(完整版)瓊脂糖凝膠電泳的操作步驟

1、瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂或瓊脂糖作支持介質的一種電泳方法。對于分子量 較大的樣品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進行電 泳分離。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差 100bp 的 dna 片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝 膠低，但它制備容易，分離范圍廣，尤其適于分離大片段 dna。普通瓊脂糖凝 膠分離 dna 的范圍為 0.2-20kb ，利用脈沖電泳，可分離高達 107bp 的 dna 片段。操作流程準備干凈的配膠板和電泳槽注意 dna 酶污染的儀器可能會降解 dna ，造成條帶信號弱、模糊甚至缺失 的現象。選擇電泳方法一般的核酸檢測只需要瓊脂糖凝膠電泳就可以；如果需要分辨率高的電泳，

2、 特別是只有幾個 bp 的差別應該選擇聚丙烯酰胺凝膠電泳；用普通電泳不合適的 巨大 dna 鏈應該使用脈沖凝膠電泳。注意巨大的 dna 鏈用普通電泳可能跑不 出膠孔導致缺帶。正確選擇凝膠濃度對于瓊脂糖凝膠電泳，濃度通常在 0.5 2之間，低濃度的用來進行大片 段核酸的電泳，高濃度的用來進行小片段分析。低濃度膠易碎，小心操作和使用 質量好的瓊脂糖是解決辦法。注意高濃度的膠可能使分子大小相近的 dna 帶不 易分辨，造成條帶缺失現象。適合的電泳緩沖液常用的緩沖液有 tae 和 tbe，而 tbe 比 tae 有著更好的緩沖能力。電泳 時使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。注意電泳緩沖液多次使用后

3、，離子 強度降低，ph 值上升，緩沖性能下降，可能使 dna 電泳產生條帶模糊和不規(guī) 則的 dna 帶遷移的現象。電泳的合適電壓和溫度電泳時電壓不應該超過 20v/cm ，電泳溫度應該低于 30，對于巨大的 dna 電泳，溫度應該低于 15。注意如果電泳時電壓和溫度過高，可能導致出現條帶模糊和不規(guī)則的 dna 帶遷移的現象。特別是電壓太大可能導致小片段跑出膠 而出現缺帶現象dna 樣品的純度和狀態(tài)是電壓太大可能導致小片段跑出膠而出現缺帶現象 dna 樣品的純度和狀態(tài) 注意樣品中含鹽量太高和含雜質蛋白均可以產生條帶模糊和條帶缺失的現象。乙 醇沉淀可以去除多余的鹽，用酚可以去除蛋白。注意變性的 d

4、na 樣品可能導致 條帶模糊和缺失，也可能出現不規(guī)則的 dna 條帶遷移。在上樣前不要對 dna 樣品加熱，用 20mm nacl 緩沖液稀釋可以防止 dna 變性。dna 的上樣正確的 dna 上樣量是條帶清晰的保證。注意太多的 dna 上樣量可能導致 dna 帶型模糊，而太小的 dna 上樣量則導致帶信號弱甚至缺失。tiangen 公 司 dna 分子量標準每次上樣 6ul 即可得到清晰均勻的條帶。marker 的選擇dna 電泳一定要使用 dna marker 或已知大小的正對照 dna 來估計 dna 片段大小。marker 應該選擇在目標片段大小附近 ladder 較密的，這樣對目標

5、片 段大小的估計才比較準確。tiangen 公司的 dna marker 條帶清晰，亮度均勻， 質量穩(wěn)定，是您實驗的首選。需要注意的是 marker 的電泳同樣也要符合 dna 電泳的操作標準。如果選擇 dna/hindiii 或者 dna/ecori 的酶切 marker，需 要預先 65 加熱 5min，冰上冷卻后使用。從而避免 hindiii 或 ecori 酶切造成 的粘性接頭導致的片段連接不規(guī)則或條帶信號弱等現象。凝膠的染色和觀察實驗室常用的 核酸染色劑是溴化乙啶（ eb），染色效果好，操作方便，但 是穩(wěn)定性差，具有毒性。而其他系列例如 sybr green，gelred，雖然毒性小

6、， 但價格昂貴。tiangen 公司的 genegreen 相比則是性價比高的低毒替代染料， 其靈敏度比傳統(tǒng) eb 染料高 10 倍以上。注意觀察凝膠時應根據染料不同使用合 適的光源和激發(fā)波長，如果激發(fā)波長不對，條帶則不易觀察，出現條帶模糊的現 象。步驟如下：1. 制備 1%瓊脂糖凝膠(大膠用 70ml, 小膠用 50ml): 稱取 0.7 g(0.5 g)瓊脂糖置于 錐形瓶中,加入 70 ml(50ml)1 tae, 瓶口倒扣小燒杯.微波爐加熱煮沸 3 次至瓊脂 糖全部融化,搖勻,即成 1.0% 瓊脂糖凝膠液.2. 膠板制備 : 取電泳槽內的有機玻璃內槽 ( 制膠槽 ) 洗干凈 , 晾干 ,

7、 放入制膠玻璃板 . 取透明膠帶將玻璃板與內槽兩端邊緣封好 , 形成模子 . 將內槽置于水平位置 , 并在 固定位置放好梳子.將冷卻到 65左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內槽玻璃 板上 , 使膠液緩慢展開 , 直到整個玻璃板表面形成均勻膠層 .室溫下靜置直至凝膠 完全凝固,垂直輕拔梳子,取下膠帶,將凝膠及內槽放入電泳槽中.添加1tae 電泳緩沖液至沒過膠板 1-2 為止.3. 加樣:在點樣板或 parafilm 上混合 dna 樣品和上樣緩沖液,上樣緩沖液的最終 稀釋倍數應不小于 1x.用 10 ul 微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內, 每加完一個樣品 , 應更換一個加樣頭 , 以防污染 , 加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠 面.(注意:加樣前要先記下加樣的順序).4. 電泳 : 加樣后的凝膠板立即通電進行電泳 , 電壓 60-100v, 樣品由負極 ( 黑色 ) 向 正極(紅色)方向移動.電壓升高,瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低 .當溴酚藍 移動到 距離膠板下沿約 1cm 處時,停止電