第三章細(xì)胞破碎

1、生物分離工程 Bioseparation Engineering 第三章 細(xì)胞破碎 生物分離過(guò)程的一般流程生物分離過(guò)程的一般流程 不同類(lèi)型的細(xì)胞分泌目標(biāo)產(chǎn)物的類(lèi)型：不同類(lèi)型的細(xì)胞分泌目標(biāo)產(chǎn)物的類(lèi)型： n動(dòng)物細(xì)胞：大多無(wú)細(xì)胞壁，其培養(yǎng)產(chǎn)物大多分泌動(dòng)物細(xì)胞：大多無(wú)細(xì)胞壁，其培養(yǎng)產(chǎn)物大多分泌 在培養(yǎng)液中。在培養(yǎng)液中。 n植物細(xì)胞：多為胞內(nèi)產(chǎn)物。植物細(xì)胞：多為胞內(nèi)產(chǎn)物。 n微生物：大多數(shù)小分子代謝產(chǎn)物分泌在胞外；微生物：大多數(shù)小分子代謝產(chǎn)物分泌在胞外； 大多數(shù)大分子產(chǎn)物和基因重組產(chǎn)物為大多數(shù)大分子產(chǎn)物和基因重組產(chǎn)物為 胞內(nèi)產(chǎn)物，胞內(nèi)產(chǎn)物，如胰島素、干擾素、白細(xì)如胰島素、干擾素、白細(xì) 胞介素胞介素-2等

2、等均為胞內(nèi)產(chǎn)物。均為胞內(nèi)產(chǎn)物。 對(duì)于胞內(nèi)產(chǎn)物，對(duì)于胞內(nèi)產(chǎn)物，首先必須將細(xì)胞破碎，使產(chǎn)物得首先必須將細(xì)胞破碎，使產(chǎn)物得 以釋放，才能進(jìn)一步提取。以釋放，才能進(jìn)一步提取。 第三章 細(xì)胞破碎 3.1 細(xì)胞壁的組成與結(jié)構(gòu) 3.2 細(xì)胞破碎技術(shù)的分類(lèi) 3.3 常用破碎技術(shù) 3.4 破碎率的測(cè)定 3.5 破碎技術(shù)的發(fā)展方向 n細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎（cell rupture）技術(shù)是指利用外力破壞）技術(shù)是指利用外力破壞 細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)包括目的產(chǎn)物成細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)包括目的產(chǎn)物成 分釋放出來(lái)的技術(shù)。分釋放出來(lái)的技術(shù)。 n為了研究細(xì)胞破碎，提高其破碎率，有必要了解為了研究細(xì)胞破碎，提高其破碎

3、率，有必要了解 細(xì)胞壁細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)。的組成和結(jié)構(gòu)。 3.1 細(xì)胞壁的組成與結(jié)構(gòu) n微生物細(xì)胞的外圍通常包括細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。微生物細(xì)胞的外圍通常包括細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。 細(xì)胞膜（內(nèi)壁）：具有高度選擇性的半透膜，控細(xì)胞膜（內(nèi)壁）：具有高度選擇性的半透膜，控 制胞內(nèi)外一些物質(zhì)的交換滲透作用；制胞內(nèi)外一些物質(zhì)的交換滲透作用； 細(xì)胞壁（外壁）：具有固定細(xì)胞外形和保護(hù)細(xì)胞細(xì)胞壁（外壁）：具有固定細(xì)胞外形和保護(hù)細(xì)胞 免受機(jī)械損傷的功能。免受機(jī)械損傷的功能。 n細(xì)胞破碎的主要阻力來(lái)自于細(xì)胞壁細(xì)胞破碎的主要阻力來(lái)自于細(xì)胞壁，不同類(lèi)型的微，不同類(lèi)型的微 生物其細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)特性是不同的，取決于遺傳和生物其細(xì)胞壁的

4、結(jié)構(gòu)特性是不同的，取決于遺傳和 環(huán)境因素。環(huán)境因素。 3.1 細(xì)胞壁的組成與結(jié)構(gòu) 革蘭氏革蘭氏 陽(yáng)性細(xì)菌陽(yáng)性細(xì)菌 革蘭氏革蘭氏 陰性細(xì)菌陰性細(xì)菌 酵酵 母母 霉霉 菌菌 植物細(xì)胞植物細(xì)胞 壁厚壁厚(nm) 2080 1013 100300 100250 27 m 層次層次 單層單層多層多層多層多層多層多層多層多層 主要組成主要組成 肽聚糖肽聚糖 磷壁酸磷壁酸 肽聚糖肽聚糖 脂蛋白脂蛋白 脂多糖脂多糖 磷磷 脂脂 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 葡聚糖葡聚糖 甘露聚糖甘露聚糖 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 脂脂 類(lèi)類(lèi) 多聚糖多聚糖 脂脂 類(lèi)類(lèi) 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 纖維素纖維素 半纖維素半纖維素 果膠物質(zhì)果膠物質(zhì) 木質(zhì)素木質(zhì)素 蛋白質(zhì)蛋

5、白質(zhì) 破碎破碎 難易程度難易程度 較難破碎較難破碎較易破碎較易破碎較難破碎較難破碎難破碎難破碎很難破碎很難破碎 3.2 細(xì)胞破碎技術(shù)的分類(lèi) 分分 類(lèi)類(lèi)破碎原理破碎原理破碎技術(shù)舉例破碎技術(shù)舉例 機(jī)械法機(jī)械法 固體剪切作用固體剪切作用珠磨法珠磨法 、x-press法法 液體剪切作用液體剪切作用高壓勻漿高壓勻漿 、超聲破碎、超聲破碎 非機(jī)械法非機(jī)械法 溶胞作用溶胞作用酶溶法酶溶法 、物理法、物理法、化學(xué)法化學(xué)法 膜失水作用膜失水作用干燥處理干燥處理 機(jī)械破碎機(jī)械破碎 珠磨法 擠壓法 勻漿法 超聲法 物理破碎物理破碎 溫度差破碎法 壓力差破碎法 化學(xué)破碎化學(xué)破碎 有機(jī)溶劑 表面活性劑 酸堿 酶促破碎酶

6、促破碎 自溶法 外加酶制劑法 通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切 力，使組織、細(xì)胞破碎。力，使組織、細(xì)胞破碎。 通過(guò)各種物理因素的作用，通過(guò)各種物理因素的作用， 使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破 壞，而使細(xì)胞破碎。壞，而使細(xì)胞破碎。 通過(guò)各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜通過(guò)各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜 的作用，而使細(xì)胞破碎。的作用，而使細(xì)胞破碎。 通過(guò)細(xì)胞本身的酶系或外加通過(guò)細(xì)胞本身的酶系或外加 酶制劑的催化作用，使細(xì)胞酶制劑的催化作用，使細(xì)胞 外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到 細(xì)胞破碎。細(xì)胞破碎。 幾種細(xì)胞破碎方式的比較幾種細(xì)胞破碎方式的比較 影響破碎難易程度的重要因素

7、：影響破碎難易程度的重要因素： n機(jī)械法機(jī)械法細(xì)胞的大小和形狀、細(xì)胞的大小和形狀、細(xì)胞壁厚度細(xì)胞壁厚度、聚、聚 合物交聯(lián)程度。顯然，細(xì)胞個(gè)體小、球形、壁厚、合物交聯(lián)程度。顯然，細(xì)胞個(gè)體小、球形、壁厚、 聚合物交聯(lián)程度高是最難破碎的。（聚合物交聯(lián)程度高是最難破碎的。（破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞） n非機(jī)械法非機(jī)械法細(xì)胞壁、膜的組成和結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁、膜的組成和結(jié)構(gòu)。了解細(xì)。了解細(xì) 胞壁的組成和結(jié)構(gòu)，就可選擇合適的溶菌酶和化胞壁的組成和結(jié)構(gòu)，就可選擇合適的溶菌酶和化 學(xué)試劑，以及在使用多種酶或化學(xué)試劑相結(jié)合時(shí)學(xué)試劑，以及在使用多種酶或化學(xué)試劑相結(jié)合時(shí) 確定其使用的順序確定其使用的順序 。（。（溶解壁膜上的某些組成

8、溶解壁膜上的某些組成 打洞打洞） 3.3常用破碎技術(shù) 3.3.1珠磨法（珠磨法（bead millbead mill）實(shí)驗(yàn)常用實(shí)驗(yàn)常用 n工作原理：工作原理：細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的珠子細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的珠子( (玻璃、石英玻璃、石英 砂、氧化鋁等研磨劑，直徑砂、氧化鋁等研磨劑，直徑1mm)1mm)一起一起快速攪拌快速攪拌 或或研磨研磨，研磨劑珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰，研磨劑珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰 撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。 n實(shí)驗(yàn)室規(guī)模：實(shí)驗(yàn)室規(guī)模：MickleMickle高速組織搗碎機(jī)、高速組織搗碎機(jī)、BraunBraun勻漿勻漿 器；器； n中試規(guī)模

9、：膠質(zhì)磨；中試規(guī)模：膠質(zhì)磨； n工業(yè)規(guī)模：高速珠磨機(jī)工業(yè)規(guī)模：高速珠磨機(jī)(High-speed bead mill)(High-speed bead mill)。 3.3.1 珠磨法 n細(xì)胞破碎率可用一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)表示細(xì)胞破碎率可用一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)表示 ： 間歇操作：間歇操作： ln1/(1-ln1/(1-R R)=)=KtKt 連續(xù)操作：連續(xù)操作： ln1/(1-ln1/(1-R R)=)=KK 其中其中 = =V V/ /F F 式中：式中： R R破碎率（破碎率（g/gg/g） K K反應(yīng)速率常數(shù)反應(yīng)速率常數(shù)(1/s)(1/s) t t破碎時(shí)間破碎時(shí)間(s)(s) 平均停留時(shí)間平均停留時(shí)間

10、(s)(s) V V破碎室懸浮液體積（破碎室懸浮液體積（L L） F F進(jìn)料速率進(jìn)料速率(L/s) (L/s) 操作條件的選擇：操作條件的選擇： n珠體大小珠體大小根據(jù)細(xì)胞大小、濃根據(jù)細(xì)胞大小、濃 度以及連續(xù)操作時(shí)不使珠體帶出度以及連續(xù)操作時(shí)不使珠體帶出 來(lái)選擇。來(lái)選擇。 n珠體裝量珠體裝量裝量少時(shí)，細(xì)胞不裝量少時(shí)，細(xì)胞不 易破碎；裝量大時(shí)，能量消耗大，易破碎；裝量大時(shí)，能量消耗大， 研磨室熱擴(kuò)散性能降低，引起溫研磨室熱擴(kuò)散性能降低，引起溫 度升高。度升高。 n溫度溫度溫度高時(shí)細(xì)胞較易破碎，溫度高時(shí)細(xì)胞較易破碎， 但要考慮目的產(chǎn)物不受破壞。一但要考慮目的產(chǎn)物不受破壞。一 般溫度控制在般溫度控制

11、在5 54040內(nèi)時(shí)影響內(nèi)時(shí)影響 較小。較小。 攪拌轉(zhuǎn)速攪拌轉(zhuǎn)速過(guò)高將過(guò)高將 使能量消耗大增，而使能量消耗大增，而 破碎率破碎率上升不明顯上升不明顯。 R n 能耗 破碎率的控制：破碎率的控制： n破碎率高時(shí)，單位破碎細(xì)胞的能耗明顯上升破碎率高時(shí)，單位破碎細(xì)胞的能耗明顯上升 ； n高破碎率高破碎率產(chǎn)生較多的熱能，增大了冷卻控溫的難產(chǎn)生較多的熱能，增大了冷卻控溫的難 度；度； n破碎率破碎率越越高，細(xì)胞碎片高，細(xì)胞碎片越越小，分離碎片小，分離碎片越越困難困難； n高破碎率下，高破碎率下，目的產(chǎn)物的失活損失增加。目的產(chǎn)物的失活損失增加。 珠磨法的珠磨法的破碎率一般控制在破碎率一般控制在80%80%

12、以下以下，并兼顧下游，并兼顧下游 過(guò)程。過(guò)程。 3.3.2 高壓勻漿法 ( (High-pressure homogenization) ) 大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法 n工作原理：利用高壓使細(xì)工作原理：利用高壓使細(xì) 胞懸浮液通過(guò)針形閥，由胞懸浮液通過(guò)針形閥，由 于突然減壓和高速?zèng)_擊撞于突然減壓和高速?zèng)_擊撞 擊環(huán)使細(xì)胞破裂。在高壓擊環(huán)使細(xì)胞破裂。在高壓 勻漿器中，高壓室的壓力勻漿器中，高壓室的壓力 高達(dá)幾百個(gè)大氣壓，細(xì)胞高達(dá)幾百個(gè)大氣壓，細(xì)胞 懸浮液自高壓室針形閥噴懸浮液自高壓室針形閥噴 出時(shí)，速度可達(dá)每秒幾百出時(shí)，速度可達(dá)每秒幾百 米。米。 破碎的動(dòng)力學(xué)方程：破碎的動(dòng)力

13、學(xué)方程： 式中：式中：KT與溫度等有關(guān)的破碎常數(shù)與溫度等有關(guān)的破碎常數(shù) N懸浮液通過(guò)勻漿器的次數(shù)懸浮液通過(guò)勻漿器的次數(shù) P操作壓力操作壓力 aa微生物種類(lèi)常數(shù)，對(duì)于酵母菌微生物種類(lèi)常數(shù)，對(duì)于酵母菌a a值可取值可取2.22.2 a T NPKR)1/(1ln 破碎壓力的選擇：破碎壓力的選擇： n增大壓力和增加破碎次數(shù)都可以提高破碎增大壓力和增加破碎次數(shù)都可以提高破碎 率，但當(dāng)壓力增大到一定程度后對(duì)勻漿器率，但當(dāng)壓力增大到一定程度后對(duì)勻漿器 的磨損較大，此外當(dāng)壓力超過(guò)一定值后，的磨損較大，此外當(dāng)壓力超過(guò)一定值后， 破碎率的增加很慢。破碎率的增加很慢。 n在工業(yè)生產(chǎn)中，通常采用的壓力為在工業(yè)生產(chǎn)中

14、，通常采用的壓力為5555 70MPa70MPa。 破碎一般規(guī)律：破碎一般規(guī)律： （1）酵母較細(xì)菌難破碎；酵母較細(xì)菌難破碎； （2 2）處于靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞較處于快速生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞難）處于靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞較處于快速生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞難 破碎；破碎； （3 3）在復(fù)合培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細(xì)胞比在簡(jiǎn)單合成培養(yǎng)基上）在復(fù)合培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細(xì)胞比在簡(jiǎn)單合成培養(yǎng)基上 培養(yǎng)的細(xì)胞較難破碎。培養(yǎng)的細(xì)胞較難破碎。 n不宜采用高壓勻漿法破碎的有：不宜采用高壓勻漿法破碎的有： （1 1）易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌，）易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌， （2 2）較小的革蘭氏陽(yáng)性菌，）較小的革蘭氏陽(yáng)性菌， （3 3）某些質(zhì)地堅(jiān)硬的亞細(xì)胞

15、如包含體）某些質(zhì)地堅(jiān)硬的亞細(xì)胞如包含體（inclusion body）。 3.3.3 超聲破碎（超聲破碎（UltrasonicationUltrasonication） 主要用于實(shí)驗(yàn)室主要用于實(shí)驗(yàn)室 n破碎機(jī)理：可能與空化現(xiàn)象（破碎機(jī)理：可能與空化現(xiàn)象（Cavitation Cavitation phenomenaphenomena）引起的沖擊波和剪切作用有關(guān)。）引起的沖擊波和剪切作用有關(guān)。 n通常采用的超聲破碎機(jī)在通常采用的超聲破碎機(jī)在151525KHz25KHz的頻率的頻率 下操作。下操作。 n超聲破碎的效率與聲頻、聲能、處理時(shí)間、超聲破碎的效率與聲頻、聲能、處理時(shí)間、 細(xì)胞濃度及菌種類(lèi)型

16、等因素有關(guān)。細(xì)胞濃度及菌種類(lèi)型等因素有關(guān)。 超聲破碎的適用性：超聲破碎的適用性： n細(xì)胞種類(lèi)：細(xì)胞種類(lèi)：桿菌比球菌較易破碎，革蘭氏陰性細(xì)桿菌比球菌較易破碎，革蘭氏陰性細(xì) 胞比革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞較易破碎，對(duì)酵母菌的效果胞比革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞較易破碎，對(duì)酵母菌的效果 較差。較差。 n超聲波振蕩易引起超聲波振蕩易引起溫度的劇烈上升溫度的劇烈上升，操作時(shí)常在，操作時(shí)常在 冷卻條件下進(jìn)行。小規(guī)模實(shí)驗(yàn)常采用間歇操作，冷卻條件下進(jìn)行。小規(guī)模實(shí)驗(yàn)常采用間歇操作， 大規(guī)模生產(chǎn)受限制。大規(guī)模生產(chǎn)受限制。 n超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性某些敏感性活性 物質(zhì)失活物質(zhì)失活，因而有一定的

17、局限性。，因而有一定的局限性。 3.3.4 酶溶法酶溶法研究較廣的一種方法研究較廣的一種方法 n原理：利用酶反應(yīng)，分解破壞細(xì)胞壁上的特殊鍵，原理：利用酶反應(yīng)，分解破壞細(xì)胞壁上的特殊鍵， 從而達(dá)到破壁的目的。從而達(dá)到破壁的目的。 n自溶法自溶法控制一定條件，誘發(fā)細(xì)胞自溶酶使細(xì)控制一定條件，誘發(fā)細(xì)胞自溶酶使細(xì) 胞破碎。胞破碎。自溶法常采用加熱法或干燥法。自溶法常采用加熱法或干燥法。 n外加酶法外加酶法根據(jù)細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)及組成選擇合根據(jù)細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)及組成選擇合 適的酶。適的酶。 細(xì)菌大多用細(xì)菌大多用溶菌酶溶菌酶(lysozyme)(lysozyme) 酵母菌常用溶酶有：酵母菌常用溶酶有： -1,3

18、-1,3-葡聚糖酶葡聚糖酶 (glucanase)(glucanase)、-1,6-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶葡聚糖酶、蛋白酶 (protease)(protease)、甘露糖酶、甘露糖酶(mannanase)(mannanase)、糖苷酶、糖苷酶 (glycosidase)(glycosidase)、肽鍵內(nèi)切酶、肽鍵內(nèi)切酶(endopeptidase)(endopeptidase)、 殼多糖酶等殼多糖酶等 。 酶溶法的特點(diǎn)（外加酶）：酶溶法的特點(diǎn)（外加酶）： （1）酶溶法需要特定的反應(yīng)條件。）酶溶法需要特定的反應(yīng)條件。 （2）酶具有高度專(zhuān)一性，必須根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和酶具有高度專(zhuān)一性，必須根據(jù)細(xì)

19、胞壁的結(jié)構(gòu)和 化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿富蛉苊赶到y(tǒng)，并確定相應(yīng)化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿富蛉苊赶到y(tǒng)，并確定相應(yīng) 的次序。的次序。 （3）酶溶法的優(yōu)點(diǎn)是：具有選擇性釋放產(chǎn)物，條件酶溶法的優(yōu)點(diǎn)是：具有選擇性釋放產(chǎn)物，條件 溫和，核酸泄出量少，細(xì)胞外形完整。溫和，核酸泄出量少，細(xì)胞外形完整。 （4）酶溶法的不足：一是溶酶價(jià)格高；二是酶溶法酶溶法的不足：一是溶酶價(jià)格高；二是酶溶法 通用性差，且不易確定最佳的溶解條件；三是存通用性差，且不易確定最佳的溶解條件；三是存 在產(chǎn)物抑制，在溶酶系統(tǒng)中，甘露糖對(duì)蛋白酶有在產(chǎn)物抑制，在溶酶系統(tǒng)中，甘露糖對(duì)蛋白酶有 抑制作用。抑制作用。 3.3.5 化學(xué)滲透法化學(xué)滲透法 n某些化

20、學(xué)試劑，可以改變細(xì)胞壁或膜的通某些化學(xué)試劑，可以改變細(xì)胞壁或膜的通 透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇 地滲透出來(lái)，這種處理方式稱(chēng)為化學(xué)滲透地滲透出來(lái)，這種處理方式稱(chēng)為化學(xué)滲透 法法(Chemical permeation)(Chemical permeation)。 n常用化學(xué)試劑有：有機(jī)溶劑、變性劑、表常用化學(xué)試劑有：有機(jī)溶劑、變性劑、表 面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等。面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等。 作用原理：作用原理： n化學(xué)滲透法取決于化學(xué)試劑的類(lèi)型以及細(xì)胞壁膜的化學(xué)滲透法取決于化學(xué)試劑的類(lèi)型以及細(xì)胞壁膜的 結(jié)構(gòu)與組成，不同化學(xué)試劑作用的部位和

21、方式有所結(jié)構(gòu)與組成，不同化學(xué)試劑作用的部位和方式有所 不同，現(xiàn)舉例如下。不同，現(xiàn)舉例如下。 （1 1）表面活性物質(zhì)：）表面活性物質(zhì)：可促使細(xì)胞某些組分溶解可促使細(xì)胞某些組分溶解，其增，其增 溶作用有助于細(xì)胞的破碎。如溶作用有助于細(xì)胞的破碎。如TritonX-100TritonX-100能結(jié)合并能結(jié)合并 溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，從而使某些溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，從而使某些 胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)。胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)。 （2 2）EDTAEDTA螯合劑：可用于處理革蘭氏陰性菌（如螯合劑：可用于處理革蘭氏陰性菌（如 E.coliE.coli）, ,它對(duì)其它對(duì)其細(xì)胞外層膜有破壞作用細(xì)胞外層

22、膜有破壞作用。 （3 3）有機(jī)溶劑：能分解細(xì)胞壁中的類(lèi)脂。）有機(jī)溶劑：能分解細(xì)胞壁中的類(lèi)脂。 （4 4）變性劑：）變性劑：如如鹽酸胍鹽酸胍(Guanidin HCl)(Guanidin HCl)和脲（和脲（UreaUrea） 與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用， 從而使疏水性化合物溶于水溶液。從而使疏水性化合物溶于水溶液。 各種試劑的不同作用機(jī)理，將幾種試劑合理地搭各種試劑的不同作用機(jī)理，將幾種試劑合理地搭 配使用能有效地提高胞內(nèi)物質(zhì)的釋放率。配使用能有效地提高胞內(nèi)物質(zhì)的釋放率。 例：例：?jiǎn)为?dú)用單獨(dú)用0.1mol/L0.1mol/L鹽酸胍處理鹽酸

23、胍處理E.coliE.coli僅釋放約僅釋放約1%1%的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì) 0.5% TritonX-1000.5% TritonX-100處理蛋白質(zhì)釋放率為處理蛋白質(zhì)釋放率為4%4% 二者合用，蛋白質(zhì)釋放率可達(dá)二者合用，蛋白質(zhì)釋放率可達(dá)53%53%左右左右 化學(xué)滲透法的優(yōu)點(diǎn)：化學(xué)滲透法的優(yōu)點(diǎn)： 對(duì)產(chǎn)物釋放具有一定選擇性?？墒挂恍┹^對(duì)產(chǎn)物釋放具有一定選擇性?？墒挂恍┹^ 小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白 透過(guò)，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在透過(guò)，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在 胞內(nèi)。胞內(nèi)。 細(xì)胞外形保持完整，碎片少，漿液粘度低，細(xì)胞外形保持完整，碎片少，漿液粘

24、度低， 易于固液分離和進(jìn)一步提取。易于固液分離和進(jìn)一步提取。 化學(xué)滲透法的缺點(diǎn)化學(xué)滲透法的缺點(diǎn) ： （1）通用性差，某種試劑只能作用于某些特通用性差，某種試劑只能作用于某些特 定類(lèi)型的細(xì)胞。定類(lèi)型的細(xì)胞。 （2）時(shí)間長(zhǎng)，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率時(shí)間長(zhǎng)，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率 不超過(guò)不超過(guò)50%50%。 （3）有些化學(xué)試劑有毒性有些化學(xué)試劑有毒性 。 3.3.6 選擇破碎方法的依據(jù)選擇破碎方法的依據(jù) （1）細(xì)胞處理量：大規(guī)模生產(chǎn)多采用機(jī)械法（通用）細(xì)胞處理量：大規(guī)模生產(chǎn)多采用機(jī)械法（通用 性強(qiáng)，破碎效率高），實(shí)驗(yàn)室規(guī)模多選用非機(jī)械性強(qiáng)，破碎效率高），實(shí)驗(yàn)室規(guī)模多選用非機(jī)械 法（選擇性好，固

25、液易分離）。法（選擇性好，固液易分離）。 （2）細(xì)胞壁的強(qiáng)度與結(jié)構(gòu)：見(jiàn)）細(xì)胞壁的強(qiáng)度與結(jié)構(gòu)：見(jiàn)3.2。 （3）目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)破碎條件的敏感性：對(duì)活性物質(zhì)產(chǎn)）目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)破碎條件的敏感性：對(duì)活性物質(zhì)產(chǎn) 品，要兼顧效率與穩(wěn)定性。品，要兼顧效率與穩(wěn)定性。 （4）破碎程度：操作條件要兼顧產(chǎn)物釋放率、能耗）破碎程度：操作條件要兼顧產(chǎn)物釋放率、能耗 和便于后提取。和便于后提取。 3.4 破碎率的測(cè)定 （1 1）直接測(cè)定法）直接測(cè)定法利用顯微鏡或電子微粒計(jì)數(shù)器利用顯微鏡或電子微粒計(jì)數(shù)器 直接計(jì)數(shù)破碎前后的細(xì)胞數(shù)直接計(jì)數(shù)破碎前后的細(xì)胞數(shù)。（僅適合于機(jī)械法）。（僅適合于機(jī)械法） （2 2）目的產(chǎn)物測(cè)定法目的產(chǎn)物測(cè)定法

26、 通過(guò)測(cè)定破碎液中目的通過(guò)測(cè)定破碎液中目的 產(chǎn)物的釋放量來(lái)估算破碎率。產(chǎn)物的釋放量來(lái)估算破碎率。（多用于生產(chǎn)，必（多用于生產(chǎn)，必 須有須有100%100%破碎率破碎率作作標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值比較標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值比較） （3 3）導(dǎo)電率測(cè)定法導(dǎo)電率測(cè)定法 細(xì)胞破碎后，大量帶電荷細(xì)胞破碎后，大量帶電荷 的內(nèi)含物被釋放到水相，使導(dǎo)電率上升。（的內(nèi)含物被釋放到水相，使導(dǎo)電率上升。（是一是一 種快速測(cè)定法，種快速測(cè)定法，應(yīng)預(yù)先采用其他方法制定標(biāo)準(zhǔn)曲應(yīng)預(yù)先采用其他方法制定標(biāo)準(zhǔn)曲 線線 ） 3.5 破碎技術(shù)的發(fā)展方向 3.5.1 多種破碎方法相結(jié)合多種破碎方法相結(jié)合 機(jī)械法與非機(jī)械法機(jī)械法與非機(jī)械法 化學(xué)法與酶法化學(xué)法與酶法

27、多種化學(xué)試劑處理多種化學(xué)試劑處理 多種酶制劑處理多種酶制劑處理 機(jī)械法與非機(jī)械法：機(jī)械法與非機(jī)械法： 化學(xué)法與酶法取決于細(xì)胞壁膜的化學(xué)組成，化學(xué)法與酶法取決于細(xì)胞壁膜的化學(xué)組成， 機(jī)械法取決于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的機(jī)械強(qiáng)度，而化學(xué)組成機(jī)械法取決于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的機(jī)械強(qiáng)度，而化學(xué)組成 又決定了結(jié)構(gòu)的機(jī)械強(qiáng)度，組成的變化必然影響又決定了結(jié)構(gòu)的機(jī)械強(qiáng)度，組成的變化必然影響 到強(qiáng)度的差異，這就是化學(xué)法與機(jī)械法相結(jié)合的到強(qiáng)度的差異，這就是化學(xué)法與機(jī)械法相結(jié)合的 原理。原理。 細(xì)胞細(xì)胞酶法或化學(xué)法處理 酶法或化學(xué)法處理破壞細(xì)胞壁某些物質(zhì)組成 破壞細(xì)胞壁某些物質(zhì)組成壁的壁的 機(jī)械強(qiáng)度機(jī)械強(qiáng)度機(jī)械法處理 機(jī)械法處理細(xì)胞破碎率 細(xì)胞破碎率 例：面包酵母細(xì)胞的破碎例：面包酵母細(xì)胞的破碎 用溶解酶（用溶解酶（Zymolyas