豆腐乳毛霉干粉菌劑的研制

1、豆腐乳毛霉干粉菌劑的研制 13豆腐乳毛霉干粉菌劑的研制摘 要本論文主要進行了以下幾方面的研究工作：首先，研究了中國傳統(tǒng)腐乳釀造中的毛霉釀造工藝，并且進一步研究了使用純菌種發(fā)酵與傳統(tǒng)自然接種發(fā)酵之間的差異。第二，研究了腐乳菌種Z328及其前酵條件。Z328屬于放射毛霉屬，最適生長溫度28，pH56，相對濕度9697%。第三，研究了毛霉發(fā)酵型腐乳的風味產生機理。腐乳中的鮮味物質主要是氨基酸，毛霉在豆腐坯表面生長時，在豆腐坯表面形成堅韌的皮膜，并產生大量的蛋白酶，蛋白酶對豆腐坯中的蛋白質進行分解產生氨基酸，成為豆腐乳中的主要風味物質。第四，研究了毛霉菌種的擴大培養(yǎng)及其中的無菌操作。第五，研究了冷凍干

2、燥法制作毛霉干粉菌種的工藝流程。最后，對毛霉干粉菌劑的使用方法進行了研究，并進行了腐乳的生產實驗。關鍵詞：腐乳，毛霉，發(fā)酵，釀造，蛋白酶，干粉菌種Development on the Powder culture of Sufu Mucor ABSTRACTThe thesiss major rusearch tasks are as follows:Firstly, the traditional technology of SOFU production in china was invested,and the differences between the tradition tech

3、nology and the new technology that ferments with pure Mucor.were also mentioned.Secondly,Mucor sufu Z328 and the conditions for the strain Z328 were at pH56,temperature28,relative humidity9697%.Thirdly,researched the flavor constituent in SOFU,the amino acide formed by Mucor is the major flavor fact

4、or of SOFU.While the Mucor growing on the TOFU curd ,it produced protein enzyme,which converse protein into amino acide.Fourthly,practiced the extention development of Mucor,and reviewed the operation without germ.Fifthly,practiced the refrigeration dehydration used in pure Mucor production.At last,

5、I practiced the producation of SOFU with dehydrated pure Mucor togain the usage of pure Mucor. KEYWORDS:SOFU,Mucor,Z328,protein enzyme,amino acide ,refrigeration dehydration.目 錄摘 要IThe Development of Powder SOFU MucorIIABSTRACTII目 錄III第一章 緒 論11.1豆腐乳生產的發(fā)展及現狀11.2豆腐乳的分類21.3 豆腐乳的釀造機理及主要風味物質31.4 豆腐乳消費水平及

6、前景41.5豆腐乳的營養(yǎng)保健功能41.6 本論文的主要研究內容5第二章 Z328的擴大培養(yǎng)及菌種的保藏62.1 引子62.2 實驗材料及設備62.2.2 實驗設備62.3 Z328擴大培養(yǎng)的實驗方法62.3.2 三角瓶培養(yǎng)基的滅菌62.3.3 三角瓶麩皮培養(yǎng)基的接種72.5 結果與討論92.6 本章小結9第三章 冷凍干燥法制取Z328干粉菌種103.1 引子103.2 實驗設備及操作要求113.2.1實驗設備113.2.2 LY-1型冷凍干燥機操作要求113.3 冷凍干燥的實驗操作123.3.1預凍操作123.3.2 冷凍干燥實驗操作12(1)干燥機參數介紹：12(2) 實驗操作流程133.4

7、 結果與討論143.5 本章小結15第四章 干粉菌種生產驗證實驗164.1 引子164.2 實驗設備及材料164.2.1 實驗材料164.2.2實驗設備164.3 驗證實驗的操作164.3.1 稀釋菌液的制備164.3.2 稀釋菌液的生長對比實驗164.4 結果討論174.5 本章小結17致 謝18參 考 文 獻19第一章 緒 論1.1豆腐乳生產的發(fā)展及現狀腐乳由我國首創(chuàng)，早于1500年前便有相關記載。千百年的腐乳生產歷史上，我國勞動人民一直采用自然接種，自然霉制的方法進行制造。直至二十世紀四十年代，著名微生物專家方心芳教授在四川五通橋腐乳坯上分離出五通橋毛霉之后，國內各大廠家才陸續(xù)提取和使用

8、純菌種進行腐乳的發(fā)酵生產，生產技術才開始得以科學化的發(fā)展，通過選擇優(yōu)良菌種進行純化培養(yǎng)，減少了雜菌污染的機會，既保證了產品的衛(wèi)生質量又提高了產品的品質。我國的腐乳生產主要有兩大類：腌制型和發(fā)霉型。腌制型是不經發(fā)霉階段而直接進行后期發(fā)酵，它主要利用輔料帶入的微生物進行自然發(fā)酵和依靠所添加的輔料如紅曲米、面糕曲、黃酒、米酒等進行生化變化，如唐場腐乳。發(fā)霉型是豆腐坯經過純種培菌或自然培菌，經4873小時或更長時間，待豆腐坯上長出白色網狀菌絲，即可進行腌制和后期發(fā)酵。因使用菌種的不同分為毛霉型、根霉型和細菌型。毛霉的作用與根霉相似，不同的是根霉能耐受37的高溫，毛霉則不能。目前大多數廠家都采用毛霉和根

9、霉進行腐乳的釀造，只有少數廠家采用細菌釀造，如黑龍江的克東腐乳廠。近幾年來我國的研究人員已經把對腐乳菌種的研究轉向對后期發(fā)酵過程中生化反應的變化研究。腐乳生產的后發(fā)酵階段是腐乳特有風味的形成和蛋白質降解的主要階段。余若黔、陳維民等人研究表明,腐乳后發(fā)酵過程中可溶性蛋白及氨基酸的含量變化較直觀地反映了腐乳的成熟情況,當可溶性蛋白含量達到=18%20%(干基),氨基酸態(tài)氮達到0.15%時腐乳已基本成熟。魯緋、孫君社的研究報告中發(fā)現腐乳的后發(fā)酵過程中,隨著發(fā)酵的進行腐乳的質構、酸度、以及化學成分都發(fā)生了相應的變化,且主要發(fā)生在后發(fā)酵40d內。腐乳坯體粘度迅速下降,坯體和湯料的酸度逐漸增加,50 d兩

10、者的酸度趨于一致。游離氨基酸含量隨著發(fā)酵時間的延長而增加,湯料及坯體中淀粉酶活力較穩(wěn)定,而蛋白質酶與脂肪酶活力變化較大。馬勇、韓北忠和Frans M R等人研究了在腐乳生產過程中食鹽對腐乳及脂肪水解的作用對總酸、游離氨基酸和游離脂肪酸的影響。研究表明,含鹽量高(14%)的產品在后發(fā)酵過程中會增加其硬度和彈性而粘度則降低。含鹽量低的產品蛋白質的水解快,游離氨基酸態(tài)氮增長較快,相反含鹽量高的產品水解較慢,并提出在實際生產中采用8%或者稍低食鹽含量進行試生產,這對腐乳的低鹽化生產提供了依據。龔麗、郝淑閑等人對腐乳后發(fā)酵過程中大豆異黃酮含量及存在形式進行了研究。研究發(fā)現,在后發(fā)酵過程中異黃酮以4種形式

11、存在且在不同時期含量也有所變化:大豆糖苷呈上升趨勢;染料木素糖含量甚微;大豆苷元呈上升、下降至平緩變化過程;染料木素總體呈上升變化。研究還發(fā)現,后發(fā)酵過程中異黃酮總量在30d和90d均可達到最大值。借對后發(fā)酵過程中化學變化和成分變化的研究可以了解到后發(fā)酵過程中的一些動態(tài)變化，為完善腐乳的釀造機理及生產中對腐乳成熟度的控制提供了一定的理論依據。早在1980年代，美國的研究人員就開始對腐乳進行了研究。Lin從臺灣坯子和稻草上分離到凍土毛霉以及華根霉。Wai研究了一種實驗室制作腐乳的方法，接種前先在100的熱空氣爐中烘15min，以便表面干燥，后來Hesseltine對Wai的做法進行了一些改變，在

12、熱空氣處理前，將豆腐坯浸入酸性鹽溶液中，這樣可以防止腐敗細菌的生長而不抑制毛霉的生長。美國還有一種涂抹腐乳，它是在標準的豆腐塊生涂一薄層白色松軟的豆醬，讓它熟化。然后將豆醬涂層從熟化的豆腐塊上刮去，并將豆腐塊浸泡在水中，直至在水的作用下豆腐塊的含鹽量達到平衡。最后將豆腐塊攪打成一種奶油狀組織的產品。采用這種技術制作的產品中未添加任何添加劑，產品呈新穎的奶油狀，耐水分離，具有低脂肪、低鈉、基本不含膽固醇等有益健康的特點，并具有可口的味感。由于傳統(tǒng)大豆產品具有豆腥味，一度不被西方國家居民接受，生產和消費都較少。近年來隨大豆育種技術和食品生產水平的提高，無豆腥味大豆制品得到普遍發(fā)展，加上傳統(tǒng)大豆制品

13、也有食用方便，含有豐富的蛋白質和鈣，并且其中也富含大豆中的特殊功能保健因子，因此傳統(tǒng)大豆制品如豆腐、腐乳等也受到西方國家居民的廣泛歡迎，消費量在逐年升高。據傳，早在公元1700年，（紅）腐乳的制作技術即由鑒真和尚東渡時與豆腐制法一起傳入了日本。由于當地氣候、風土、飲食習慣及嗜好的客觀因素，豆腐乳的制作很快受到了改良。在當時的如苯，豆腐乳并不是被作為低檔品消費，而是在一部分上層社會中被作為滋養(yǎng)食品和佐餐佳肴。從1970年代開始，安田正昭研究組對傳統(tǒng)沖繩豆腐乳的制法進行了研究，與1989年告一段落，而后向豆腐乳新技術的開發(fā)（如利用酶類，依靠生物反應器等新技術進行大規(guī)模腐乳生產）。后來安田小組篩選到

14、一株豆腐蛋白凝乳酶活力高的芽孢桿菌并對其進行全面的酶學研究后，采用基因工程的方法獲得了高產穩(wěn)定的大量凝乳酶生產菌株，從而將腐乳的研究深入到了分子生物學的水平。日本腐乳的特點：咸味不大，略甜，組織柔滑，粘滑性適中。1.2豆腐乳的分類 腐乳通常分為青方、紅方、白方三大類。其中，臭豆腐屬于“青方”；“大塊”、“紅辣”、“玫瑰”等醬腐乳屬于“紅方”；“甜辣”、“桂花”、“五香”等屬于“白方”。白色腐乳在生產時不加紅曲色素，使其保持本色；腐乳坯加紅曲色素即位紅腐乳；青色腐乳是指臭腐乳，又稱青方，它是在腌制過程中加入了苦漿水、鹽水、故呈豆青色。臭腐乳的發(fā)酵過程比其他品種更豐富。特別是其中含有較多的丙氨酸和

15、酯類物質，使人吃臭豆腐乳時感到特殊的甜味和酯香味。但是，由于這類腐乳發(fā)酵徹底。致使發(fā)酵后一部分蛋白質的硫氨基和氨基游離出來，產生明顯的硫化氫臭味和氨臭味，使人遠遠就能嗅到一股臭腐乳特有的臭氣味。腐乳品種中還有添加糟米的稱為糟方，添加黃酒的稱為醉方，以及添加芝麻、玫瑰、蝦籽、香油的花色腐乳。江浙一帶，如紹興、寧波、上海、南京等地的腐乳以細膩柔綿、口味鮮美、味甜著稱；而四川大邑縣的唐場腐乳川味濃郁，以麻辣、香酥、細嫩無渣見長；另外四川成都、遂寧、眉山等地所產的白菜豆腐乳也很有特色，每塊腐乳用白菜葉包裹，味道鮮辣適口；河南拓城的酥制腐乳則是醇香濃厚，美味可口。1.3 豆腐乳的釀造機理及主要風味物質在

16、釀造培菌階段，毛霉生長的變化大致分為孢子發(fā)芽生長階段，菌絲生長旺盛階段和菌絲產酶階段。這三個階段變化過程如表1-1所示表1-1 毛霉生長變化過程名稱培養(yǎng)最適溫度/培養(yǎng)時間/h生長變化過程孢子發(fā)芽生長階段1822820孢子開始發(fā)芽，品溫自然上升，14h能見白坯表面長出白茫茫的一批短菌絲菌絲生長旺盛階段28302432此時進入生長旺盛期，菌絲大量叢生，白色菌絲已長滿白坯表面，品溫上升，產生大量發(fā)酵熱菌絲產酶階段26284048毛霉進入成熟階段，是酶系分泌的高峰期在前期菌絲生長階段，豆腐坯中的蛋白質已經開始被蛋白酶水解為水溶性蛋白（眎和胨）。經過前期培菌后，豆腐坯中的水溶性蛋白質由原來的3.61%達

17、到55.54%。前期發(fā)酵的作用歸納起來有兩點：一是使豆腐坯表面有一層菌膜包裹，成為腐乳形狀。其次是在毛霉培養(yǎng)過程中分泌大量蛋白酶，以利于蛋白質水解為各種氨基酸。在蛋白質水解過程中，需要多種酶系，主要有內肽酶和外肽酶的協(xié)同作用。經過前期培菌后，使豆腐坯的含水量由原來的73%下降到64%，毛坯形狀變小，坯身變硬，蛋白質的水解作用已開始，毛坯中的氨基酸已達到0.080.14%。后期發(fā)酵主要三酶系與微生物協(xié)同參與生化反應的過程。后期發(fā)酵包括毛坯腌制及添加料酒等輔料，讓毛坯陳釀后熟。在后酵之前，將毛坯加鹽腌制，腌制時間68天，毛坯變?yōu)橄膛?，咸坯含鹽量控制在16%以上。腌制的目的是：使毛坯內滲透鹽分，析出

18、水分，坯身收縮，坯體變硬。經腌制咸坯的水分由白坯的73%降為56%左右。咸坯入壇后加入以酒為主要的輔料。加酒的目的是：酒精能抑制微生物的生長繁殖，防止腐?。黄浯问蔷凭珜Φ鞍酌赣幸种谱饔?，使蛋白酶作用緩慢，促進其他升華反應，生成腐乳的香氣；酒精能合成酯類等芳香物質，形成腐乳獨特的風味。微生物中的脂肪酶將腐乳坯中的脂肪水解為甘油及脂肪酸，甘油進一步被轉化為各種有機酸。在腐乳的整個生產周期中所產生的氨基酸、酯類、有機酸等共同構成了腐乳的風味成分。1.4 豆腐乳消費水平及前景腐乳作為一種傳統(tǒng)的大豆制品，是中國廣大消費者喜愛的傳統(tǒng)食品，國內外的研究也證明它是營養(yǎng)和健康的食品，隨著人們消費意識的轉變和健康

19、意識的增強，傳統(tǒng)大豆制品的市場空間會越來越大。目前我國年產量大致在30萬噸左右。現行生產技術與生產方式已經對其發(fā)展產生了阻礙。傳統(tǒng)大豆制品尤其是腐乳生產呼喚新的技術革命，如何將傳統(tǒng)工藝同現代工藝相結合，從傳統(tǒng)中升華，實現生產的規(guī)模化、工業(yè)化和安全化三企業(yè)能否抓住市場機遇的關鍵。若能解決腐乳生產周期長、保質期短、含鹽量高、攜帶不方便、新品種少等諸多問題，其國際市場前景將十分廣闊。1.5豆腐乳的營養(yǎng)保健功能腐乳作為一種大豆的發(fā)酵制品，它除了具有大豆的營養(yǎng)價值，如蛋白質優(yōu)、富含油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸，不含膽固醇（這對降低血清膽固醇，防止血管硬化、高血壓和冠心病有一定作用）等外，它還具有更高的營養(yǎng)

20、價值含鈣量更高、更易于消化吸收。在腐乳的加工過程中是以水為溶劑提取大豆蛋白，并以鹽鹵或石膏作為凝固劑，因此腐乳中的鈣含量比大豆中更豐富。另外腐乳是經過微生物發(fā)酵,通過微生物所分泌的酶對蛋白質進行降解,使其轉化成更有利于吸收的氨基酸和肽類,故氨基酸含量得到了很大程度上的提高。從營養(yǎng)角度來看,腐乳比其他發(fā)酵豆制品,如豆豉、豆瓣、豆醬、納豆的蛋白質含量高,營養(yǎng)豐富,容易消化,老少皆宜。此外腐乳不僅具有大豆本身含有的多種生理活性物質,而且由于微生物的發(fā)酵作用,產生了一些大豆沒有的生理活性物質,提高了一些生理活性物質的保健功效,使得腐乳更具有營養(yǎng)和保健功能。腐乳中的活性成分主要有大豆多肽、大豆異黃酮和大

21、豆皂苷。大豆多肽比大豆分離蛋白更容易消化吸收。另外它還具有良好的溶解性、低粘度、抗凝膠形成性;具有低抗原性,不會產生過敏反應;能增強運動員體能和肌肉,促進肌紅細胞復原,幫助消除疲勞;能促進鈣、鐵、硒、鋅等多種微量元素的吸收;促進微生物生長作用;促進脂肪分解、能量的代謝,具有預防肥胖及減肥作用;降低血清膽固醇的功能、降血壓及抗氧化性等功能 。大豆異黃酮是多酚類混合物,是大豆生長中形成的一類次生代謝產物。研究發(fā)現,大豆異黃酮具有抗癌作用 、預防骨質疏松、緩解更年期綜合癥、抗氧化、預防心血管疾病、降血糖、抗衰老等多種生理功能 ,它能有效地預防和抑制白血病,尤其對乳腺癌和前列腺癌有積極的預防和治療作用

22、。未發(fā)酵的大豆制品則主要以苷的形式存在,而發(fā)酵的食品主要以游離型異黃酮苷原形式存在。游離的苷原具有更廣泛、更強烈的生物學活性,如抗菌活性、抗氧化活性、雌激素活性等,這些苷原可以被肌體腸道有效地吸收。大豆皂苷是存在于大豆及其制品中的活性成分,近年來關于大豆皂苷的生理活性研究日趨成為熱點。研究發(fā)現大豆皂苷具有抗脂質氧化、降低過氧化脂質的生成、抗自由基的作用、增強免疫調節(jié)功能、抗血栓的作用、抗病毒的作用,此外大豆皂苷還具有抗衰老、防止動脈粥樣硬化、抗石棉塵毒性等多種功能。1.6 本論文的主要研究內容本實驗主要對豆腐乳毛霉菌種Z328進行菌種形態(tài)、菌種生產、以及冷凍干燥方法生產干粉菌種的方法進行研究，

23、并對實驗產品進行生產特性的研究。a.菌種的擴大培養(yǎng)及其中的無菌操作；b.冷凍干燥機的使用及其操作；c.豆腐乳前期發(fā)酵的實驗操作、其過程中環(huán)境條件的控制及菌群生長特性的觀察記錄；d.通過腐乳坯上毛霉生長情況的對比實驗，確定菌種使用方法及濃度。e.腐乳毛霉Z328的形態(tài)觀察。第二章 Z328的擴大培養(yǎng)及菌種的保藏2.1 引子由于純菌種價格較高，且不利于大規(guī)模接種生產，因此在實際生產中大都采用菌種的擴大培養(yǎng)來獲取生產發(fā)酵用菌。2.2 實驗材料及設備2.2.1實驗材料麩皮，純種Z328菌種，棉花（不脫脂），脫脂棉，醫(yī)用紗布，棉線繩，報紙，醫(yī)用75%酒精，營養(yǎng)瓊脂。2.2.2 實驗設備酒精燈，接種針，1

24、000ml三角瓶，試管，玻璃棒，1000ml燒杯,電爐，石棉網，鑷子，電爐，白瓷盤，手提式不銹鋼消毒器（型號YX28013,電源220V/2KW，容積18L，產品編號0327073），SWCJ1D實用垂直新穎單人凈化工作臺，恒溫培養(yǎng)箱。2.3 Z328擴大培養(yǎng)的實驗方法2.3.1 麩皮培養(yǎng)基的制備取干燥麩皮放于白瓷盤中，加水和勻，加水程度以手捏后成團放開則麩皮散開為準（加水過多則濕度過高，不利于氣生菌絲生長；加水過少則無法滿足菌種繁衍生長需求）。之后放入三角瓶中，鋪滿瓶底約11.5cm厚（注意盡量不要使麩皮粘在瓶壁上）。在三角瓶上加帶紗布包裹的棉塞（此處使用非脫脂棉），用報紙將瓶口封上，使用棉

25、線繩扎成一個活結。2.3.2 三角瓶培養(yǎng)基的滅菌使用手提式不銹鋼蒸汽消毒器對三角瓶（連同麩皮培養(yǎng)基）進行高壓濕熱滅菌1.打開鍋蓋，取出內膽，望鍋底部添加水，加至能覆蓋住鍋底標尺為準。2.將扎好口的三角瓶放入鍋膽內，和鍋膽一起放進鍋內，之后將鍋蓋蓋上，把鍋蓋四周的旋鈕全部放到鍋蓋上方，然后兩邊對稱一一旋緊，全部旋好之后在檢查一遍。3.打開鍋蓋上的排氣閥，接通電源，進行加熱，待蔥排氣閥排出粗壯的水汽之后繼續(xù)加熱10min（為了排出鍋內空氣中的雜菌）。4.壓下排氣閥，使壓力升至0.10.15Mpa（溫度121125），當溫度及壓力超出此范圍時，拔下滅菌鍋電源；低于此范圍時再插上電源(在此過程中始終要

26、在鍋旁檢視，防止鍋內壓力過大，導致安全閥跳起，甚至爆炸)。使溫度和壓力維持在此范圍內30min。5.拔下電源，使壓力表上溫度自然降為0Mpa，之后拔下排氣閥放氣，打開鍋蓋取出鍋內的三角瓶。2.3.3 三角瓶麩皮培養(yǎng)基的接種此操作在高壓濕熱滅菌后的三角瓶冷卻至室溫之后進行。1.將SWCJ1D實用垂直新穎單人凈化工作臺接通電源，按下通風按鈕，開啟紫外燈，10min之后關閉通風設施，將備用的接種針，酒精燈，打火機，試管Z328菌種，待接種的三角瓶一起放入箱體內，預滅菌10min以上。2.在接種前先使用吸收液洗手，之后使用沾滿醫(yī)用酒精的脫脂棉球擦拭雙手。3.關閉紫外燈并開無菌操作箱的玻璃門，點燃酒精燈

27、，將接種針燒紅，桿部也要燒到，但是要避免燒到根部的塑膠把手部位，之后用右手小拇指夾住試管Z328菌種的棉塞，將接種針放入其中先行降溫。4.試管菌種的試管口部位在酒精燈火焰上旋轉火烤滅菌，注意旋轉均勻，防止炸口。5.使用接種針從試管內挑出少許菌絲體，最好帶出一些瓊脂培養(yǎng)基。并迅速將試管口塞上。6.同樣使用右手小拇指將三角瓶的棉塞拔出，在酒精燈火焰上對三角瓶口進行火烤滅菌，注意旋轉均勻防止炸口。7.將接種針頭部迅速放入三角瓶內底部的麩皮培養(yǎng)基上，并進行輕微的攪拌。之后馬上將三角瓶口用棉塞塞上，用報紙封上，使用棉線繩扎好口。8.重復37的操作直至將剩余三角瓶接種完。9.接種完畢后，清洗接種針，打開通

28、風設施，通風5min之后關閉電源，合上玻璃門。注意事項：1.在接種過程中接種針不要接觸到除菌種及培養(yǎng)基外的任何物品。2.挑出的菌絲體如果由于粘連不穩(wěn)，掉到操作臺上，或接觸到其他任何物品，即應當棄用。3.在操作中無論是試管的棉塞或是三角瓶的棉塞，一律應當使用右手小拇指夾出，并保持夾在小拇指中，而不應該放于實驗臺。4.在向三角瓶麩皮培養(yǎng)基上接種時，注意不要使接種針帶出麩皮，并使之粘于瓶壁上。2.3.4 三角瓶內菌種的培養(yǎng)1.將恒溫培養(yǎng)箱的溫度調至22，把接種好的三角瓶放入培養(yǎng)箱內。2.24小時之后打開培養(yǎng)箱，取出三角瓶，發(fā)現其中部分位置已經有毛霉生長成一團白色的菌球，取出三角瓶，將培養(yǎng)基進行震蕩，

29、以使其中的孢子分散到整個培養(yǎng)基內。之后再將三角瓶放入恒溫培養(yǎng)箱。并將溫度調至26。3.繼續(xù)培養(yǎng)3648小時之后，觀察到三角瓶內的培養(yǎng)基已經基本長成餅狀，菌絲體已將麩皮包裹起來，并且在培養(yǎng)基內部也布滿了營養(yǎng)菌絲。此時取出三角瓶，用手拍擊三角瓶的底部，使麩皮餅脫離三角瓶底并斜靠于三角瓶壁上（因為毛霉是好氧型真菌，為了培養(yǎng)基底部的毛霉也正常生長，必須使其也接觸到空氣）。將三角瓶放倒，置于恒溫培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)。4.再培養(yǎng)2436小時后，麩皮培養(yǎng)基已經完全成為一個布滿毛霉菌絲體的餅狀物，其表面的菌絲已經長到白色甚至微黃色。2.4 菌種保藏的試驗方法2.4.1 制備瓊脂溶液先把5支試管及1000ml燒杯洗

30、滌干凈，備用。稱取20g營養(yǎng)瓊脂，放入1000ml燒杯中，加水至1000ml刻度。將電爐打開，上面放好石棉網，把燒杯放到上面進行加熱，在加熱的過程中，要不斷使用玻璃棒攪拌，防止液體沸騰。待瓊脂全部溶化之后，放置片刻使燒杯稍作冷卻，但不要使瓊脂凝固，趁熱將瓊脂液倒入試管中，并迅速塞上棉塞，用報紙包好，扎口。2.4.2 試管及瓊脂溶液的滅菌將包扎好的試管放入一個空的燒杯中，使其直立，之后將燒杯和試管一起放入滅菌鍋鍋膽內，在0.10.15Mpa（121125）下滅菌30min左右2.4.3 斜面的制備滅菌之后的試管從滅菌鍋內取出，趁熱將試管一一靠放于放在桌面上的海綿等固定物體上，高度合適，使形成的斜

31、面上端達到試管的1/2至2/3處。冷卻之后即形成斜面培養(yǎng)基。2.4.4 斜面培養(yǎng)基的接種及培養(yǎng)在無菌操作臺上進行接種，操作方法與2.3.3的基本一致，不同的是在挑取菌體時選擇生長旺盛菌絲顏色正常的來挑取使用。接種完之后，用報紙封口包扎好。包扎好的試管放入26的恒溫培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)，菌體生長越旺盛越好。培養(yǎng)23天之后，取出試管，放于4的冰箱冷藏。2.5 結果與討論本次實驗的擴大培養(yǎng)采用類似毛霉在豆腐坯上進行前期發(fā)酵的實驗條件（包括溫度，各個階段的培養(yǎng)時間），操作過程中較為嚴格地執(zhí)行了無菌條件，生長出來的菌種菌絲充滿培養(yǎng)基，無雜菌生長造成的菌斑，菌體氣味正常。在菌種進行冷凍干燥前的預凍過程中由于不

32、可抗拒的原因造成冰柜斷電，導致菌種發(fā)臭，產生大量的雜菌菌斑，因此丟棄了第一次培養(yǎng)出的菌種。并再次進行了菌種的擴大培養(yǎng)。所幸在操作過程中了菌種的保藏工作做的比較好，還有備用菌種可以使用，因此并未對實驗結果產生太大影響。通過這次教訓，認識到了微生物試驗必須是嚴謹的，有前瞻性的，在實驗過程中一定要考慮到所有可能發(fā)生的情況，并進行預先的防備。2.6 本章小結微生物實驗一定注意無菌操作的規(guī)范性，對于食品行業(yè)而言，輕則造成菌種的破壞，重則造成致病菌的感染出現安全隱患。因此實驗操作及設計一定要嚴謹，要用科學的態(tài)度來進行實驗并應對實際操作中出現的問題。需要全文請聯(lián)系QQ869260800菌種在豆腐坯上的生長狀

33、況與時間的關系如下所示：生長一天后1/100長毛均勻，豆腐坯連于一體，毛長約1.5cm，腐乳菌絲體布滿豆腐坯表面；1/200生長類似于1/100只是豆腐坯未連于一體；1/400長毛不均與，周邊菌絲長約1cm,頂部短，豆腐坯相互獨立；1/800長毛甚弱，毛長約0.2cm。生長2天后1/100長毛均勻，毛長22.5cm，豆腐坯粘連，表面略有發(fā)綠；1/200毛長22.5cm左右，豆腐坯粘連，部分表面有發(fā)綠；1/400毛長1.52cm，豆腐坯粘連，表面發(fā)綠；1/800毛長1cm，豆腐坯粘連，表面稍有發(fā)綠。生長3天半后，1/100長毛旺盛，毛長3cm，毛色泛黃，毛霉形成的皮膜呈黃褐色；1/200毛長3cm，毛色泛黃，皮膜黃褐色；1/400毛體旺盛，豆腐坯完全粘連，皮膜呈黃褐色，略有泛青；1/800毛長約2cm，生長旺盛，毛色泛黃，皮膜呈青褐色。4.4 結果討論本次實驗表明，1/800的稀釋濃度