2021年動(dòng)物學(xué)研究中流式細(xì)胞分析的運(yùn)用研究

1、 精編范文 動(dòng)物學(xué)研究中流式細(xì)胞分析的運(yùn)用研究溫馨提示：本文是筆者精心整理編制而成，有很強(qiáng)的的實(shí)用性和參考性，下載完成后可以直接編輯，并根據(jù)自己的需求進(jìn)行修改套用。動(dòng)物學(xué)研究中流式細(xì)胞分析的運(yùn)用研究 本文關(guān)鍵詞：動(dòng)物學(xué), 研究, 流式, 細(xì)胞, 分析動(dòng)物學(xué)研究中流式細(xì)胞分析的運(yùn)用研究 本文簡(jiǎn)介：摘要：指出了流式細(xì)胞分析(Flowcytometry,FCM)是運(yùn)用流式細(xì)胞儀對(duì)液相中懸浮細(xì)胞或微粒進(jìn)行研究的新興技術(shù)。目前已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域,它具有檢測(cè)速度快、靈敏度高,且操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。介紹了流式細(xì)胞儀的發(fā)展及其原理,闡述了流式細(xì)胞分析在動(dòng)物學(xué)研究中的應(yīng)用,包括在水生動(dòng)物、哺乳動(dòng)物以動(dòng)物

2、學(xué)研究中流式細(xì)胞分析的運(yùn)用研究 本文內(nèi)容：摘要：指出了流式細(xì)胞分析 (Flow cytometry, FCM) 是運(yùn)用流式細(xì)胞儀對(duì)液相中懸浮細(xì)胞或微粒進(jìn)行研究的新興技術(shù)。目前已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域, 它具有檢測(cè)速度快、靈敏度高, 且操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。介紹了流式細(xì)胞儀的發(fā)展及其原理, 闡述了流式細(xì)胞分析在動(dòng)物學(xué)研究中的應(yīng)用, 包括在水生動(dòng)物、哺乳動(dòng)物以及動(dòng)物病理學(xué)研究等方面的應(yīng)用, 并對(duì)其進(jìn)行了總結(jié)與展望, 為流式細(xì)胞分析的進(jìn)一步發(fā)展提供參考, 以期流式細(xì)胞儀在動(dòng)物學(xué)研究中得到更好的發(fā)展。關(guān)鍵詞：流式細(xì)胞分析; 流式細(xì)胞儀; 動(dòng)物學(xué);1 引言流式細(xì)胞分析是利用流式細(xì)胞儀對(duì)熒光分子標(biāo)記的動(dòng)植

3、物細(xì)胞、細(xì)菌、病毒以及其中的DNA、RNA、各種蛋白或其它分子進(jìn)行研究, 也可用于研究塑料微球或其他懸浮于液體中的微粒, 是對(duì)液相中的細(xì)胞或微粒進(jìn)行參數(shù)快速分析和分選的技術(shù)1。流式細(xì)胞儀集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)以及細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體2, 靈敏度高、測(cè)量速度快、被測(cè)群體大且能進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量, 即對(duì)同一個(gè)細(xì)胞做有關(guān)物理、生物化學(xué)特性的多參數(shù)測(cè)量35。目前已廣泛運(yùn)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、材料學(xué)等領(lǐng)域, 特別是在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域得到較快的發(fā)展。在生物學(xué)中, 流式細(xì)胞儀用于植物研究中較少, 而在動(dòng)物學(xué)中的應(yīng)用相對(duì)較多。2 流式細(xì)胞儀的發(fā)展及原理1934年, And

4、rew Moldaran開始了流式細(xì)胞分析的第一步, 他通過顯微鏡技術(shù), 發(fā)明了一個(gè)能讓細(xì)胞通過毛細(xì)管, 并能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)的儀器1。1953年, Parker和Hutcheon描述一種全血細(xì)胞計(jì)數(shù)器裝置, 成為了流式細(xì)胞儀的雛形6。1967年, Kamentsky和Melamed在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了分選儀器, 它能給注射器提供電刺激, 從液流中找出目標(biāo)細(xì)胞, 再進(jìn)行觀察分析, 這就是流式分選的雛形1。1969年, Marvin van Dilla報(bào)道了第一臺(tái)熒光檢測(cè)的流式細(xì)胞儀, 它用氬離子激光作為光源, 包括照射、電子檢測(cè)以及液流系統(tǒng)1。后來, 流式細(xì)胞儀朝著能檢測(cè)和分選不同類型細(xì)胞的大型機(jī)以

5、及功能越來越強(qiáng)大、系統(tǒng)穩(wěn)定發(fā)展的小型機(jī)兩個(gè)方向發(fā)展1。流式細(xì)胞儀的原理:目前使用的流式細(xì)胞儀包括4個(gè)系統(tǒng):液流系統(tǒng)、光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)、電子控制系統(tǒng)以及分析系統(tǒng)1。具有分選功能的流式細(xì)胞儀還具有分選系統(tǒng)7。其原理是進(jìn)行熒光染色的懸浮細(xì)胞或微粒在壓力下, 經(jīng)鞘液包繞形成鞘流, 依次進(jìn)入流式照射室的檢測(cè)點(diǎn), 氬離子激光照射細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光, 其信號(hào)強(qiáng)弱與細(xì)胞內(nèi)待測(cè)組分含量成正比1,6。散射光和熒光被前向光電二極管和側(cè)向90°方向的光電倍增管接收放大后轉(zhuǎn)化成電信號(hào), 再經(jīng)轉(zhuǎn)換器形成數(shù)據(jù)文件, 儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī)上, 以備脫機(jī)后的數(shù)據(jù)處理和分析7。流式細(xì)胞儀的分選原理:具有分選功能的流式細(xì)胞儀通過細(xì)胞

6、分選器分離含有單細(xì)胞的液滴完成細(xì)胞分選檢測(cè)。由噴嘴噴射出的液流柱經(jīng)高頻的壓電晶體產(chǎn)生高頻振蕩, 斷裂形成均勻的液滴, 根據(jù)選定的參數(shù)判明是否將被分選, 而后對(duì)選定的細(xì)胞液滴充上正或負(fù)電荷, 當(dāng)帶電液滴通過靜電場(chǎng)發(fā)生偏轉(zhuǎn), 后落入收集器中, 通過不同孔徑的噴孔及液流速度, 實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分選6,8。3 流式細(xì)胞分析在動(dòng)物學(xué)中的應(yīng)用近年來, 隨著生物學(xué)研究的深入, 流式細(xì)胞分析作為一種重要輔助研究的方法被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域, 特別是動(dòng)物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。我國對(duì)流式細(xì)胞儀的研發(fā)起步較晚。1981年, 北京師范大學(xué)生物系引進(jìn)了國內(nèi)第一臺(tái)流式細(xì)胞儀7。此后, 流式細(xì)胞分析不僅在科研領(lǐng)域, 而且在臨床醫(yī)學(xué)

7、等領(lǐng)域得到了較快的發(fā)展。流式細(xì)胞分析最早用于細(xì)胞的分選以及血細(xì)胞的分類研究。1975年, Gray9首次運(yùn)用流式細(xì)胞儀觀察用DNA熒光染料染色的中國倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus) 細(xì)胞中的染色體, 根據(jù)染色體上染色含量的不同將單個(gè)染色體進(jìn)行分揀。1984年, De Laat和Blass10首次報(bào)道了運(yùn)用流式細(xì)胞分析識(shí)別和分揀植物染色體。國內(nèi)最早的流式細(xì)胞分析應(yīng)用是許秀芹, 王宜艷11等學(xué)者, 其利用流式細(xì)胞分析將海灣扇貝、蝦夷扇貝、太平洋牡蠣等的血細(xì)胞分成透明細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞和大顆粒細(xì)胞3個(gè)亞群。3.1 流式細(xì)胞分析在水生動(dòng)物中的應(yīng)用流式細(xì)胞分析早期應(yīng)用于

8、水生生物的研究中。沙愛龍1在Ashton-Alcox12與劉東武13等國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用流式細(xì)胞分析將美洲牡蠣、中國蛤蜊和紫石房蛤的血細(xì)胞分為3類的基礎(chǔ)上, 利用流式細(xì)胞儀將短蛸的血細(xì)胞分為大透明細(xì)胞、小透明細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞和大顆粒細(xì)胞4種類型, 他的研究表明與王晶14的活體染色方法相比, 流式細(xì)胞分析更為方便可行, 研究結(jié)果也更為精確。此外, 沙愛龍1還概述了流式細(xì)胞分析在水生無脊椎動(dòng)物細(xì)胞免疫學(xué)、染色體核型分析、無脊椎動(dòng)物細(xì)胞核等方面的應(yīng)用, 并提出隨著流式細(xì)胞儀的發(fā)展, 它將會(huì)應(yīng)用到無脊椎動(dòng)物的生殖與遺傳研究中, 推動(dòng)其分子細(xì)胞水平的研究。高如承15等就流式細(xì)胞分析在水生動(dòng)物細(xì)胞分類、分選、

9、細(xì)胞免疫功能、DNA研究以及精子質(zhì)量評(píng)價(jià)方面進(jìn)行了綜述。流式細(xì)胞儀能快速、準(zhǔn)確地量化大量單細(xì)胞的形態(tài)和功能, 能更好地了解雙殼類機(jī)體的免疫狀況, 從而保證養(yǎng)殖業(yè)更好地發(fā)展。Michael等在單細(xì)胞水平上利用熒光標(biāo)記及流式細(xì)胞儀對(duì)美國東部的牡蠣防御機(jī)制進(jìn)行了量化, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞的吞噬活性和呼吸爆發(fā)活力最強(qiáng), 中間顆粒細(xì)胞次之, 透明細(xì)胞無活性15,16。Helene Hegaret17等應(yīng)用流式細(xì)胞分析對(duì)牡蠣血細(xì)胞的凝集、吞噬作用、生存能力以及呼吸爆發(fā)等功能在溫度升高 (2028) 前后進(jìn)行研究, 發(fā)現(xiàn)粒細(xì)胞具有較高的免疫性, 有可能在免疫防御中起關(guān)鍵作用18。應(yīng)用流式細(xì)胞分析進(jìn)行染色體核型

10、分析是在1975年首次使用流式細(xì)胞儀的基礎(chǔ)上逐漸發(fā)展起來的, 與傳統(tǒng)核型分析相比, 它操作更為簡(jiǎn)單準(zhǔn)確, 且流式細(xì)胞分析還能對(duì)染色體進(jìn)行純化, 得到克隆實(shí)驗(yàn)所要求的染色體, 這是目前其他技術(shù)無法完成的2。測(cè)定細(xì)胞DNA含量時(shí), 用DNA特異性熒光染料對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色后, 利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè), 激光激發(fā)后, 熒光強(qiáng)度與細(xì)胞DNA含量成正比, 因此可得到被測(cè)細(xì)胞的DNA含量, 從而可進(jìn)行染色體倍性鑒定, 但必須用已知DNA含量的細(xì)胞群體做參照15,19。流式細(xì)胞分析還可用于生物精子質(zhì)量評(píng)價(jià), 但其在水生生物精子評(píng)價(jià)中利用較少20,21。高如承15綜述了國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用流式細(xì)胞分析評(píng)估水生動(dòng)物精子

11、的質(zhì)膜完整性及線粒體活性的報(bào)道, 但細(xì)胞凋亡方面未見報(bào)道, 主要報(bào)道是對(duì)其它細(xì)胞的凋亡研究, 流式細(xì)胞分析在此方面的應(yīng)用多見于哺乳動(dòng)物。3.2 流式細(xì)胞分析在哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用流式細(xì)胞儀目前已成為生物研究中廣為用之的儀器, 它不僅能用于水生生物的血細(xì)胞分類、分選、細(xì)胞免疫機(jī)制、染色體核型分析等方面, 而且在哺乳動(dòng)物研究中的運(yùn)用更為廣泛。3.2.1 分離哺乳動(dòng)物的精子人為地對(duì)精子類型進(jìn)行選擇, 產(chǎn)生人類期望的性別后代, 能促進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展。哺乳動(dòng)物 (家畜) 中, 有兩條染色體, 后代性別主要由父代的X/Y染色體決定, 通常X精子的DNA含量比Y精子多3.0%4.5%22,23。應(yīng)用用流式細(xì)胞分析

12、對(duì)哺乳動(dòng)物的精子進(jìn)行分離, 可獲得高純度的X/Y精子群24, 且分離速度快、準(zhǔn)確性高。其原理是根據(jù)DNA含量的差異及所結(jié)合的熒光染料激發(fā)的熒光強(qiáng)度差別分辨出X、Y精子, 利用流式細(xì)胞儀的分選原理, 通過產(chǎn)生振蕩, 將液流斷裂形成含X或含Y精子的均勻液滴, 然后充上正 (X精子) 或負(fù)電荷 (Y精子) , 經(jīng)電場(chǎng)力的引導(dǎo)落入不同的收集器中, 即可分離精子24,25。1989年首次采用了流式細(xì)胞分析分離了兔的XY精子, 隨后, 這一技術(shù)逐漸應(yīng)用于豬、牛、羊的精子分離26。高慶華27運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)初步建立了山羊、梅花鹿和馬鹿分選精液的低劑量受精技術(shù)體系且進(jìn)一步采用扣除雜交篩選奶牛精液, 初步獲得牛X

13、Y精子間的差異表達(dá)基因。曲蕾22等綜述了流式細(xì)胞分析在哺乳動(dòng)物精子分離中的應(yīng)用以及影響精子分離效率的因素, 她指出染色液及流式細(xì)胞儀在分離時(shí)對(duì)精子活力有一定影響, 所以應(yīng)選擇適當(dāng)濃度的染色液。馬利兵26等提出了流式細(xì)胞分析在分離哺乳動(dòng)物的性別中的注意事項(xiàng), 表明對(duì)分離后的精子采用自然沉淀法進(jìn)行濃縮可避免精子活力下降。3.2.2 檢測(cè)哺乳動(dòng)物精液質(zhì)量通過精液質(zhì)量檢測(cè)測(cè)定精子的活力, 在臨床不孕癥治療及家畜繁殖中具有重要作用。利用流式細(xì)胞分析檢測(cè)反映精子活性的多個(gè)指標(biāo), 例如精子質(zhì)膜完整性、頂體狀態(tài)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性等, 測(cè)定精子的生育能力, 這種方法適合自然狀態(tài)下的精子檢測(cè), 需結(jié)合熒光顯微鏡,

14、 與傳統(tǒng)方法相互驗(yàn)證使用, 其檢測(cè)速度快, 且便捷準(zhǔn)確28。3.2.3 流式細(xì)胞分析與細(xì)胞增殖、凋亡何旦莎30等采用流式細(xì)胞儀對(duì)經(jīng)特異性熒光染料染色不同年齡的大鼠腦組織的DNA進(jìn)行含量的測(cè)定, 結(jié)果表明, 不同年齡不同部位的腦組織增殖程度不同, 且同一部位的腦組織在不同年齡階段, 增殖情況也存在差異。也可利用流式細(xì)胞分析對(duì)DNA含量、線粒體膜、Ca2+濃度進(jìn)行檢測(cè), 分析細(xì)胞凋亡情況30。王磊31等利用流式細(xì)胞分析對(duì)正常大鼠紅細(xì)胞、老齡大鼠紅細(xì)胞以及2型糖尿病大鼠紅細(xì)胞進(jìn)行研究, 對(duì)比生理和病理兩種情況對(duì)紅細(xì)胞凋亡的影響, 結(jié)果顯示:糖尿病大鼠大量紅細(xì)胞存在凋亡, 且血液黏稠度增大, 其他兩類

15、大鼠紅細(xì)胞不存在凋亡。因此, 可以看出紅細(xì)胞凋亡與年齡無關(guān), 而與血液黏度有關(guān)。同樣, 也可利用流式細(xì)胞分析顯示DNA含量直方圖, 分析細(xì)胞周期, 但它只能分辨出G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞32。后來, 覃吉超33等在Cyclin的時(shí)相性表達(dá)理論34基礎(chǔ)上建立了Cyclin E+A/DNA多參數(shù)FCM, 實(shí)現(xiàn)了將細(xì)胞周期分為6個(gè)時(shí)期的細(xì)胞群體, 尤其是促進(jìn)了G1期的進(jìn)一步研究。3.3 流式細(xì)胞儀在動(dòng)物病理學(xué)研究中的應(yīng)用3.3.1 在動(dòng)物免疫疾病中的應(yīng)用對(duì)CD抗原的分析可以反映淋巴細(xì)胞的分型和機(jī)體的免疫狀態(tài)35。淋巴細(xì)胞可分為T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等幾類36,37。根據(jù)CD3、C

16、D19在T、B淋巴細(xì)胞上的作用, 以及CD19在B淋巴細(xì)胞分化為成熟的漿細(xì)胞之后會(huì)丟失, 可利用流式細(xì)胞分析檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面的CD3和CD19, 從而計(jì)算淋巴組織中T、B細(xì)胞的含量38。外周血T淋巴細(xì)胞亞群 (CD4+/CD8+) 在機(jī)體正常情況下比值是一定的, 約21, 但是當(dāng)機(jī)體細(xì)胞免疫力低下時(shí)會(huì)出現(xiàn)比例下降25,35。這可用于檢測(cè)機(jī)體免疫疾病, 例如, 人體被HIV感染后, 大量CD4+細(xì)胞被破壞, 其比值小于1。但是當(dāng)自身免疫功能亢奮時(shí)會(huì)引起如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫疾病35。楊蕾芳39等利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠感染附紅細(xì)胞后, 在不同組不同時(shí)間段CD4、IL-17的表達(dá)變化, 探討Th

17、17細(xì)胞發(fā)揮的免疫學(xué)功能。結(jié)果表明小鼠感染附紅細(xì)胞后Th17細(xì)胞增多, 因此推測(cè)Th17細(xì)胞可能在附紅細(xì)胞體感染過程中發(fā)揮了一定的免疫調(diào)節(jié)。屈雪琪40等利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同方式處理以及不同保存時(shí)間的豬淋巴細(xì)胞, 探討其對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群中CD3+、CD4+、CD8+亞群的影響。3.3.2 流式細(xì)胞分析在巨噬細(xì)胞功能檢測(cè)中的作用巨噬細(xì)胞具有吞噬、清除及呈遞抗原異物的生物學(xué)功能, 屬于免疫系統(tǒng)的重要成員, 是維持機(jī)體的正常生理狀態(tài)所必需的, 其與許多重大疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。1982年, Steinkamp首創(chuàng)熒光微球流式細(xì)胞分析定量檢測(cè)吞噬功能, 目前, 流式細(xì)胞分析在單核巨噬細(xì)胞吞噬功能研

18、究中得到廣泛應(yīng)用。黃瓊41等利用流式細(xì)胞儀觀察在不同處理溫度、不同孵育時(shí)間下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球或熒光素標(biāo)記大腸桿菌的能力, 結(jié)果表明, 在一定范圍內(nèi), 隨著溫度及孵育時(shí)間的延長(zhǎng), 吞噬百分率會(huì)增大。流式細(xì)胞分析檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬能力較傳統(tǒng)方法更準(zhǔn)確, 且快速、高效, 可應(yīng)用于評(píng)價(jià)保健食品對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響41。金齊力等42通過不同濃度熒光素標(biāo)記結(jié)核分枝桿菌以及不同孵育時(shí)間的實(shí)驗(yàn), 建立流式細(xì)胞分析檢測(cè)單核巨噬細(xì)胞吞噬熒光素標(biāo)記結(jié)核分枝桿菌的方法, 表明該方法簡(jiǎn)便、快速且重復(fù)性好。3.3.3 流式細(xì)胞分析在血小板聚集功能檢測(cè)與臨床醫(yī)學(xué)20_年, 國外學(xué)者報(bào)道了一種基于流式細(xì)胞分析檢

19、測(cè)血小板聚集率的新方法43。在此基礎(chǔ)上, 梅金平44等用CD61-PE和CD61-PITC標(biāo)記經(jīng)ADP、川芎嗪等處理后的小鼠血小板, 通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩種熒光染料的細(xì)胞群占所有血小板的百分比來評(píng)估血小板的聚集功能。結(jié)果顯示, 不同處理對(duì)小鼠血小板的影響不同。小鼠作為一種模式生物, 與人類親源性較高, 基于流式細(xì)胞分析的小鼠血小板聚集活性檢測(cè)方法, 在臨床醫(yī)學(xué)上對(duì)血小板相關(guān)的基礎(chǔ)研究以及抗血小板藥物篩選平臺(tái)具有借鑒價(jià)值。流式細(xì)胞儀在臨床醫(yī)學(xué)中最早應(yīng)用于腫瘤學(xué)中, 通過對(duì)DNA含量變化的測(cè)定, 對(duì)癌變過程作出判斷, 這利于癌前病變的有效措施, 在以后的化療過程以及預(yù)后評(píng)估等工作中也能起到指導(dǎo)作用4547。流式細(xì)胞分析也可用于檢測(cè)人體器官移植后的排斥反應(yīng), 通常檢測(cè)受體器官與供體器官二者血清中是否有相同的抗體或者檢測(cè)移植后受體的免疫狀態(tài)48,49。4 總結(jié)與展望流式細(xì)胞分析最早用于水生動(dòng)物血細(xì)胞的分類及分選, 之后在哺乳動(dòng)物中得到廣泛應(yīng)用。本文綜述了流式細(xì)胞分析在水生生物、哺乳動(dòng)物以及在動(dòng)物病理學(xué)中的應(yīng)用。因流式細(xì)胞儀檢測(cè)速度快、靈敏度高且能進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量, 隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展以及流式細(xì)胞分析的成熟, 流式細(xì)胞儀不僅在生物學(xué)中取得良好發(fā)展, 尤其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。生物學(xué)與醫(yī)學(xué)是相輔相成的, 生物學(xué)是醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ), 尤其動(dòng)物學(xué)與醫(yī)學(xué)是