Roche-LightCycler-480-中文操作說明

1、Roche-LightCycler-480- 中 文 操作說明LightCycler? 480 中文操作說明羅氏醫(yī)學儀器公司 / 應用科學部門February 2008LightCycler 480中文操作說明目錄一 . 啟動機器與軟件3二 . 軟件設定 - 開啟新實驗5三 . 樣品編輯9四 . 結(jié)果分析12五 . 報告18六 . 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移至其它計算機 （數(shù)據(jù)輸出與輸入 ） 19七 . 使用者管理19LightCycler 480中文操作說明啟動機器與軟件啟動機器1. 機器主開關(guān)位于機器右后方。2. 機器正面兩個警示燈代表機器狀態(tài)。 待警示燈 （右） 由閃爍橘色燈轉(zhuǎn) 變成穩(wěn)定橘色燈，警示燈 （

2、左） 由橘色轉(zhuǎn)變成綠色 （約三分半鐘 ）， 表示機器已經(jīng)啟動完成。左警示燈右警示燈機器狀態(tài)橘 * 閃爍 *橘 * 閃爍 *正在初始化綠橘機器啟動完成96/384孔盤還未放入綠橘 * 閃爍 *96/384 孔盤正在放入中綠綠機器啟動完成96/384 孔盤已經(jīng)放入綠 *閃爍 *綠 * 閃爍 *實驗進行中3LightCycler 480中文操作說明3. 按壓機器正面上唯一的按鈕，放入已經(jīng)封膜完成之96或384孔盤。放置完成后，左右兩警示燈都呈現(xiàn)綠色。啟動軟件1.開啟計算機，并以正確的使用者名稱與密碼登入WindowsoUser name: OPERATOR Password: LC4802.開啟Li

3、ghtCycler 480軟件，并輸入正確的使用者與密碼。LoginQPUons | ILightCycler 480中文操作說明二軟件設定一開啟新實驗設定新實驗1.軟件開啟后，會進入主畫面。點選“New Experiment”。7 Lthttyderbottwarerelease 1 .V.U6Z52. 出現(xiàn)實驗設定窗口。任何時候需要回主畫面的話，點選畫面右邊的 按鈕。產(chǎn);打;I 0MC*0 Fmat I. ：L SXMfi X3) I 釈 wock typoRon Moteplus ID IPiOQfjm Mem4- - -ra*in*-.-* .-3-ao&emxtxeg ourv*TS

4、*1Melti&g Curv；AbmCycle*AaMh LINhlTkCQAcquit MonHold pit criiBttl Rafvp RateAcuhitl(m |pe *Q Sec fQ Stop Sue fQ Step OUy (eyelet) WCgtt :0a/ 一設定實驗若要套用設定好的實驗步驟 (Template)，請?zhí)?6.。1. 在實驗設定畫面上方，先選擇適當?shù)?Detection Format。選項包含 :另外可再點選“Customize”勾 選所需的濾片組合。2. 輸入反應體積 : 96 well plate 范圍為 10-100 ul，而 384 well p

5、late 范 圍為 5-20 ul。LightCycler 480中文操作說明3. 設定實驗步驟 (Program)設定 program，包含有 Pre-incubation, Amplification (PCR), Melting curve (optional) 與 Cooling。利用 +與 增加 或刪除步驟。設定循環(huán)數(shù)目 (Cycle) 與分析模式。通常 Amplification (PCR) program 設定成 Quantification，而 Melting Curve program 設定成 Melting Curve 。4. 設定詳細溫度變化 (依照不同實驗方法與設計而有

6、所不同 )點選各個 program 即可設定詳細溫度變化步驟，請根據(jù)產(chǎn)品說 明書來設定，利用 +與 增加或刪除步驟。需要設定 的參數(shù)包含 Target ( ) 目標溫度， Acquisition Mode (熒光偵測 模式)，Hold (hh:mm:ss) 停留時間。 Ramp Rate (/s) 為升降溫 速度，范圍如下：Ramp Rate ( /s)Heating up Cooling downLightCycler 480中文操作說明96-well Block1.0 4.4 /s1.0 2.2 /s384-well Block1.0 4.8 /s1.0 2.5 /s若設定溫度低于 50，

7、請把 Ramp Rate 調(diào)整成 1.5/s (96 well) 或 2.0/s (384 well)。5. 將實驗步驟儲存成 Template以便下次進行套用。點選左下角“Save As Template” 即可把此步驟儲存起來。6. 若要進行套用時，請直接點選窗口左下角 “Apply Template” ，選擇欲套用之實驗步驟 即可。7. 設定完成后點選 “Start Run” 開始進行實驗8. 跳出檔案儲存窗口，請輸入欲儲存之文件名稱。實驗進行中會進入另一個 Data 窗口，窗口下方按鍵功能如下：End Program : 結(jié)束此 Program, 進入下一個 Program。+ 10

8、Cycles : 實時增加循環(huán)數(shù)目。Abort Run: 馬上結(jié)束此實驗，請注意，若按此鍵，則此次實驗的結(jié)果將不 儲存。LightCycler 480中文操作說明LightCycler 480中文操作說明三樣品編輯將樣品分群1. 點選窗口左邊的 “Subset Editor”。2. 點選“New” 新增新的群組，并將其命名。3. 利用鼠標選取此群組之樣品位置， 點選窗口右下角 “Apply”，此時 被選取的樣品位置會呈現(xiàn)實心的藍色，如下圖。4. 以此方式依序?qū)⑺袠悠啡航M編輯完畢。樣品必須分群才能夠獨立分析，但是樣品是否分群并不影響樣品 的 Cp 值。LightCycler 480中文操作說明

9、編輯樣品名稱1. 點選窗口左邊的 “Sample Editor”。2. 輸入每個位置之樣品名稱 (Name)與重復 (Repl. Of) 。3. 若要更快速輸入，可直接在左邊的圖上點選欲編輯之樣品：若 A1, A2 與 A3 為三重復，在 A2 與 A3 Repl. Of 字段上都填上 A1 即為三重復。在編輯過程中，可利用 Ctrl+C復制文字， Ctrl +V 貼上文字。LightCycler 480中文操作說明4. 根據(jù)實驗分析模式，編輯 Abs Quant (絕對定量 )，Rel Quant (相對 定量)，或 Genotyping 分頁，設定 Sample Type。絕對定量 (Ab

10、s Quant)：相對定量 (Rel Quant)：Target: 目標基因Reference: 參考基因Unknown:未知濃度樣品Standard: 已知濃度標準品Calibrator : Control 樣品 Standard : 已知濃度的樣品 Unknown:未知濃度樣品其它分析模式之分頁在此不贅述，請自行參考 LightCycler 480 Instrument Operator s Mal 。nua5. 若設定成Standard之樣品請輸入濃度。6. 若想要將此樣品編輯儲存成 Template，可點選窗口左下角 “Save As Template” 即可，下次實驗時可點選 “Ap

11、ply Template”進行套 用。LightCycler 480中文操作說明LightCycler 480中文操作說明四結(jié)果分析點選左邊的 “Analysis”，選取分析模式，并選擇所需分析之 群組，如下圖：3.3.2.分析模式 說明Abs Quant / 2nd Derivative Max Abs Quant / Fit Points Color CompensationGene ScanningGenotypingRelative QuantificationTm Calling絕對定量 （自動法 ）絕對定量 （手動法 ）色差校正 （多色實驗校正用 ） 基因掃描 （適用于 High

12、Resolution Melting Curve, HRM 分析）基因分型 （適用于 HybProbe 之 基因分型實驗 ）相對定量Tm 分析LightCycler 480中文操作說明絕對定量 (Absolute Quantification)1. 點選下方的“Calculate” 即可得到樣品之 Cp 與標準曲線各個樣品之 Cp 值與濃度重複樣品平均後之 Cp值與濃度 , 並自動計算標準差2. 數(shù)值之數(shù)據(jù)輸出 : 在數(shù)值分析表上按鼠標右鍵，點選 “Export”即 可輸出成 .txt 檔案格式。可直接以 Microsoft Excel 軟件開啟。3. 圖形輸出 : 在圖形上按鼠標右鍵，點選

13、“Export” 即可輸出成各種 圖形檔案格式。10LightCycler 480中文操作說明相對定量 (Relative Quantification)1. 在選擇相對定量分析后，出現(xiàn)下面窗口：Reference Sample Location: 若 Reference (Housekeeping gene) 之樣品在同一盤上請選擇 “In-Run ”，否則請選擇 “External” 可輸 入另一次實驗的數(shù)據(jù)一起分析。建議將 Auto Pair 打勾讓計算機自動將樣品配對。2. 進入Target與Reference分頁，右下角顯示 “Eff = 2 表” 示將目標基因與參考基因的 PCR

14、效率以 2.0 來計算。3. 若需要校正目標基因與參考基因之 PCR 效率，則需要輸入標準曲 線。在Target與Reference分頁之右下角，輸入 (import) 標 準曲線。11LightCycler 480中文操作說明Use in run：輸入 (import) 同一盤上之標準曲線。Use externa：l 輸入 (import) 之前已儲存于數(shù)據(jù)庫中之標準曲線4. 點選Pairing分頁，檢查計算機自動配對結(jié)果是否正確。其中， 紅色表示 Unknown樣品，綠色表示 Calibrator 樣品。若欲外加配 對，則可直接以鼠標點選樣品后按 “Add” 即可增加配對。5. 點選Res

15、ults分頁，點選“Calculate” 即可得到計算結(jié)果6. 數(shù)值和圖形輸出與絕對定量相同。 (請參考絕對定量 )12LightCycler 480中文操作說明基因分型 (Genotyping)1. 進入基因分型的窗口中2. 窗口右下角可設定分類方式3. 點選Auto Group：自動分組In-run ：標準品包含在本次實驗中External：標準品在之前已儲存之實驗中Calculate” 即可得到分型結(jié)果13LightCycler 480中文操作說明Tm 分析 (Tm Calling)1. 進入 Tm 分析窗口2. 確認波峰數(shù)目3. 選擇檢測模式4. 點選 “Calculate即可得到每個樣品之 Tm 值14LightCycler 480中文操作說明五報告 (Report)1. 將分析后結(jié)果儲存后即可點選報告鍵報告2. 勾選想要呈現(xiàn)的報告內(nèi)容。3. 點選“Generate” 即可產(chǎn)生報告。4. 點選“PDF” 即可將此報告儲存成 .pdf 檔案格式15LightCycler 480中文操作說明六數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移至其它計算機(數(shù)據(jù)輸出與輸入 )數(shù)據(jù)輸出1. 點選 (naviga