酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓 名：學(xué) 號(hào)：專業(yè)年級(jí)：組 別：第一實(shí)驗(yàn)室生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心一、 實(shí)驗(yàn)室規(guī)則1實(shí)驗(yàn)前應(yīng)認(rèn)真預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅瑢懗鲱A(yù)實(shí)驗(yàn)報(bào)告。2進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須穿白大衣。嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)課紀(jì)律，不得無故遲到或早退。不得 高聲說話。嚴(yán)禁拿實(shí)驗(yàn)器具開玩笑。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)禁止吸煙、用餐。3嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中自己不能解決或決定的問題，切勿盲目 處理，應(yīng)及時(shí)請(qǐng)教指導(dǎo)老師。4嚴(yán)格按操作規(guī)程使用儀器，凡不熟悉操作方法的儀器不得隨意動(dòng)用，對(duì)貴重的 精密儀器必須先熟知使用方法，才能開始使用；儀器發(fā)生故障，應(yīng)立即關(guān)閉電源并報(bào)告 老師，不得擅自拆修。5取用試劑時(shí)必須“隨開隨蓋”，“

2、蓋隨瓶走，”即用畢立即蓋好放回原處，切忌“張冠李 戴”，避免污染。6愛護(hù)公物，節(jié)約水、電、試劑，遵守?fù)p壞儀器報(bào)告、登記、賠償制度。7注意水、電、試劑的使用安全。使用易燃易爆物品時(shí)應(yīng)遠(yuǎn)離火源。用試管加熱時(shí)，管口不準(zhǔn)對(duì)人。嚴(yán)防強(qiáng)酸強(qiáng)堿及有毒物質(zhì)吸入口內(nèi)或?yàn)R到別人身上。任何時(shí)候不得 將強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫、有毒物質(zhì)拋灑在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。8廢紙及其它固體廢物嚴(yán)禁倒入水槽，應(yīng)倒到垃圾桶內(nèi)。廢棄液體如為強(qiáng)酸強(qiáng)堿， 必須事先用水稀釋，方可倒入水槽內(nèi)，并放水沖走。9以實(shí)事求是的科學(xué)態(tài)度如實(shí)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，仔細(xì)分析，做出客觀結(jié)論。實(shí)驗(yàn)失 敗，須認(rèn)真查找原因，而不能任意涂改實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)完畢，認(rèn)真書寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告，按時(shí) 上交。1

3、0實(shí)驗(yàn)完畢，個(gè)人應(yīng)將試劑、儀器器材擺放整齊，用過的玻璃器皿應(yīng)刷洗干凈歸 置好，方可離開實(shí)驗(yàn)室。值日生則要認(rèn)真負(fù)責(zé)整個(gè)實(shí)驗(yàn)室的清潔和整理，保持實(shí)驗(yàn)整潔 衛(wèi)生。離開實(shí)驗(yàn)室前檢查電源、水源和門窗的安全等，并嚴(yán)格執(zhí)行值日生登記制度。實(shí)驗(yàn)名稱(Title of Experimetn)Folin- 酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)日期(Date of Experiment)實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)( Lab No.)合作者(Partner)指導(dǎo)老師(Instructor)總分(Total Score)教師簽名(Signature)批改日期（Date）實(shí)驗(yàn)報(bào)告第一部分（ 預(yù)習(xí)報(bào)告內(nèi)容） ：實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)材料（包括實(shí)驗(yàn)樣品、主要試

4、劑、主要儀器與器材） 、實(shí)驗(yàn)步驟（包括實(shí)驗(yàn)流程、操作步驟和注意事項(xiàng)） ；評(píng)分 （滿分 30 分）：】一、實(shí)驗(yàn)原理1921 年， Folin 首創(chuàng) Folin-酚試劑法，利用蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基（酚 基）還原酚試劑（磷鎢酸 -磷鉬酸）起藍(lán)色反應(yīng)； 1951 年， Lowry 對(duì)此法進(jìn)行了改進(jìn)， 先于標(biāo)本中加堿性銅試劑，再與酚試劑反應(yīng)，提高了靈敏度。 Folin- 酚試劑法主要包括 兩步：第一步 雙縮脲反應(yīng)在堿性溶液中， 雙縮脲（H2NOCNHCONH2）能與 Cu2+作用 ,形成紫色或紫紅色 的絡(luò)合物，這個(gè)反應(yīng)叫做雙縮脲反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)分子中含有與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的多個(gè) 肽鍵 , 因此有

5、雙縮脲反應(yīng)。即在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的 Cu2+ 作用生成紫紅色的蛋白質(zhì) - Cu2+復(fù)合物。第二步 Folin- 酚顯色反應(yīng)Folin- 酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，其磷鉬酸鹽 -磷鎢酸鹽易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物） 。由于蛋白質(zhì)中含有帶酚羥基的酪氨酸 （ Tyr ） ，故 有此顯色反應(yīng)。即蛋白質(zhì) - Cu2+復(fù)合物中所含的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷 鉬酸和磷鎢酸，生成藍(lán)色的化合物。在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，故與同樣處理的蛋白 質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液比色即可求出樣品中蛋白質(zhì)的含量。另外，可以根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出 待測(cè)

6、樣品中蛋白質(zhì)的含量。二、實(shí)驗(yàn)材料（一）樣品健康人血清（稀釋 300 倍）（二）試劑1牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（ 200 g/ml）準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白粉末 50.0mg，用 0.1mol/L NaOH 溶液潤濕溶解， 加蒸餾水到 250ml。2堿性硫酸銅溶液堿溶液： Na2CO32g 溶于 100ml 0.1mol/L NaOH 中。硫酸銅溶液： CuSO4?5H2O 0.5g溶于 100ml 35mmol/L（1%）酒石酸鉀鈉中。使用前將與按 50:1混合即成堿性硫酸銅溶液。使用時(shí)新鮮配制。3Folin-酚試劑在 2L 磨口回流裝置內(nèi)加鎢酸鈉（ Na2WO4?2H2O）100g，鉬酸鈉（ Na2M

7、oO4?2H2O） 25g，蒸餾水 700ml，14.68mol/L（ 85%）磷酸 50ml，濃鹽酸 100ml，充分混合后用小火 回流 10h。冷卻后，再加硫酸鋰（ Li 2SO4?H2O） 150g，水 50ml，數(shù)滴（ 23滴）液體溴 （也可用 30%H2O2 68 滴代替），然后開口沸騰 15min ，驅(qū)除過量的溴（因溴氣甚毒， 這一步應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行） ，冷卻后加水至 1000ml，過濾，溶液呈黃色（如帶綠色則不能用），保存于棕色瓶中置冷暗處備用（如配制時(shí)間較長，試劑轉(zhuǎn)呈綠色） ，可再加液體溴數(shù)滴，煮沸 15min，若能恢復(fù)原有的黃色或金黃色仍可繼續(xù)使用）（三）儀器及器材 1 V-

8、1100分光光度計(jì) 2恒溫水浴箱 3試管 6 支、試管架 4加樣槍、加樣槍架 5坐標(biāo)紙三、實(shí)驗(yàn)步驟1反應(yīng)取 6 支試管編號(hào)，按下表加入試劑，混勻。體系設(shè)空白管標(biāo)管樣品管試劑（ ml ）置12 3456牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液 0.2 0.40.60.8樣品液 0.5蒸餾水 1.00.8 0.60.40.20.52雙縮向各管內(nèi)分別加入堿性硫酸銅溶液2ml，混勻，室溫放置10min脲反應(yīng)a. 當(dāng) Folin- 酚試劑加到堿性的銅 -蛋白質(zhì)溶液中后，必須立即混勻 （加一管混勻一管） ，使還原反應(yīng) 發(fā)生在磷鉬酸 - 磷鎢酸試劑被破壞 之前。b. 每管重復(fù)測(cè)三次 A500值，求平 均值用于繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。3Fol

9、in- 再加入 Folin-酚試劑 0.20ml, 2s 內(nèi)迅速混 酚反應(yīng)勻 a！40水浴 10min 后，冷卻至室溫。4比色 以 500nm波長比色，用 1 號(hào)管作空白， 測(cè)定 讀取各管吸光度值 A500b。實(shí)驗(yàn)報(bào)告第二部分（ 實(shí)驗(yàn)記錄 ）：主要實(shí)驗(yàn)條件（如材料的來源、質(zhì)量；試劑的規(guī) 格、用量、濃度；實(shí)驗(yàn)時(shí)間、操作要點(diǎn)中的技巧、失誤等，以便總結(jié)實(shí)驗(yàn)時(shí)進(jìn)行核對(duì)和 作為查找成敗原因的參考依據(jù)） ；實(shí)驗(yàn)中觀察到的現(xiàn)象（如加入試劑后溶液顏色的變 化）；原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 評(píng)分（滿分 20 分）：XX】一、主要實(shí)驗(yàn)條件實(shí)驗(yàn)條件見第一部分。注意事項(xiàng)1干擾物質(zhì)此法是在 Folin- 酚法的基礎(chǔ)上引入雙縮脲試劑

10、，因此凡干擾雙縮脲反應(yīng)的基團(tuán)，如 -CO-NH 2,-CH2-NH 2,-CS-NH 2 以及在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖劑，如 Tris 緩沖劑以及 蔗糖，硫酸銨，巰基化合物均可干擾 Folin- 酚反應(yīng)。此外，所測(cè)的蛋白質(zhì)樣品中，若含 有酚類及檸檬酸， 均對(duì)此反應(yīng)有干擾作用。 而濃度較低的尿素 （約 0.5%左右），胍（0.5% 左右），硫酸鈉（ 1%），硝酸鈉（ 1%），三氯乙酸（ 0.5%），乙醇（ 5%），乙醚（ 5%）， 丙酮（ 0.5%）對(duì)顯色無影響，這些物質(zhì)在所測(cè)樣品中含量較高時(shí)，則需做校正曲線。若 所測(cè)的樣品中含硫酸銨，則需增加碳酸鈉 氫氧化鈉濃度即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較 高

11、，也需提高碳酸鈉 氫氧化鈉濃度 12 倍，這樣即可糾正顯色后色淺的弊病。2控制時(shí)間因 Lowry 反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深， 因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間。 即第 1 支 試管加入 2.0ml 堿性硫酸銅試劑后，開始計(jì)時(shí)， 1 分鐘后，第 2 支試管加入 2.0ml 堿性 硫酸銅試劑， 2 分鐘后加第 3 支試管，以此類推。全部試管加完堿性硫酸銅試劑后若已 到 10 分鐘，則第 1 支試管可立即加入 0.20ml Folin- 酚試劑， 1 分鐘后第 2 支試管加入 0.20ml Folin-酚試劑， 2分鐘后加第 3支試管，以此類推。 40水浴 10min，冷卻后，每一分鐘測(cè)定一管吸光值操作

12、問題及處理問題解析（1） 加入 Folin- 酚試劑后加入 Folin- 酚試劑后沒有及時(shí)混勻或加入的量不準(zhǔn)溶液呈現(xiàn)黃綠色確，偏多（ 2） 水浴后溶液呈無色Folin- 酚試劑在反應(yīng)前已被破壞，原因是加入 Folin- 酚試劑后沒有及時(shí)混勻，或水浴時(shí)間過長。實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象1、加入 Folin- 酚試劑后溶液呈現(xiàn)藍(lán)色，其中空白組藍(lán)色較淺，標(biāo)準(zhǔn)管 25藍(lán)色依次加深。三、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)1數(shù)據(jù)記錄按照下表記錄各管在 500nm 波長測(cè)得的吸光度值。測(cè)定次數(shù)各管吸光度值 A5002345610.2790.4680.6290.7200.15320.2820.4630.6280.7180.14930.2770.4560

13、.6240.7180.150各管平均值 A 5000.2790.4620.6270.7190.1512繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線3結(jié)果計(jì)算血清蛋白濃度 （ g/ml） = 樣品蛋白質(zhì)濃度 2300代入方程，線性方程為： y=0.005x，將樣品溶液（即 6 號(hào)試管）的吸光度（ 0. 就可得出樣品濃度 X=18.2g/l即該樣本中人血清蛋白濃度為 18.2 g/L,低于正常人平均值。（參考：正常人血清蛋白濃度范圍為 6080 g/L）。實(shí)驗(yàn)報(bào)告第三部分（ 結(jié)果與討論）：結(jié)果（定量實(shí)驗(yàn)包括計(jì)算） ：應(yīng)把所得的實(shí)驗(yàn)結(jié) 果（如觀察現(xiàn)象）和數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、歸納、分析、對(duì)比，盡量用圖表的形式概括實(shí)驗(yàn)的 結(jié)果；討論：不應(yīng)是

14、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重述，而是以結(jié)果為基礎(chǔ)的邏輯推論。結(jié)論：簡單 扼要，說明本次實(shí)驗(yàn)所獲得的結(jié)果。 （包括思考題）。評(píng)分（滿分 45 分）：XX】 一、 結(jié)果1.實(shí)驗(yàn)測(cè)得的人血清蛋白濃度為 18.2 g/L，較標(biāo)準(zhǔn)值低。二、討論 本實(shí)驗(yàn)測(cè)得樣本人血清蛋白濃度偏低，原因可能有： 1、樣本人體較正常人體蛋白濃度偏低2、Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，試劑被還原影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果3、讀數(shù)、試劑加入時(shí)間不夠精確4、分光光度計(jì)溶液管表面油漬、污穢較多影響對(duì)光波長的分析三、結(jié)論1.實(shí)驗(yàn)測(cè)得的人血清蛋白濃度為 18.2 g/L，較標(biāo)準(zhǔn)值低。 課后思考題1、試述 Folin- 酚試劑法的優(yōu)點(diǎn)？Folin-酚試劑法較雙縮脲反應(yīng)靈敏，可以達(dá)到 g 級(jí)別，操作方便，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 性好。2、應(yīng)用本方法有哪些干擾作用？為什么？應(yīng)如何注意？酸堿性干擾。 Folin- 酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，而反應(yīng)試劑是堿性的，