序列分析軟件DNAMAN_的使用方法中文

1、序列分析軟件序列分析軟件DNAMAN 的的 使用方法簡(jiǎn)介使用方法簡(jiǎn)介 饒志明饒志明 博士/教授 博士生導(dǎo)師 江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)微生物中心江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)微生物中心 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 E-mail: nDNAMAN 是一種常用的核酸序列分析是一種常用的核酸序列分析 軟件。由于它功能強(qiáng)大，使用方便，已軟件。由于它功能強(qiáng)大，使用方便，已 成為一種普遍使用的成為一種普遍使用的DNA 序列分析工具。序列分析工具。 打開打開DNAMAN，可以看到如下界面：，可以看到如下界面： n 第一欄為主菜單欄。除了幫助菜單外，有十第一欄為主菜單欄。

2、除了幫助菜單外，有十 個(gè)常用主菜單，個(gè)常用主菜單， n第二欄為工具欄：第二欄為工具欄： n第三欄為瀏覽器欄：第三欄為瀏覽器欄： 在瀏覽器欄下方的工作在瀏覽器欄下方的工作 區(qū)左側(cè)，可見區(qū)左側(cè)，可見Channel 工具條，工具條，DNAMAN 提提 供供20 個(gè)個(gè)Channel，點(diǎn)擊，點(diǎn)擊Channel 工具條上相工具條上相 應(yīng)的數(shù)字，即可擊活相應(yīng)的應(yīng)的數(shù)字，即可擊活相應(yīng)的Channel。 n每個(gè)每個(gè)Channel 可以裝入一個(gè)序列。將要分析可以裝入一個(gè)序列。將要分析 的序列（的序列（DNA 序列或氨基酸序列）放入序列或氨基酸序列）放入 Channel 中可以節(jié)約存取序列時(shí)間，加快分中可以節(jié)約存取

3、序列時(shí)間，加快分 析速度。析速度。 如何使用如何使用DNAMAN 分析序列分析序列 n1將待分析序列裝入將待分析序列裝入Channel n通過通過File Open 命令打開待分析序列文件，則命令打開待分析序列文件，則 打開的序列自動(dòng)裝入默認(rèn)打開的序列自動(dòng)裝入默認(rèn)Channel。 n通過通過Sequence/Load Sequence 菜單的子菜菜單的子菜 單打開文件或?qū)⑦x定的部分序列裝入單打開文件或?qū)⑦x定的部分序列裝入 Channel 。 n通過通過Sequence/Current Sequence/Analysis Defination 命令打開命令打開 一個(gè)對(duì)話框，通過此對(duì)話框可以設(shè)定序

4、列的性一個(gè)對(duì)話框，通過此對(duì)話框可以設(shè)定序列的性 質(zhì)（質(zhì)（DNA 或蛋白質(zhì)），名稱，要分析的片段或蛋白質(zhì)），名稱，要分析的片段 等參數(shù)。等參數(shù)。 2 以不同形式顯示序列以不同形式顯示序列 n通過通過Sequence/Display Sequence 命令打開對(duì)話框，命令打開對(duì)話框， n根據(jù)不同的需要，可以選擇顯示不同的根據(jù)不同的需要，可以選擇顯示不同的 序列轉(zhuǎn)換形式。序列轉(zhuǎn)換形式。 n對(duì)話框選項(xiàng)說明如下：對(duì)話框選項(xiàng)說明如下： nSequence &Composition 顯示序列和顯示序列和 成分成分 2 以不同形式顯示序列以不同形式顯示序列 nReverse Complement Sequen

5、ce 顯示待分顯示待分 析序列的反向互補(bǔ)序列析序列的反向互補(bǔ)序列 nReverse Sequence 顯示待分析序列的反向顯示待分析序列的反向 序列序列 nComplement Sequence 顯示待分析序列的顯示待分析序列的 互補(bǔ)序列互補(bǔ)序列 nDouble Stranded Sequence 顯示待分析序顯示待分析序 列的雙鏈序列列的雙鏈序列 nRNA Sequence 顯示待分析序列的對(duì)應(yīng)顯示待分析序列的對(duì)應(yīng)RNA 序列序列 3DNA 序列的限制性酶切位點(diǎn)分析序列的限制性酶切位點(diǎn)分析 n將待分析的序列裝入將待分析的序列裝入Channel，點(diǎn)擊要分析的，點(diǎn)擊要分析的 Channel，然后

6、通過，然后通過Restriction/Analysis 命令打開命令打開 對(duì)話框，對(duì)話框， n參數(shù)說明如下：參數(shù)說明如下： nResults 分析結(jié)果顯示分析結(jié)果顯示 n其中包括：其中包括： nShow summary（顯示概要）（顯示概要） nShow sites on sequence（在結(jié)果中顯示酶切位點(diǎn)）（在結(jié)果中顯示酶切位點(diǎn)） nDraw restriction map（顯示限制性酶切圖）（顯示限制性酶切圖） nDraw restriction pattern（顯示限制性酶切模式圖）（顯示限制性酶切模式圖） 3DNA 序列的限制性酶切位點(diǎn)分析序列的限制性酶切位點(diǎn)分析 nIgnore

7、enzymes with more than（忽略大于某設(shè)（忽略大于某設(shè) 定值的酶切位點(diǎn)）定值的酶切位點(diǎn)） nIgnore enzymes with less than（忽略小于某設(shè)定（忽略小于某設(shè)定 值的酶切位點(diǎn)）值的酶切位點(diǎn)） nTarget DNA （目標(biāo)（目標(biāo)DNA 特性）特性） nCircular（環(huán)型（環(huán)型DNA），）， ndam/dcm methylation（dam/dcm 甲基化）甲基化） nall DNA in Sequence Channel（選擇此項(xiàng)，在（選擇此項(xiàng)，在 Sequence Channel 中的所有序列將被分析，如果選中的所有序列將被分析，如果選 擇了擇了D

8、raw restriction pattern，那么當(dāng)所有的，那么當(dāng)所有的 channel 中共有兩條中共有兩條DNA 時(shí)，則只能選擇兩個(gè)酶分時(shí)，則只能選擇兩個(gè)酶分 析，如果共有三個(gè)以上析，如果共有三個(gè)以上DNA 時(shí)，則只能用一個(gè)酶分時(shí)，則只能用一個(gè)酶分 析。）析。） n選擇所需的項(xiàng)目，然后按提示操作點(diǎn)擊按扭，出現(xiàn)下選擇所需的項(xiàng)目，然后按提示操作點(diǎn)擊按扭，出現(xiàn)下 列對(duì)話框：列對(duì)話框： n參數(shù)說明如下：參數(shù)說明如下： nEnzyme n代表（代表（enzyme data file），點(diǎn)擊旁邊的下拉按鈕，），點(diǎn)擊旁邊的下拉按鈕， 出現(xiàn)兩個(gè)默認(rèn)選項(xiàng)，出現(xiàn)兩個(gè)默認(rèn)選項(xiàng)，restrict.enz 和和d

9、namane.enz， n如果添加過自制的酶列表，則附加顯示自制酶列表文如果添加過自制的酶列表，則附加顯示自制酶列表文 件名。件名。 n其中其中restrict.enz 數(shù)據(jù)文件包含數(shù)據(jù)文件包含180 種限制酶，種限制酶， dnamane.enz 數(shù)據(jù)文件包含數(shù)據(jù)文件包含2524 種限制酶。種限制酶。 n選擇其中一個(gè)數(shù)據(jù)文件，相應(yīng)的酶在左邊的顯示框中選擇其中一個(gè)數(shù)據(jù)文件，相應(yīng)的酶在左邊的顯示框中 列出（按酶名稱字母表順序），鼠標(biāo)雙擊酶名稱，則列出（按酶名稱字母表順序），鼠標(biāo)雙擊酶名稱，則 對(duì)應(yīng)的酶被選中，在右邊空白框中列出。對(duì)應(yīng)的酶被選中，在右邊空白框中列出。 n要自制酶切列表，可以從左邊酶列

10、表中雙擊鼠標(biāo)選擇多種酶（例要自制酶切列表，可以從左邊酶列表中雙擊鼠標(biāo)選擇多種酶（例 如如puc18 multiple cloning sites），）， n然后點(diǎn)擊按鈕出現(xiàn)下列對(duì)話框：然后點(diǎn)擊按鈕出現(xiàn)下列對(duì)話框： n輸入要保存酶列表的文件名，點(diǎn)擊按鈕即可保存。自制酶列表可輸入要保存酶列表的文件名，點(diǎn)擊按鈕即可保存。自制酶列表可 以方便分析特定的酶切位點(diǎn)。以方便分析特定的酶切位點(diǎn)。 nCutter 酶切識(shí)別序列長(zhǎng)度；酶切識(shí)別序列長(zhǎng)度； nEnd 酶切產(chǎn)生的末端，其中包括，酶切產(chǎn)生的末端，其中包括， nBlunt（平頭末端），（平頭末端）， n5Overhang（5突出粘性末端）突出粘性末端）,

11、n3Overhang(3突出粘性末端突出粘性末端)， n系統(tǒng)根據(jù)系統(tǒng)根據(jù)cutter 和和end 的設(shè)定情況的設(shè)定情況,在左邊酶列表中顯示符合條在左邊酶列表中顯示符合條 件的酶。最后，點(diǎn)擊按鈕執(zhí)行操作。件的酶。最后，點(diǎn)擊按鈕執(zhí)行操作。 4DNA 序列比對(duì)分析序列比對(duì)分析 （Dot Matrix Comparision） n要比較兩個(gè)序列，可以使用要比較兩個(gè)序列，可以使用DNAMAN 提供的序列比對(duì)工具提供的序列比對(duì)工具Dot Matrix Comparision （點(diǎn)矩陣比較）通過（點(diǎn)矩陣比較）通過 Sequense/Dot matrix comparision 命令打開比對(duì)界面，命令打開比對(duì)

12、界面， n點(diǎn)擊對(duì)比界面左上角的按鈕，出現(xiàn)下列點(diǎn)擊對(duì)比界面左上角的按鈕，出現(xiàn)下列 對(duì)話框：對(duì)話框： 參數(shù)說明如下： nSequence type 序列類型序列類型 nSequence 1 參加比對(duì)的第一序列選擇框，框內(nèi)選項(xiàng)參加比對(duì)的第一序列選擇框，框內(nèi)選項(xiàng) 說明如下：說明如下： n如果要比對(duì)的序列在如果要比對(duì)的序列在Channel 中，點(diǎn)擊下拉箭頭，選中，點(diǎn)擊下拉箭頭，選 擇相應(yīng)的擇相應(yīng)的Channel，則被選中的，則被選中的Channel 中的序列作中的序列作 為參加比對(duì)的第一序列；為參加比對(duì)的第一序列； n也可以從文件夾中選擇參加比對(duì)的序列，在也可以從文件夾中選擇參加比對(duì)的序列，在File

13、選擇選擇 框上點(diǎn)擊即可。通過框上點(diǎn)擊即可。通過Length 選擇參加比對(duì)的序列片選擇參加比對(duì)的序列片 段。段。 nSequence 2 參加比對(duì)的第二序列選擇框；選項(xiàng)說明參加比對(duì)的第二序列選擇框；選項(xiàng)說明 同上同上 nShow Sequence 選擇此項(xiàng)，當(dāng)同源性大于設(shè)定值時(shí)，選擇此項(xiàng)，當(dāng)同源性大于設(shè)定值時(shí)， 將顯示同源性；將顯示同源性； nAnnotations 是否顯示注釋是否顯示注釋 nComparision 比對(duì)參數(shù)，比對(duì)參數(shù)， n其中其中Window 代表代表Window size（單位比對(duì)長(zhǎng)度），（單位比對(duì)長(zhǎng)度）， nMismatch 代表代表Mismatch size（單位比對(duì)長(zhǎng)

14、度中許（單位比對(duì)長(zhǎng)度中許 可的錯(cuò)配值）要快速比對(duì)，需將此項(xiàng)設(shè)為可的錯(cuò)配值）要快速比對(duì)，需將此項(xiàng)設(shè)為0。 nBoth stran 代表代表Both strand（雙鏈比對(duì)）選擇此項(xiàng)，（雙鏈比對(duì)）選擇此項(xiàng)， 是指用是指用Sequence 2 中的序列的正鏈和負(fù)鏈分別和中的序列的正鏈和負(fù)鏈分別和 Sequence 1 比較。比較。 nSequence 2 正鏈與正鏈與Sequence 1 比較結(jié)果用黑色點(diǎn)比較結(jié)果用黑色點(diǎn) 表示，表示，Sequence 2 負(fù)鏈比對(duì)結(jié)果用紅色點(diǎn)表示。負(fù)鏈比對(duì)結(jié)果用紅色點(diǎn)表示。 nPlot box 點(diǎn)陣圖表顯示參數(shù)，點(diǎn)陣圖表顯示參數(shù)， nPosition（起點(diǎn)坐標(biāo)）（起

15、點(diǎn)坐標(biāo)） nWidth（寬度值）（寬度值） nHeight（高度值）（高度值） nFrame size（邊框線粗度值）（邊框線粗度值） nDot size（點(diǎn)粗度值）（點(diǎn)粗度值） nGridline（虛線框數(shù)）。（虛線框數(shù)）。 n參數(shù)設(shè)定好后，點(diǎn)擊按鈕執(zhí)行操作。參數(shù)設(shè)定好后，點(diǎn)擊按鈕執(zhí)行操作。 5序列同源性分析序列同源性分析 n（1）兩序列同源性分析）兩序列同源性分析 n通過通過Sequence/Two Sequence Alignment 命令打命令打 開對(duì)話框，如下所示：開對(duì)話框，如下所示： n參數(shù)說明如下：參數(shù)說明如下： nAlignment method 比對(duì)方法，比對(duì)方法， n通常可

16、選通常可選Quick(快速比對(duì)快速比對(duì))或或Smith&Waterman(最最 佳比對(duì)佳比對(duì))， n當(dāng)選擇快速比對(duì)時(shí)，設(shè)置較小的當(dāng)選擇快速比對(duì)時(shí)，設(shè)置較小的k-tuple 值，可以提值，可以提 高精確度，高精確度， n當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，一般要設(shè)置較大的當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，一般要設(shè)置較大的k-tuple 值。值。k- tuple 值可選范圍值可選范圍26； n蛋白質(zhì)序列：蛋白質(zhì)序列：k-tuple 值可選范圍值可選范圍13。 （2）多序列同源性分析）多序列同源性分析 n通過打開通過打開Sequence/Multiple Sequence Alignment 命令打開對(duì)話框，命令打開對(duì)話框， n參數(shù)說明如下

17、：參數(shù)說明如下： nFile 從文件中選擇參加比對(duì)的序列從文件中選擇參加比對(duì)的序列 nFolder 從文件夾中選擇參加比對(duì)的序列從文件夾中選擇參加比對(duì)的序列 nChannel 從從channel 中選擇參加比對(duì)的序列中選擇參加比對(duì)的序列 nDbase 從數(shù)據(jù)庫中選擇參加比對(duì)的序列從數(shù)據(jù)庫中選擇參加比對(duì)的序列 nRemove 清除選擇的序列（鼠標(biāo)點(diǎn)擊左邊顯示框中的清除選擇的序列（鼠標(biāo)點(diǎn)擊左邊顯示框中的 序列名選擇）序列名選擇） nClear 清除全部序列清除全部序列 n點(diǎn)擊按鈕，出現(xiàn)方法選擇對(duì)話框：點(diǎn)擊按鈕，出現(xiàn)方法選擇對(duì)話框： n選擇其中一種方法，點(diǎn)擊按鈕，出現(xiàn)下列對(duì)話框：選擇其中一種方法，點(diǎn)

18、擊按鈕，出現(xiàn)下列對(duì)話框： n如果在前一對(duì)話框選擇的是如果在前一對(duì)話框選擇的是Fast alignment,則在此對(duì)話框中選則在此對(duì)話框中選 擇擇Quick alignment,否則選擇否則選擇 Dynamic alignment 即可。其即可。其 它參數(shù)不必改變，點(diǎn)擊對(duì)話框中間的使其它參數(shù)取原始默認(rèn)值。它參數(shù)不必改變，點(diǎn)擊對(duì)話框中間的使其它參數(shù)取原始默認(rèn)值。 n點(diǎn)擊左上角按鈕，可以從彈出的對(duì)話框中選擇不同的結(jié)果顯示特點(diǎn)擊左上角按鈕，可以從彈出的對(duì)話框中選擇不同的結(jié)果顯示特 性選項(xiàng)。點(diǎn)擊按鈕下的按鈕，出現(xiàn)下列選擇項(xiàng)：性選項(xiàng)。點(diǎn)擊按鈕下的按鈕，出現(xiàn)下列選擇項(xiàng)： 可以通過這些選項(xiàng)，繪制同源關(guān)系圖（例

19、如可以通過這些選項(xiàng)，繪制同源關(guān)系圖（例如Tree/homology tree 命令）。命令）。 n顯示蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)（顯示蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)（Protein Secondary Structure 命令），命令）， n繪制限制性酶切圖（繪制限制性酶切圖（Restriction Analysis 命令）等。命令）等。 6.PCR 引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì) n首先，將目標(biāo)首先，將目標(biāo)DNA 片段裝入片段裝入Channel,并激活并激活Channel。 n點(diǎn)擊主菜單欄中的點(diǎn)擊主菜單欄中的Primer 主菜單，出現(xiàn)下拉菜單，主菜單，出現(xiàn)下拉菜單， n點(diǎn)擊點(diǎn)擊Design PCR Primers for DNA 命

20、令，出現(xiàn)下列對(duì)話框：命令，出現(xiàn)下列對(duì)話框： 參數(shù)說明如下：參數(shù)說明如下： nPrimer locations on target 引物定位引物定位 n其中包括下列選項(xiàng)：其中包括下列選項(xiàng)： nProduct size（擴(kuò)增目的片段大?。〝U(kuò)增目的片段大?。?nSense primer (正向引物選擇區(qū)正向引物選擇區(qū)) nAntisense primer(反向引物選擇區(qū)反向引物選擇區(qū)) nPrimer 引物特性包括引物特性包括Length(引物長(zhǎng)度引物長(zhǎng)度)，Tm 值值, GC 含量等參含量等參 數(shù)；數(shù)； nReject primer 引物過濾（將符合引物過濾條件的引物過濾掉）引物過濾（將符合引物

21、過濾條件的引物過濾掉） n包括下列選項(xiàng)：包括下列選項(xiàng)： n3dimer(可形成可形成3端自我互補(bǔ)的堿基數(shù)端自我互補(bǔ)的堿基數(shù)) nHairpin stem(可形成發(fā)卡頸環(huán)結(jié)構(gòu)的堿基數(shù)可形成發(fā)卡頸環(huán)結(jié)構(gòu)的堿基數(shù)) nPolyN(多聚堿基多聚堿基) n3Uique(3端嚴(yán)格配對(duì)堿基數(shù)端嚴(yán)格配對(duì)堿基數(shù)) nAll matches(引物互補(bǔ)配對(duì)百分?jǐn)?shù)引物互補(bǔ)配對(duì)百分?jǐn)?shù)) nConsentrations 濃度設(shè)定濃度設(shè)定 nProduct for hybridyzat nPCR 產(chǎn)物用于產(chǎn)物用于Southern Blot 探針雜交探針雜交 7畫質(zhì)粒模式圖畫質(zhì)粒模式圖 n我們常常要用到各種質(zhì)粒圖，無論是制作

22、幻燈片，還是發(fā)表文章，我們常常要用到各種質(zhì)粒圖，無論是制作幻燈片，還是發(fā)表文章， 常常需要質(zhì)粒圖。常常需要質(zhì)粒圖。DNAMAN 提供強(qiáng)大的繪質(zhì)粒圖功能，能滿足提供強(qiáng)大的繪質(zhì)粒圖功能，能滿足 我們的需要。我們的需要。 n通過通過Restriction/Draw map 命令打開質(zhì)粒繪圖界面：命令打開質(zhì)粒繪圖界面： 將鼠標(biāo)移動(dòng)到圓圈上，等鼠標(biāo)變形成將鼠標(biāo)移動(dòng)到圓圈上，等鼠標(biāo)變形成“I”時(shí)，單擊鼠標(biāo)左鍵，出時(shí)，單擊鼠標(biāo)左鍵，出 現(xiàn)如下菜單：現(xiàn)如下菜單： n菜單說明如下：菜單說明如下： nPosition 當(dāng)前位置當(dāng)前位置 nAdd Site 添加酶切位點(diǎn)添加酶切位點(diǎn) nAdd Element 添加要

23、素添加要素 nAdd Text 添加文字添加文字 nInsert Fragment 插入片斷插入片斷 nCopy Fragment 復(fù)制片斷復(fù)制片斷 nCut Fragment 剪切片斷剪切片斷 nRemove Fragment 清除片斷清除片斷 nFrame Thickness 邊框線粗細(xì)調(diào)節(jié)邊框線粗細(xì)調(diào)節(jié) n點(diǎn)擊點(diǎn)擊Add Site 選項(xiàng)，出現(xiàn)對(duì)話框：選項(xiàng)，出現(xiàn)對(duì)話框： n參數(shù)說明如下：參數(shù)說明如下： nName 要添加的酶切位點(diǎn)的名稱要添加的酶切位點(diǎn)的名稱(例如例如HindIII) nPosition 位置（以堿基數(shù)表示）位置（以堿基數(shù)表示） n點(diǎn)擊點(diǎn)擊Add Element 選項(xiàng)，出現(xiàn)

24、如下對(duì)話框：選項(xiàng)，出現(xiàn)如下對(duì)話框： 參數(shù)說明如下：參數(shù)說明如下： nType 要素類型（共有三種類型，鼠標(biāo)點(diǎn)擊即可切換）要素類型（共有三種類型，鼠標(biāo)點(diǎn)擊即可切換） nColor/Pattern 填充色（共有填充色（共有16 種顏色供選擇）種顏色供選擇） nName 要素名稱要素名稱 nStart /End/Size 要素起點(diǎn)要素起點(diǎn)/終點(diǎn)終點(diǎn)/粗細(xì)度粗細(xì)度 核酸序列的一般分析流程核酸序列的一般分析流程 n1.1 核酸序列的檢索核酸序列的檢索 :80/entrez/quer y.fcgi?db=Nucleotide 1.2 核酸序列的同源性分析

25、核酸序列的同源性分析 n1.2.1 基于基于NCBI/Blast軟件的核酸序列同源性分析軟件的核酸序列同源性分析 /blast/blast.cgi 1.2.2 核酸序列的兩兩比較核酸序列的兩兩比較 /gorf/bl2.html n1.2.3 核酸序列的批量聯(lián)網(wǎng)同源性分析核酸序列的批量聯(lián)網(wǎng)同源性分析(方案方案) n1.3 核酸序列的電子延伸核酸序列的電子延伸 1.3.1 利用利用UniGene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子延伸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子延伸(方案方案) n1.3.2 利用利用Tigem的的EST Mach

26、ine進(jìn)行電子延伸進(jìn)行電子延伸 EST Extractor: http:/gcg.tigem.it/blastextract/estextract.ht ml | EST Assembly: http:/www.tigem/ESTmachine.html 1.3.3 利用利用THC數(shù)據(jù)庫對(duì)核酸序列進(jìn)行電子延伸數(shù)據(jù)庫對(duì)核酸序列進(jìn)行電子延伸 http:/gcg.tigem.it/UNIBLAST/uniblast.html n1.4 核酸序列的開放閱讀框架分析核酸序列的開放閱讀框架分析 1.4.1基于基于NCBI/ORF finder的的ORF分析分析 http:/www.ncbi.nlm.nih

27、.gov/gorf/gorf.html n1.5 基因的電子表達(dá)譜分析基因的電子表達(dá)譜分析 n1.5.1 利用利用UniGene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子表達(dá)譜分析（方數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子表達(dá)譜分析（方 案）案） n1.5.2利用利用Tigem的電子原位雜交服務(wù)器進(jìn)行電子表達(dá)的電子原位雜交服務(wù)器進(jìn)行電子表達(dá) 譜分析譜分析 http:/gcg.tigem.it/INSITU/insitublast.html n1.6 核酸序列的電子基因定位分析核酸序列的電子基因定位分析 1.6.1 利用利用STS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子基因定位數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子基因定位 /geno me/s

28、ts/epcr.cgi 1.6.2 利用利用UniGene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子基因 定位（方案）定位（方案） n1.7 cDNA的基因組序列分析的基因組序列分析 1.7.1 通過從通過從NCBI查詢部分基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因組查詢部分基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因組 序列的分析序列的分析(方案方案) 1.7.2 通過從通過從NCBI查詢?nèi)炕蚪M數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因組查詢?nèi)炕蚪M數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因組 序列的分析序列的分析 /genome/seq/pa ge.cgi?F=HsBlast.html&ORG=Hs 1.7.3 通過從通過從Sanger Ce

29、ntre查詢基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查詢基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 基因組序列的分析基因組序列的分析 http:/www.sanger.ac.uk/HGP/blast_server.s html n1.8 基因組序列的初步分析基因組序列的初步分析 1.8.1 基因組序列的內(nèi)含子基因組序列的內(nèi)含子/外顯子分析外顯子分析 /urllists/ genefind.htm 1.8.2 基因組序列的啟動(dòng)子分析基因組序列的啟動(dòng)子分析 http:/www- /projects/promoter.html n1.9核酸序列的注冊(cè) 1.9.1 EST序列的注冊(cè)

30、(方案) 1.9.2 較長(zhǎng)或全長(zhǎng)cDNA序列的注冊(cè)(方案) n1.10待分析序列所對(duì)應(yīng)的已知克隆的獲取 引 物 設(shè) 計(jì) n引物 n引物的重要性 n引物設(shè)計(jì)的原則 n引物與PCR n引物設(shè)計(jì)軟件 n如何使用Primer Premier 5.0 n引物同源性分析 引物（primers) n引物是人工合成的兩段 寡核苷酸序列，一個(gè)引 物與感興趣區(qū)域一端的 一條DNA模板鏈互補(bǔ)， 另一個(gè)引物與感興趣區(qū) 域另一端的另一條DNA 模板鏈互補(bǔ)。 3 3 5 5 Sense primer Antisense primer 引物的重要性 n在整個(gè)PCR體系中, 引物占有

31、十分重要的 地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特 異結(jié)合，不與其他非目的DNA結(jié)合，PCR 的靈敏性要求DNA聚合酶能對(duì)引物進(jìn)行 有效的延伸，可見引物設(shè)計(jì)好壞與PCR結(jié) 果密切相關(guān)。 引物設(shè)計(jì)原則 n引物長(zhǎng)度 n堿基分布的均衡性 nTm值 n引物二級(jí)結(jié)構(gòu) n引物3端 n引物5端 n引物的內(nèi)部穩(wěn)定性 n引物的保守性與特異性 n擴(kuò)增區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu) 引物長(zhǎng)度 n一般為15-30個(gè)核苷酸，在做長(zhǎng)片段PCR 或做某些特殊的PCR時(shí)應(yīng)使用較長(zhǎng)的引物， 但最多不超過50個(gè)核苷酸。 堿基分布的均衡性 n同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應(yīng)超過5個(gè) nGC含量一般40-60% nGC含量太低導(dǎo)致引物Tm值較低，使用較低 的

32、退火溫度不利于提高PCR的特異性 nGC含量太高也易于引發(fā)非特異擴(kuò)增。 引物Tm值 n一般要求：55-65。 n計(jì)算： n對(duì)于低于20個(gè)堿基的引物，Tm值可根據(jù) Tm=4(G+C)+2(A+T)來粗略估算 n對(duì)于較長(zhǎng)引物，Tm值則需要考慮熱動(dòng)力學(xué) 參數(shù)，從“最近鄰位”的計(jì)算方式得到，這 也是現(xiàn)有的引物設(shè)計(jì)軟件最常用的計(jì)算方式。 nTm = H/( S + R * ln (C/4) + 16.6 log (K+/(1 + 0.7 K+) - 273.15 引物二級(jí)結(jié)構(gòu) n引物二聚體 n盡可能避免兩個(gè)引物分子之間3端有有較多 堿基互補(bǔ) n發(fā)夾結(jié)構(gòu) n尤其是要避免引物3端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則 將嚴(yán)重影

33、響DNA聚合酶的延伸。 引物3端 n引物的延伸從3端開始，因此3端的幾個(gè) 堿基與模板DNA均需嚴(yán)格配對(duì)，不能進(jìn) 行任何修飾，否則不能進(jìn)行有效的延伸， 甚至導(dǎo)致PCR擴(kuò)增完全失敗?？紤]到密碼 子的簡(jiǎn)并性，引物3端最后一個(gè)堿基最好 不與密碼子第三個(gè)堿基配對(duì)。 引物5端 n引物5端可以有與模板DNA不配對(duì)堿基， 在5端引入一段非模板依賴性序列。 n5端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)序列（酶切 位點(diǎn)5端加上適當(dāng)數(shù)量的保護(hù)堿基）。 n5端的某一位點(diǎn)修改某個(gè)堿基，人為地在產(chǎn) 物中引入該位點(diǎn)的點(diǎn)突變以作研究。 n5端標(biāo)記放射性元素或非放射性物質(zhì)（如生 物素、地高辛等）。 引物的內(nèi)部穩(wěn)定性 n過去認(rèn)為，引物3端應(yīng)牢

34、牢結(jié)合在模板上才能 有效地進(jìn)行延伸，故3端最好為G或C。 n現(xiàn)在的觀點(diǎn)認(rèn)為，引物的5端應(yīng)是相對(duì)穩(wěn)定結(jié) 構(gòu)，而3端在堿基配對(duì)的情況下最好為低穩(wěn)定 性結(jié)構(gòu)，即3端盡可能選用A或T，少用G或C。 n僅僅3端幾個(gè)堿基與非特異位點(diǎn)上的堿基形成的低 穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)是難以有效引發(fā)引物延伸的。 n如果3端為富含G、C的結(jié)構(gòu)，只需3端幾個(gè)堿基與 模板互補(bǔ)結(jié)合，就可能引發(fā)延伸，造成假引發(fā)。 引物的保守性與特異性 n保守性：通用引物檢測(cè)同一類病原 微生物盡可能多的型別 n特異性：避免非特異性擴(kuò)增 擴(kuò)增區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu) n模板DNA的某些區(qū)域具有高度復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)， 在選擇引物時(shí)，應(yīng)使擴(kuò)增區(qū)域盡可能避開這些 區(qū)域。 n擴(kuò)增區(qū)域的自由能（G。）小于 58.61kJ/mol n引物Tm值與PCR產(chǎn)物Tm值相差一般不超過30 nTm product = 81.5 + 16.6 log (K+/(1+0.7K+) + 0.41 (%G + %C) - 500/length 引物與PCR n引物濃度：一般為0.1-0.5umol/L n引物濃度(uM)=n OD33/（A312C288 G328T303-61）/VH2O VH2O (單位：L) n退火溫度 n最適退火溫度（Ta Opt ） = 0.3 (Tm of primer) + 0.7 (Tm of produ