分光光度計(jì)的使用

1、 主要內(nèi)容主要內(nèi)容 、分分光光度法的概光光度法的概念念 、分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)與原理、分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)與原理 、分光光度計(jì)的使用、分光光度計(jì)的使用 、實(shí)驗(yàn)操作（、實(shí)驗(yàn)操作（溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制）溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制） 分光光度法的概念分光光度法的概念 分光光度法：分光光度法：是利用物質(zhì)特有的吸收光譜， 進(jìn)行物質(zhì)鑒定及測定其含量的一種分析技術(shù)。 也稱為吸收光譜法。是光譜分析技術(shù)中最常 見的一種，應(yīng)用最多的是紫外及可見分光光 度法。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：靈敏、精確、快速和簡便。 應(yīng)用應(yīng)用：生物化學(xué)微量物質(zhì)定量分析測定研 究中廣泛使用的方法之一，常用于糖，蛋白 質(zhì)，核酸，酶等的快速定量檢測。 光譜范圍：光譜范圍：2

2、001000nm 。 分光光度法的概念分光光度法的概念 紅外分光光度計(jì):大于760 nm的紅外光區(qū) 可見光分光光度計(jì):400760 nm的可見光區(qū) 紫外分光光度計(jì): 200400 nm的紫外光區(qū) 分光光度計(jì)的分類分光光度計(jì)的分類 722E722E可見分光光度計(jì)可見分光光度計(jì) 722E722E可見分光光度計(jì)可見分光光度計(jì) 分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu) 光源光源 單單色色 光器光器 吸收池吸收池 檢測檢測 系系統(tǒng)統(tǒng) 鎢絲鎢絲燈燈 氫氫燈燈 氘氘燈燈 棱鏡棱鏡 衍射光衍射光柵柵 玻璃比色杯玻璃比色杯 石英比色杯石英比色杯 硒硒光光電電池池 光光電電管管 光光電電倍增管倍增管 當(dāng)一束單色光

3、透過溶液時(shí)當(dāng)一束單色光透過溶液時(shí) 部分被吸收部分被吸收 部分被反射部分被反射 部分被透過部分被透過 Ir Ia I 入射光入射光 I0出射光出射光 I 比色皿比色皿 吸收杯吸收杯 反射光反射光 Ir Ia 吸收光吸收光 分光光度計(jì)基本原理分光光度計(jì)基本原理 / I0表示光線透過溶液的程度,稱為透光 度,用T表示；IgT表示溶液對光線的吸收 程度，用吸光度（A）表示。即 I0 C I AIgT Ig I I0 L Lambert-BeerLambert-Beer定律（光吸收定律定律（光吸收定律） Lambert定律：AK1L Beer定律：AK2C Lambert-BeerLambert-Bee

4、r定律：定律：當(dāng)一束單色光垂直通過一均勻的溶液 時(shí)，溶液的吸光度A，與溶液的濃度C及溶液的厚度L成正比。即 AKCL 其中：A吸光度 K為消光常數(shù)，表示物質(zhì)對光線吸收的能力，受物質(zhì)種類 和光線波長的影響 C溶液的濃度 L溶液的厚度 Lambert-BeerLambert-Beer定律的應(yīng)用定律的應(yīng)用 1、利用標(biāo)準(zhǔn)管計(jì)算測定物的含量 用一已知濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和一個(gè)未知濃 度的待測溶液同樣處理顯色，測定吸光度， 根據(jù)Lambert-Beer定律得： A1=K1C1L1 A2=K2C2L2 因?yàn)?K1=K2 L1=L2 所以 C2= A2 A1 C1 Lambert-BeerLambert-Beer定律

5、的應(yīng)用定律的應(yīng)用 2、利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測定物含量 先配制一系列已知濃度的測定物溶液，按 要求方法處理顯色，在最大吸收波長（max） 處讀取各管的吸光度，以各管吸光度A為縱 坐標(biāo)，對應(yīng)濃度C為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 以后進(jìn)行測定時(shí)，待測樣品以相同條件在 max處讀取吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得 該待樣品的濃度。 吸光度A 蛋白質(zhì)濃度（g/ml ） 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線（雙縮脲法：540nm） 0.2 0.4 0.6 . . . . 40801201600 722E分光光度計(jì)使用分光光度計(jì)使用 基本操作：（基本操作：（示教） 通電儀器自檢（ BLA ） 預(yù)熱20min 設(shè)定波長方式設(shè)定（MOOD T（或A

6、） 儀器調(diào)“0.000”(將遮光杯）置入光路， 在T方式下按“%T”鍵， 儀器自動(dòng)校正后 顯示“0.000 參比液調(diào)“0.000”A 樣 品測定讀取“A”。 722E分光光度計(jì)使用分光光度計(jì)使用 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 1、預(yù)熱-保證儀器準(zhǔn)確穩(wěn)定； 2、比色皿的清潔-待測液潤洗、沖洗； 3、比色皿配套-比色皿不能隨意； 4、比色皿內(nèi)盛液體量- 2/3 ，有液體，應(yīng)用擦鏡紙拭干，以保證光 路通過時(shí)不受影響； 5、拿放比色皿-應(yīng)持其“毛面”，杜絕接觸光路通過的“光面”； 6、溶液濃度要適當(dāng)：吸光度讀數(shù)處于0.10.7范圍內(nèi)為宜，否則誤差較 大，要適當(dāng)調(diào)整濃度。 7、分光光度計(jì)連續(xù)使用一般不超過2h。 實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 操作步驟： 1、用30