合成酶； 3 5外切核酸酶選擇題 1b；2b；3b，c，d，e；4b；5d；6b；7a；8a；9d；10b；11d；12abc； 13a，b；14a；15c；16d；17c；18.B；19. D；

31、20. D；21. D第三章1. 質(zhì)粒載體、噬菌體載體、質(zhì)粒噬菌體混合載體 （或克隆載體、表達(dá)載體、整合載體）2. 復(fù)制區(qū)、選擇標(biāo)記、克隆位點(diǎn)3. 缺少選擇標(biāo)記，克隆位點(diǎn)4. （1）分子量大（2）酶的多切點(diǎn)（3）無(wú)選擇標(biāo)記5. 75% 105%6. T-DNA區(qū)；Vir 區(qū)；Con 區(qū)；Ori 區(qū)7b；8b；9a，c，d，e；10. d20. 答:這種方法是根據(jù)組織化學(xué)的原理來(lái)篩選重組體。主要是載體上帶有一個(gè)來(lái)自大腸桿菌的lac操縱子的DNA區(qū)段，這一區(qū)段編碼 3 -半乳糖苷酶氨基端的一個(gè)蛋白片段。IPTG（異丙基-3 -D-硫代半乳糖苷）可以誘導(dǎo)該片段的合成，而該片段能與宿主細(xì)胞所編碼的3 -半乳糖苷酶羧基端的一個(gè)蛋白片段互補(bǔ) （a -互補(bǔ)）。故暴露于誘導(dǎo)物IPTG的細(xì)菌含有編碼lacZ的質(zhì)?？赏瑫r(shí)合成該酶的兩種片段，該菌在其生色底物 X-gal(5濮-4-氯-3-吲哚-3 -半乳糖苷)的培