第2章蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及分離純化

1、研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的方法研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的方法 入射的入射的x射線(xiàn)投射到被檢物體上引起光波的射線(xiàn)投射到被檢物體上引起光波的 散射，散射光含有物體構(gòu)造的全部信息，散射，散射光含有物體構(gòu)造的全部信息， 用透鏡收集和重組散射光波產(chǎn)生物體的放用透鏡收集和重組散射光波產(chǎn)生物體的放 大圖像。大圖像。 核磁共振（核磁共振（NMR） 核磁共振的方法與技術(shù)作為分析物質(zhì)的手段核磁共振的方法與技術(shù)作為分析物質(zhì)的手段 ， 由于其可深入物質(zhì)內(nèi)部而不破壞樣品由于其可深入物質(zhì)內(nèi)部而不破壞樣品 ，并具有迅，并具有迅 速、準(zhǔn)確、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)而得以迅速發(fā)展和廣速、準(zhǔn)確、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)而得以迅速發(fā)展和廣 泛應(yīng)用泛應(yīng)用 ，已經(jīng)從物理學(xué)滲

2、透到化學(xué)、生物、地質(zhì)、，已經(jīng)從物理學(xué)滲透到化學(xué)、生物、地質(zhì)、 醫(yī)療以及材料等學(xué)科醫(yī)療以及材料等學(xué)科 ，在科研和生產(chǎn)中發(fā)揮了巨，在科研和生產(chǎn)中發(fā)揮了巨 大作用大作用 。 核磁共振是核磁共振是1946年由美國(guó)斯坦福大學(xué)布洛赫年由美國(guó)斯坦福大學(xué)布洛赫 (F.Block)和哈佛大學(xué)珀賽爾和哈佛大學(xué)珀賽爾(E.M.Purcell)各自獨(dú)各自獨(dú) 立發(fā)現(xiàn)的，兩人因此獲得立發(fā)現(xiàn)的，兩人因此獲得1952年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。 50多年來(lái)，核磁共振已形成為一門(mén)有完整理論的多年來(lái)，核磁共振已形成為一門(mén)有完整理論的 新學(xué)科。新學(xué)科。 核磁共振基本原理核磁共振基本原理 核磁共振原理核磁共振原理 實(shí)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)核

3、核磁共振的兩種方法磁共振的兩種方法 檢測(cè)共振信號(hào)的方法檢測(cè)共振信號(hào)的方法 傅里葉傅里葉(Fourier)(Fourier)變換變換 核磁共振原理核磁共振原理 半數(shù)以上的原子核具有自旋，旋轉(zhuǎn)時(shí)產(chǎn)生一小磁場(chǎng)。當(dāng)加一外磁半數(shù)以上的原子核具有自旋，旋轉(zhuǎn)時(shí)產(chǎn)生一小磁場(chǎng)。當(dāng)加一外磁 場(chǎng)，這些原子核的能級(jí)將分裂，既場(chǎng)，這些原子核的能級(jí)將分裂，既塞曼效應(yīng)塞曼效應(yīng)。 在外磁場(chǎng)在外磁場(chǎng)B B0 0中塞曼分裂圖：中塞曼分裂圖： 共振條件：共振條件： = = 0 0 = = 0 0 實(shí)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)核核磁共振的兩種方法磁共振的兩種方法 a掃場(chǎng)法掃場(chǎng)法: : 改變改變 0 0 b b掃頻法掃頻法: : 改變改變 核磁共振新技術(shù)

4、核磁共振新技術(shù) 核磁雙共振核磁雙共振 二維核磁共振二維核磁共振 NMR成像技術(shù)成像技術(shù) 魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù)魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù) 極化轉(zhuǎn)移技術(shù)極化轉(zhuǎn)移技術(shù) NMR成像技術(shù)成像技術(shù) 投影重建成像方法投影重建成像方法 FourierFourier成像方法成像方法 弛豫時(shí)間成像方法弛豫時(shí)間成像方法 逐點(diǎn)掃描方法逐點(diǎn)掃描方法 線(xiàn)掃描方法線(xiàn)掃描方法 切片掃描方法切片掃描方法 高分率成像和快速成像法高分率成像和快速成像法 蛋白質(zhì)分子中的非共價(jià)鍵：蛋白質(zhì)分子中的非共價(jià)鍵： （1）氫鍵：）氫鍵： 羧基上的氧與亞氨基上的氫原子所羧基上的氧與亞氨基上的氫原子所 形成。形成。 作用：鏈內(nèi)維持二級(jí)結(jié)構(gòu)；鏈間為作用：鏈內(nèi)維持二級(jí)結(jié)構(gòu)；

5、鏈間為 三、四級(jí)結(jié)構(gòu)所需。三、四級(jí)結(jié)構(gòu)所需。 （2）疏水鍵：）疏水鍵：aa非極性側(cè)鏈形成。非極性側(cè)鏈形成。 作用：維持三級(jí)結(jié)構(gòu)。作用：維持三級(jí)結(jié)構(gòu)。 穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力 （3）鹽鍵：鹽鍵： 帶正負(fù)電荷的帶正負(fù)電荷的 側(cè)鏈通過(guò)靜電側(cè)鏈通過(guò)靜電 引力形成。引力形成。 （4）范德華力：）范德華力： 中性分子或原中性分子或原 子間的作用力。子間的作用力。 次級(jí)鍵的特點(diǎn)與作用次級(jí)鍵的特點(diǎn)與作用 鍵能弱；鍵能弱； 數(shù)量多。數(shù)量多。 所以，在維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)中起重要作所以，在維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)中起重要作 用。用。 維系蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)維系蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)：肽鍵、二

6、硫鍵肽鍵、二硫鍵 維系蛋白質(zhì)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)：維系蛋白質(zhì)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)：氫鍵氫鍵 維系蛋白質(zhì)分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)：維系蛋白質(zhì)分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)：疏水相互作用力疏水相互作用力、氫鍵、氫鍵、 范德華力、鹽鍵范德華力、鹽鍵 維系蛋白質(zhì)分子的四級(jí)結(jié)構(gòu)：范德華力、鹽鍵維系蛋白質(zhì)分子的四級(jí)結(jié)構(gòu)：范德華力、鹽鍵 a鹽鍵（離子鍵鹽鍵（離子鍵 ） b氫鍵氫鍵 c疏水相互作用力疏水相互作用力 d 范德華力范德華力 e二硫鍵二硫鍵 f 酯鍵酯鍵 氫鍵、范德華力、疏水相互作用力、鹽鍵，均為氫鍵、范德華力、疏水相互作用力、鹽鍵，均為 次級(jí)鍵次級(jí)鍵 氫鍵、范德華力雖然鍵能小，但數(shù)量大氫鍵、范德華力雖然鍵能小，但數(shù)量大 疏水相互作用力

7、對(duì)維持三級(jí)結(jié)構(gòu)特別重要疏水相互作用力對(duì)維持三級(jí)結(jié)構(gòu)特別重要 鹽鍵數(shù)量小鹽鍵數(shù)量小 二硫鍵對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象很重要，二硫鍵越多，二硫鍵對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象很重要，二硫鍵越多， 蛋白質(zhì)分子構(gòu)象越穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子構(gòu)象越穩(wěn)定 離子鍵離子鍵氫鍵氫鍵 范德華力范德華力 疏水相互作用力疏水相互作用力 酰胺平面與二面角酰胺平面與二面角 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu) 指蛋白質(zhì)多肽鏈本身的折疊和盤(pán)繞形式；蛋白指蛋白質(zhì)多肽鏈本身的折疊和盤(pán)繞形式；蛋白 質(zhì)分子中鄰近的氨基酸之間由于氫鍵的作用質(zhì)分子中鄰近的氨基酸之間由于氫鍵的作用 盤(pán)旋折疊形成的立體空間結(jié)構(gòu)。包括：盤(pán)旋折疊形成的立體空間結(jié)構(gòu)。包括： - 螺旋結(jié)構(gòu)螺旋結(jié)構(gòu)

8、- 折疊結(jié)構(gòu)折疊結(jié)構(gòu) - 轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu) 自由回轉(zhuǎn)自由回轉(zhuǎn) 維持蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力是維持蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力是氫鍵氫鍵 （1） - 螺旋螺旋(-helix) 因肽鏈中因肽鏈中aa殘基殘基 中的中的-NH與前三與前三 個(gè)個(gè)aa的的C=O間間 可形成氫鍵，使可形成氫鍵，使 得肽鏈呈螺旋狀得肽鏈呈螺旋狀 盤(pán)曲。盤(pán)曲。 氫鍵取向幾乎與氫鍵取向幾乎與 中心軸平行中心軸平行。 多肽鏈中的各個(gè)肽平面圍繞同一軸旋轉(zhuǎn)，形成螺多肽鏈中的各個(gè)肽平面圍繞同一軸旋轉(zhuǎn)，形成螺 旋結(jié)構(gòu)，螺旋一周，沿軸上升的距離即螺距為旋結(jié)構(gòu)，螺旋一周，沿軸上升的距離即螺距為 0.54nm,含含3.6個(gè)氨基酸殘基；兩個(gè)氨基酸

9、之間的距個(gè)氨基酸殘基；兩個(gè)氨基酸之間的距 離離0.15nm. 肽鏈內(nèi)形成氫鍵，肽鏈內(nèi)形成氫鍵，氫鍵氫鍵 的取向幾乎與軸平行的取向幾乎與軸平行。 第一個(gè)氨基酸殘基的酰胺第一個(gè)氨基酸殘基的酰胺 基團(tuán)的基團(tuán)的-CO基與第四個(gè)氨基與第四個(gè)氨 基酸殘基酰胺基團(tuán)的基酸殘基酰胺基團(tuán)的-NH 基形成氫鍵。基形成氫鍵。 蛋白質(zhì)分子大多為蛋白質(zhì)分子大多為 右手右手 -螺旋。螺旋。 親水基團(tuán)位于螺旋親水基團(tuán)位于螺旋 的外側(cè)，疏水基團(tuán)位的外側(cè)，疏水基團(tuán)位 于螺旋的于螺旋的 內(nèi)側(cè)。內(nèi)側(cè)。 左手和右手螺旋左手和右手螺旋 影響影響- 螺旋穩(wěn)定的因素螺旋穩(wěn)定的因素 蛋白質(zhì)的氨基酸組成是蛋白質(zhì)的氨基酸組成是 主要的影響因素：主

10、要的影響因素： Pro 同種電荷同種電荷 （2） -折疊折疊(-pleated sheet) 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 肽鏈伸展，肽鏈伸展， 按層排列按層排列, 在肽鏈的不在肽鏈的不 同區(qū)段或不同區(qū)段或不 同肽鏈間形同肽鏈間形 成氫鍵成氫鍵,維維 持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)持結(jié)構(gòu)的穩(wěn) 定性。定性。 -折疊折疊 -折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的 肽鏈平行排列，通過(guò)鏈間的氫鍵交聯(lián)而形成肽鏈平行排列，通過(guò)鏈間的氫鍵交聯(lián)而形成 的。肽鏈的主鏈呈鋸齒樁折疊構(gòu)象。的。肽鏈的主鏈呈鋸齒樁折疊構(gòu)象。 在在 -折疊中，折疊中， -碳原子總是處于折疊的角碳原子總是處于折疊的角 上，氨基酸的上，氨基酸

11、的R基團(tuán)處于折疊的棱角上并與基團(tuán)處于折疊的棱角上并與 棱角垂直，兩個(gè)氨基酸之間的軸心距為棱角垂直，兩個(gè)氨基酸之間的軸心距為 0.35nm. -折疊結(jié)構(gòu)的氫鍵主要是由兩條肽鏈之間折疊結(jié)構(gòu)的氫鍵主要是由兩條肽鏈之間 形成的；也可以在同一肽鏈的不同部分之間形成的；也可以在同一肽鏈的不同部分之間 形成。幾乎所有肽鍵都參與鏈內(nèi)氫鍵的交聯(lián)，形成。幾乎所有肽鍵都參與鏈內(nèi)氫鍵的交聯(lián)， 氫鍵與鏈的長(zhǎng)軸接近垂直。氫鍵與鏈的長(zhǎng)軸接近垂直。 -折疊有兩種類(lèi)型。一種為平行式，即所折疊有兩種類(lèi)型。一種為平行式，即所 有肽鏈的有肽鏈的N-端都在同一邊。另一種為反平行端都在同一邊。另一種為反平行 式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反

12、。式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反。 -折疊有兩種類(lèi)型 平行：平行：所有肽鏈的所有肽鏈的N端處于同一端，氫鍵端處于同一端，氫鍵 不與肽鏈走向垂直。如：不與肽鏈走向垂直。如： - 角蛋白。角蛋白。 反平行：反平行： 肽鏈的肽鏈的N端不處于同一端，氫鍵與肽鏈走端不處于同一端，氫鍵與肽鏈走 向垂直。如：絲心蛋白。向垂直。如：絲心蛋白。 反平行式反平行式 平行式 （3）- 轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)角(- turn) 鏈內(nèi)形成氫鍵鏈內(nèi)形成氫鍵，多多 肽鏈出現(xiàn)肽鏈出現(xiàn)180的的 回折。此回折角稱(chēng)回折。此回折角稱(chēng) - 轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。 此結(jié)構(gòu)廣泛存在球此結(jié)構(gòu)廣泛存在球 狀蛋白中。狀蛋白中。 - 轉(zhuǎn)角 （4）自由回轉(zhuǎn)）自由回轉(zhuǎn)

13、(random coil) 亦稱(chēng)無(wú)規(guī)則卷曲、亦稱(chēng)無(wú)規(guī)則卷曲、 自由繞曲自由繞曲 指無(wú)規(guī)律的松散肽指無(wú)規(guī)律的松散肽 鏈結(jié)構(gòu)鏈結(jié)構(gòu)。通常酶通常酶 蛋白的功能部位在蛋白的功能部位在 此。此。 超二級(jí)結(jié)構(gòu)超二級(jí)結(jié)構(gòu)(supersecondary structures) 指若干相鄰二級(jí)結(jié)構(gòu)單元組合彼此相互作用，形指若干相鄰二級(jí)結(jié)構(gòu)單元組合彼此相互作用，形 成有規(guī)則的在空間上能辨認(rèn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合體。成有規(guī)則的在空間上能辨認(rèn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合體。 此為二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)間的一種過(guò)渡構(gòu)象。此為二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)間的一種過(guò)渡構(gòu)象。 如：如：，；等。；等。 結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域(domains)： 多肽鏈在超二級(jí)結(jié)多肽鏈在超

14、二級(jí)結(jié) 構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步繞構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步繞 曲折疊而成的相對(duì)曲折疊而成的相對(duì) 獨(dú)立的三維實(shí)體稱(chēng)獨(dú)立的三維實(shí)體稱(chēng) 結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域。 具有部分生物學(xué)功具有部分生物學(xué)功 能。能。 The subunits are shown in gray and light blue; the subunits in pink and dark blue. Note that the heme groups (red) are relatively far apart. 幾種常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)域幾種常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)域 蚯蚓血紅蛋白蚯蚓血紅蛋白 的結(jié)構(gòu)域四個(gè)的結(jié)構(gòu)域四個(gè) 螺旋。螺旋。 免疫球蛋白免疫球蛋白VL的結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域 丙糖

15、異構(gòu)酶丙糖異構(gòu)酶 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu) 概念：概念：蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié) 構(gòu)是指多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)是指多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu) 的基礎(chǔ)上進(jìn)一步盤(pán)旋、折的基礎(chǔ)上進(jìn)一步盤(pán)旋、折 疊，從而生成特定的空間疊，從而生成特定的空間 結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。 包括主鏈和側(cè)鏈的所有原包括主鏈和側(cè)鏈的所有原 子的空間排布一般非極子的空間排布一般非極 性側(cè)鏈埋在分子內(nèi)部，形性側(cè)鏈埋在分子內(nèi)部，形 成疏水核，極性側(cè)鏈在分成疏水核，極性側(cè)鏈在分 子表面子表面 較小蛋白質(zhì)分子：多為單較小蛋白質(zhì)分子：多為單 結(jié)構(gòu)域，即三級(jí)結(jié)構(gòu)；結(jié)構(gòu)域，即三級(jí)結(jié)構(gòu)； 較大蛋白質(zhì)分子：由較大蛋白質(zhì)分子：由2或或2 個(gè)以上結(jié)構(gòu)域結(jié)合成三級(jí)個(gè)以上結(jié)

16、構(gòu)域結(jié)合成三級(jí) 結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。 肌紅蛋白肌紅蛋白 三級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu) 亞基：幾條肽鏈以非共亞基：幾條肽鏈以非共 價(jià)鍵聯(lián)結(jié)成一穩(wěn)定的價(jià)鍵聯(lián)結(jié)成一穩(wěn)定的 活性單位，這種肽鏈活性單位，這種肽鏈 稱(chēng)該蛋白質(zhì)的亞基稱(chēng)該蛋白質(zhì)的亞基 (subunit)。 四級(jí)結(jié)構(gòu)：亞基間通過(guò)四級(jí)結(jié)構(gòu)：亞基間通過(guò) 非共價(jià)鍵聚合而成的非共價(jià)鍵聚合而成的 特定構(gòu)象。特定構(gòu)象。 亞基單獨(dú)存在不具活性亞基單獨(dú)存在不具活性 血紅蛋白血紅蛋白:2個(gè)個(gè)亞基和亞基和 2個(gè)個(gè)亞基。亞基。 蛋蛋 白白 質(zhì)質(zhì) 的的 四四 種種 結(jié)結(jié) 構(gòu)構(gòu) 層層 次次 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的排列順

17、序。蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的排列順序。 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu) 一級(jí)結(jié)構(gòu)卷曲、折疊而成。通常分為二一級(jí)結(jié)構(gòu)卷曲、折疊而成。通常分為二 級(jí)結(jié)構(gòu)、超二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、三級(jí)結(jié)級(jí)結(jié)構(gòu)、超二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、三級(jí)結(jié) 構(gòu)、四級(jí)結(jié)構(gòu)。構(gòu)、四級(jí)結(jié)構(gòu)。 一級(jí)結(jié)構(gòu)決定空間結(jié)構(gòu)。一級(jí)結(jié)構(gòu)決定空間結(jié)構(gòu)。 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)構(gòu)象與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)構(gòu)象與功能的關(guān)系 (一）蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與生物功能一）蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與生物功能 1、一級(jí)結(jié)構(gòu)不同、一級(jí)結(jié)構(gòu)不同,蛋白質(zhì)功能不同蛋白質(zhì)功能不同 2、一級(jí)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵部分相同，功能相

18、同一級(jí)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵部分相同，功能相同 不同來(lái)源的胰島素都由不同來(lái)源的胰島素都由A、B鏈，鏈，51個(gè)個(gè)aa組成，組成， 但一級(jí)結(jié)構(gòu)的但一級(jí)結(jié)構(gòu)的aa種類(lèi)并不完全相同。種類(lèi)并不完全相同。 3、一級(jí)結(jié)構(gòu)改變引起的分子病：、一級(jí)結(jié)構(gòu)改變引起的分子病： 如：鐮刀型貧血病血紅蛋白僅一級(jí)結(jié)構(gòu)：如：鐮刀型貧血病血紅蛋白僅一級(jí)結(jié)構(gòu)： 6Glu換成換成6Val 由此引起三級(jí)結(jié)構(gòu)多由此引起三級(jí)結(jié)構(gòu)多 一疏水鍵，四級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生線(xiàn)性締合，導(dǎo)致紅一疏水鍵，四級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生線(xiàn)性締合，導(dǎo)致紅 細(xì)胞發(fā)生溶血。細(xì)胞發(fā)生溶血。 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)決定于其一級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)決定于其一級(jí)結(jié)構(gòu) 和周?chē)h(huán)境的影響和周?chē)h(huán)境的影響 如：瘋牛病如

19、：瘋牛病 prion的發(fā)現(xiàn)，的發(fā)現(xiàn)， 提示人們，提示人們， 一級(jí)結(jié)構(gòu)和一級(jí)結(jié)構(gòu)和 環(huán)境因素影環(huán)境因素影 響蛋白質(zhì)的響蛋白質(zhì)的 構(gòu)象。構(gòu)象。 （二）蛋白質(zhì)構(gòu)象與功（二）蛋白質(zhì)構(gòu)象與功 能的關(guān)系能的關(guān)系 蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，蛋白質(zhì)構(gòu)象改變， 活性喪失?；钚詥适А?用化學(xué)方法修改用化學(xué)方法修改Pr或多肽化合物的結(jié)構(gòu)，或多肽化合物的結(jié)構(gòu)， 可提高活性；可提高活性； 了解了解Pr結(jié)構(gòu)中的活性必需片段，可人工結(jié)構(gòu)中的活性必需片段，可人工 合成合成Pr。 蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)的性質(zhì) 蛋白質(zhì)的性質(zhì)與其分子大小、結(jié)構(gòu)及其蛋白質(zhì)的性質(zhì)與其分子大小、結(jié)構(gòu)及其 組成組成aa的性質(zhì)密切相關(guān)。的性質(zhì)密切相關(guān)。 (一）分子量一）

20、分子量 Mr：道爾頓：道爾頓 Pr為高分子有機(jī)物，分子量幾千為高分子有機(jī)物，分子量幾千幾千幾千 萬(wàn)。萬(wàn)。 分子量測(cè)定方法：滲透壓法；分子量測(cè)定方法：滲透壓法； 超速離心法；超速離心法； 凝膠過(guò)濾法凝膠過(guò)濾法(分子篩）；分子篩）； SDS-聚丙烯酰胺電泳法聚丙烯酰胺電泳法(SDS-PAGE)等。等。 滲透壓法滲透壓法 分子量測(cè)定分子量測(cè)定 PAGE 分子篩分子篩 電荷效應(yīng)電荷效應(yīng) 濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng) SDS- PAGE 分子篩分子篩 濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng) SDS- PAGE 普通蛋白質(zhì)電泳的泳動(dòng)速率取決于荷質(zhì)比（凈電荷、大普通蛋白質(zhì)電泳的泳動(dòng)速率取決于荷質(zhì)比（凈電荷、大 小、形狀）小、形狀） 用用SD

21、S和巰基乙醇（打開(kāi)二硫鍵）處理和巰基乙醇（打開(kāi)二硫鍵）處理 蛋白質(zhì)變性（肽鏈伸展）并與蛋白質(zhì)變性（肽鏈伸展）并與SDS結(jié)合，形成結(jié)合，形成SDS-蛋蛋 白質(zhì)復(fù)合物白質(zhì)復(fù)合物 不同蛋白質(zhì)分子的均帶負(fù)電（不同蛋白質(zhì)分子的均帶負(fù)電（SDS帶負(fù)電）；且荷質(zhì)比帶負(fù)電）；且荷質(zhì)比 相同（蛋白質(zhì)分子大，結(jié)合相同（蛋白質(zhì)分子大，結(jié)合SDS多；分子小，結(jié)合多；分子小，結(jié)合SDS 少）少） 不同蛋白質(zhì)分子具有相似的構(gòu)象不同蛋白質(zhì)分子具有相似的構(gòu)象 用幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值對(duì)它們的遷移用幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值對(duì)它們的遷移 率作圖率作圖 測(cè)出待測(cè)樣品的遷移率測(cè)出待測(cè)樣品的遷移率 從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查

22、出樣品的相對(duì)分子質(zhì)量從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出樣品的相對(duì)分子質(zhì)量 Typical calibration curves obtained with standard proteins separated by nongradient denaturing (SDS) discontinuous gel electrophoresis based on the method of Laemmli (1970). (A) Gel with 7% polyacrylamide. (B) Gel with 11% polyacrylamide. (Redrawn with permission from Sig

23、ma.) Separation of membrane proteins by 5.1% to 20.5% polyacrylamide gradient SDS-PAGE 分子量測(cè)定分子量測(cè)定 根據(jù)化學(xué)成分測(cè)定最小相對(duì)分子質(zhì)量根據(jù)化學(xué)成分測(cè)定最小相對(duì)分子質(zhì)量 此法首先利用化學(xué)分析方法測(cè)定蛋白質(zhì)此法首先利用化學(xué)分析方法測(cè)定蛋白質(zhì) 分子中某一特殊成分的百分含量分子中某一特殊成分的百分含量 然后，假定蛋白質(zhì)分子中該成分只有一然后，假定蛋白質(zhì)分子中該成分只有一 個(gè)，據(jù)其百分含量可計(jì)算出最低相對(duì)分個(gè)，據(jù)其百分含量可計(jì)算出最低相對(duì)分 子質(zhì)量：子質(zhì)量： 最小相對(duì)分子質(zhì)量（已知成分的相對(duì)最小相對(duì)分子質(zhì)量（已

24、知成分的相對(duì) 分子、原子質(zhì)量）分子、原子質(zhì)量）/已知成分的百分含量已知成分的百分含量 如果蛋白質(zhì)分子中所含已知成分不是一如果蛋白質(zhì)分子中所含已知成分不是一 個(gè)單位，則真實(shí)相對(duì)分子質(zhì)量等于最小個(gè)單位，則真實(shí)相對(duì)分子質(zhì)量等于最小 相對(duì)分子質(zhì)量的倍數(shù)。相對(duì)分子質(zhì)量的倍數(shù)。 分子量測(cè)定分子量測(cè)定超速離心法超速離心法 在在60 00080 000r/min的高速離心力作用下，蛋白質(zhì)的高速離心力作用下，蛋白質(zhì) 分子會(huì)沿旋轉(zhuǎn)中心向外周方向移動(dòng)分子會(huì)沿旋轉(zhuǎn)中心向外周方向移動(dòng) 用光學(xué)方法測(cè)定界面移動(dòng)的速度即為蛋白質(zhì)的離心沉降用光學(xué)方法測(cè)定界面移動(dòng)的速度即為蛋白質(zhì)的離心沉降 速度速度 蛋白質(zhì)的沉降速度與分子大小和

25、形狀有關(guān)蛋白質(zhì)的沉降速度與分子大小和形狀有關(guān) 沉降系數(shù)是溶質(zhì)顆粒在單位離心場(chǎng)中的沉降速度，用沉降系數(shù)是溶質(zhì)顆粒在單位離心場(chǎng)中的沉降速度，用S 表示。表示。 一個(gè)一個(gè)S單位，為單位，為110-13秒秒 相對(duì)分子質(zhì)量越大，相對(duì)分子質(zhì)量越大，S值越大值越大 蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)：蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)：1200S 由沉降系數(shù)由沉降系數(shù)S可根據(jù)斯維得貝格可根據(jù)斯維得貝格Svedberg方程方程 計(jì)算蛋白質(zhì)分子的相對(duì)分子質(zhì)量：計(jì)算蛋白質(zhì)分子的相對(duì)分子質(zhì)量： M=RST/D1i R：氣體常數(shù)：氣體常數(shù) T：絕對(duì)溫度：絕對(duì)溫度 D：擴(kuò)散系數(shù)：擴(kuò)散系數(shù) ：溶劑的密度：溶劑的密度 分子量測(cè)定分子量測(cè)定超速離心法超速離心法

26、 分子量測(cè)定分子量測(cè)定凝膠過(guò)濾法凝膠過(guò)濾法 凝膠過(guò)濾所用介質(zhì)為凝膠珠，其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠過(guò)濾所用介質(zhì)為凝膠珠，其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 一定型號(hào)的凝膠網(wǎng)孔大小一定，只允許相應(yīng)大小的分子一定型號(hào)的凝膠網(wǎng)孔大小一定，只允許相應(yīng)大小的分子 進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，大分子則被排阻在外進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，大分子則被排阻在外 洗脫時(shí)大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來(lái)，洗脫液體積洗脫時(shí)大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來(lái)，洗脫液體積 ??；小分子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來(lái)穿去，歷程長(zhǎng)，后洗?。恍》肿釉陬w粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來(lái)穿去，歷程長(zhǎng)，后洗 脫下來(lái)，洗脫體積大脫下來(lái)，洗脫體積大 測(cè)定蛋白質(zhì)分子量一般用葡聚糖，商品名：測(cè)定蛋白質(zhì)分子量一

27、般用葡聚糖，商品名：Sephadex 測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的洗脫體積測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的洗脫體積Ve 以相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)（以相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)（logM）對(duì)）對(duì)Ve作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 再測(cè)出未知樣品洗脫體積再測(cè)出未知樣品洗脫體積Ve 從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上可查出樣品蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上可查出樣品蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量 分子量測(cè)定凝膠過(guò)濾法 分子篩分子篩 凝膠過(guò)濾法凝膠過(guò)濾法 （二）兩性電離與等電點(diǎn)（二）兩性電離與等電點(diǎn) 應(yīng)用電泳法：應(yīng)用電泳法： 分離各種蛋白質(zhì)；鑒定蛋白質(zhì)的純度。分離各種蛋白質(zhì)；鑒定蛋白質(zhì)的純度。 此多用于科研、生產(chǎn)、臨床診斷等。此多用于科研、生產(chǎn)、臨床診斷等。 （三

28、）膠體性質(zhì)（三）膠體性質(zhì) 蛋白質(zhì)水溶液蛋白質(zhì)水溶液 為親水膠體。為親水膠體。 不能通過(guò)半透不能通過(guò)半透 膜；膜； 分子周?chē)蟹肿又車(chē)型?種電荷和水化種電荷和水化 膜膜，有利于穩(wěn)，有利于穩(wěn) 定定pr膠體系統(tǒng)。膠體系統(tǒng)。 水化膜、同種水化膜、同種 電荷電荷 超濾 透析 （四）呈色反應(yīng)（四）呈色反應(yīng) 反應(yīng)反應(yīng) 試劑試劑 顏色顏色 反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)基團(tuán) 雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng) NaOH,稀稀CuSO4 紫或粉紫或粉 2個(gè)以上肽鏈個(gè)以上肽鏈 Millon反應(yīng)反應(yīng) Millon,硝酸，亞硝酸硝酸，亞硝酸 紅色紅色 酚基酚基 黃色反應(yīng)黃色反應(yīng) HNO3及及NH3 黃、橘黃黃、橘黃 苯環(huán)苯環(huán) 乙醛酸反應(yīng)乙醛酸反

29、應(yīng) 乙醛酸乙醛酸H2SO4 紫紅紫紅 吲哚吲哚 坂口反應(yīng)坂口反應(yīng) 次氯酸鈉次氯酸鈉,萘酚，萘酚，NaOH 紅色紅色 胍基胍基 Folin酚試劑反應(yīng)酚試劑反應(yīng) CuSO4磷鎢酸磷鎢酸-鉬酸鉬酸 蘭色蘭色 酚基酚基 茚三酮反應(yīng)茚三酮反應(yīng) 茚三酮茚三酮 紫蘭色紫蘭色 游離氨羧基游離氨羧基 雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng) 兩分子雙縮脲與堿性硫酸銅作用，生成粉紅色的兩分子雙縮脲與堿性硫酸銅作用，生成粉紅色的 復(fù)合物復(fù)合物 含有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物，能發(fā)生同樣含有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物，能發(fā)生同樣 的反應(yīng)的反應(yīng) 肽鍵的反應(yīng)，肽鍵越多顏色越深肽鍵的反應(yīng)，肽鍵越多顏色越深 受蛋白質(zhì)特異性影響小受蛋白質(zhì)特異性影

30、響小 蛋白質(zhì)定量測(cè)定；測(cè)定蛋白質(zhì)水解程度蛋白質(zhì)定量測(cè)定；測(cè)定蛋白質(zhì)水解程度 米倫氏反應(yīng)米倫氏反應(yīng) 酪氨酸的顯色反應(yīng)（酚羥基反應(yīng)）酪氨酸的顯色反應(yīng)（酚羥基反應(yīng)） 米倫試劑為硝酸、亞硝酸、硝酸汞、亞硝酸汞的混合物米倫試劑為硝酸、亞硝酸、硝酸汞、亞硝酸汞的混合物 蛋白溶液中，加入米倫試劑，產(chǎn)生白色沉淀，加熱變成紅色蛋白溶液中，加入米倫試劑，產(chǎn)生白色沉淀，加熱變成紅色 乙醛酸反應(yīng)乙醛酸反應(yīng) 在蛋白質(zhì)溶液中加入在蛋白質(zhì)溶液中加入HCOCOOH，將濃硫酸沿管壁緩慢加入，將濃硫酸沿管壁緩慢加入， 不使相混，在液面交界處，即有紫色環(huán)形成不使相混，在液面交界處，即有紫色環(huán)形成 色氨酸的反應(yīng)（吲哚環(huán)的反應(yīng)）色氨酸

31、的反應(yīng)（吲哚環(huán)的反應(yīng)） 鑒定蛋白質(zhì)中是否含有色氨酸鑒定蛋白質(zhì)中是否含有色氨酸 明膠中不含色氨酸明膠中不含色氨酸 坂口反應(yīng)坂口反應(yīng) 精氨酸的反應(yīng)（胍基的反應(yīng)）精氨酸的反應(yīng)（胍基的反應(yīng)） 精氨酸與精氨酸與-萘酚在堿性次氯酸鈉（或次溴酸鈉）溶液中發(fā)生萘酚在堿性次氯酸鈉（或次溴酸鈉）溶液中發(fā)生 反應(yīng)，產(chǎn)生紅色產(chǎn)物反應(yīng)，產(chǎn)生紅色產(chǎn)物 鑒定蛋白質(zhì)中是否含有精氨酸鑒定蛋白質(zhì)中是否含有精氨酸 定量測(cè)定精氨酸定量測(cè)定精氨酸 福林試劑反應(yīng)福林試劑反應(yīng) 酪氨酸、色氨酸的反應(yīng)（還原反應(yīng)）酪氨酸、色氨酸的反應(yīng)（還原反應(yīng)） 福林試劑：磷鉬酸福林試劑：磷鉬酸-磷鎢酸磷鎢酸 與雙縮脲法結(jié)合與雙縮脲法結(jié)合-Lowry法法 在堿

32、性條件下，蛋白質(zhì)與硫酸銅發(fā)生反應(yīng)在堿性條件下，蛋白質(zhì)與硫酸銅發(fā)生反應(yīng) 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物，將福林試劑還原，產(chǎn)生磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)銅絡(luò)合物，將福林試劑還原，產(chǎn)生磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán) 混合物混合物 靈敏度提高靈敏度提高100倍倍 黃蛋白反應(yīng)黃蛋白反應(yīng) 濃硝酸與酪氨酸、色氨酸的反應(yīng)濃硝酸與酪氨酸、色氨酸的反應(yīng) 生成黃色化合物生成黃色化合物 指甲、皮膚、毛發(fā)指甲、皮膚、毛發(fā) 考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G-250 本身為紅色，與蛋白質(zhì)反應(yīng)呈藍(lán)色本身為紅色，與蛋白質(zhì)反應(yīng)呈藍(lán)色 與蛋白的親和力強(qiáng)，靈敏度高與蛋白的親和力強(qiáng)，靈敏度高 1-1000微克微克/毫升毫升 Sanger FDNB DNP-aa 測(cè)定蛋白質(zhì)測(cè)定蛋白

33、質(zhì)N 端氨基酸序列端氨基酸序列 Edman PITC PTH-aa 測(cè)定蛋白質(zhì)測(cè)定蛋白質(zhì)N 端氨基酸序列端氨基酸序列 DNS-Cl DNS-aa測(cè)定蛋白質(zhì)測(cè)定蛋白質(zhì)N 端氨基端氨基 酸序列酸序列 黃綠色熒光黃綠色熒光 （五）沉淀反應(yīng)（五）沉淀反應(yīng) 機(jī)理：機(jī)理： 1）利用）利用pr兩性電離性質(zhì)。兩性電離性質(zhì)。 2）許多化學(xué)試劑可減少）許多化學(xué)試劑可減少pr與水的親和力與水的親和力 方法：方法：鹽析、醇、鹽析、醇、 酸、重金屬離子、生物堿酸、重金屬離子、生物堿 鹽析（鹽析（Salting-in)Salting-in) l向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽 （NHNH4 4

34、) )2 2SOSO4 4， ，NaNa2 2SOSO4 4， ，使蛋白質(zhì)脫去水，使蛋白質(zhì)脫去水 化層而聚集沉淀，這種現(xiàn)象稱(chēng)為鹽析。化層而聚集沉淀，這種現(xiàn)象稱(chēng)為鹽析。 l鹽析作用是由于當(dāng)鹽濃度較高時(shí)，鹽離子鹽析作用是由于當(dāng)鹽濃度較高時(shí)，鹽離子 與水分子作用，使水的活度降低，原來(lái)溶與水分子作用，使水的活度降低，原來(lái)溶 液中大部分的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化液中大部分的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化 水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子之水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子之 間的作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層。間的作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層。 鹽析（鹽析（Salting-in)Salting-in)

35、 鹽溶（鹽溶（salting-in) 蛋白質(zhì)溶液中加入低濃度的中性鹽使蛋白質(zhì)溶液中加入低濃度的中性鹽使 蛋白質(zhì)的溶解度增大的現(xiàn)象蛋白質(zhì)的溶解度增大的現(xiàn)象 等電點(diǎn)沉淀等電點(diǎn)沉淀 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其 溶解度與其凈電荷數(shù)量有溶解度與其凈電荷數(shù)量有 關(guān)，隨溶液關(guān)，隨溶液pHpH變化而變化。變化而變化。 在溶液在溶液pHpH值等于蛋白質(zhì)等值等于蛋白質(zhì)等 電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度 最小。最小。 不同的蛋白質(zhì)有不同的等不同的蛋白質(zhì)有不同的等 電點(diǎn)，因此通過(guò)調(diào)節(jié)溶液電點(diǎn)，因此通過(guò)調(diào)節(jié)溶液 pHpH到目的蛋白的等電點(diǎn)，到目的蛋白的等電點(diǎn)， 可使之沉淀而與其它蛋白可使

36、之沉淀而與其它蛋白 質(zhì)分開(kāi)，從而除去大量雜質(zhì)分開(kāi)，從而除去大量雜 蛋白。蛋白。 有機(jī)溶劑法有機(jī)溶劑法 與水互溶的極性有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、與水互溶的極性有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、 丙酮等能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著丙酮等能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著 降低。降低。 有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)變性的原因有兩個(gè)：有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)變性的原因有兩個(gè)： v降低水的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子表面降低水的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子表面 可解離基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程可解離基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程 度降低，促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集沉淀。度降低，促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集沉淀。 v是極性有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水化水，是極性有機(jī)溶劑

37、與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水化水， 而使蛋白質(zhì)分子沉淀。而使蛋白質(zhì)分子沉淀。 室溫下，這些有機(jī)溶劑不僅能使蛋白室溫下，這些有機(jī)溶劑不僅能使蛋白 質(zhì)沉淀，而且伴隨著變性。若預(yù)先將質(zhì)沉淀，而且伴隨著變性。若預(yù)先將 有機(jī)溶劑冷卻，然后在不斷攪拌下將有機(jī)溶劑冷卻，然后在不斷攪拌下將 其逐漸加入蛋白質(zhì)溶液中，防止有機(jī)其逐漸加入蛋白質(zhì)溶液中，防止有機(jī) 溶劑局部濃度過(guò)高，則在很大程度上溶劑局部濃度過(guò)高，則在很大程度上 解決變性問(wèn)題。解決變性問(wèn)題。 不同的蛋白質(zhì)由于水化層厚度不同，不同的蛋白質(zhì)由于水化層厚度不同， 發(fā)生沉淀需要的有機(jī)溶劑濃度不同，發(fā)生沉淀需要的有機(jī)溶劑濃度不同， 因此可利用不同濃度的有機(jī)溶劑分離因此可利用不

38、同濃度的有機(jī)溶劑分離 不同的蛋白質(zhì)。不同的蛋白質(zhì)。 生物堿法 蛋白質(zhì)溶液中加入苦味酸、三氟醋酸蛋白質(zhì)溶液中加入苦味酸、三氟醋酸 等化合物可使帶正電荷的蛋白質(zhì)發(fā)生等化合物可使帶正電荷的蛋白質(zhì)發(fā)生 沉淀沉淀 （六）蛋白質(zhì)的變性（六）蛋白質(zhì)的變性 （denaturation) 1、概念：許多理化因素能、概念：許多理化因素能 破壞破壞pr分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)，分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)， 但一級(jí)結(jié)構(gòu)不變，但一級(jí)結(jié)構(gòu)不變，pr活性活性 喪失的現(xiàn)象。喪失的現(xiàn)象。 1）分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)改變：次）分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)改變：次 級(jí)鍵破壞；級(jí)鍵破壞； 2）分子表面結(jié)構(gòu)改變：疏）分子表面結(jié)構(gòu)改變：疏 水基團(tuán)暴露。水基團(tuán)暴露。 主要標(biāo)志主要標(biāo)志：

39、生物功能的喪失。生物功能的喪失。 2、變性蛋白在性質(zhì)上的變化、變性蛋白在性質(zhì)上的變化 1）溶解度降低；）溶解度降低； 2）二、三級(jí)結(jié)構(gòu)破壞，但肽鍵未破壞，故）二、三級(jí)結(jié)構(gòu)破壞，但肽鍵未破壞，故 其組成和分子量不變；其組成和分子量不變； 3）化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)增加；）化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)增加； 4）失去螺旋結(jié)構(gòu)，對(duì)稱(chēng)性下降，結(jié)晶能力）失去螺旋結(jié)構(gòu)，對(duì)稱(chēng)性下降，結(jié)晶能力 喪失；喪失； 5）對(duì)蛋白酶水解敏感性增加；）對(duì)蛋白酶水解敏感性增加； 6）生物活性降低或全部喪失。）生物活性降低或全部喪失。 3、使蛋白質(zhì)變性的理化因素：、使蛋白質(zhì)變性的理化因素： 1）物理因素：）物理因素：加熱、激烈振蕩、超聲波、加熱、激烈振

40、蕩、超聲波、 -射線(xiàn)、紫外線(xiàn)等；射線(xiàn)、紫外線(xiàn)等； 2）化學(xué)因素：）化學(xué)因素： A 酸堿破壞鹽鍵；酸堿破壞鹽鍵； B 乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑進(jìn)入乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑進(jìn)入pr間隙與之間隙與之 形成氫鍵，破壞形成氫鍵，破壞pr分子內(nèi)各弱鍵；分子內(nèi)各弱鍵； C 濃脲溶液、鹽酸胍及某些去垢劑濃脲溶液、鹽酸胍及某些去垢劑(SDS)可可 破壞氫鍵，暴露巰基，強(qiáng)化酸堿的破壞作破壞氫鍵，暴露巰基，強(qiáng)化酸堿的破壞作 用。用。 4、可逆變性與不可逆變性、可逆變性與不可逆變性 可逆變性：復(fù)性可逆變性：復(fù)性 凡變性未超過(guò)限度，凡變性未超過(guò)限度， pr活性可恢復(fù)活性可恢復(fù); 如：胃酶在如：胃酶在80-90， 失活；溫度降至

41、失活；溫度降至37， 恢復(fù)。恢復(fù)。 不可逆變性：不可逆變性： 變性不可恢復(fù)。變性不可恢復(fù)。 如：煮雞蛋。如：煮雞蛋。 (七）蛋白質(zhì)的紫外吸收七）蛋白質(zhì)的紫外吸收 大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、 酪氨酸和色氨酸。酪氨酸和色氨酸。 這三種氨基酸的在這三種氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。附近有最大吸收。 因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm 附近顯示強(qiáng)附近顯示強(qiáng) 的吸收。的吸收。 利用這個(gè)性質(zhì)，可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性鑒利用這個(gè)性質(zhì)，可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性鑒 定。定。 六蛋白的分類(lèi) 蛋白質(zhì)可按其分子形狀，組成及其溶解度 分類(lèi)。 根據(jù)分子組成

42、可分為簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)和結(jié)合蛋 白質(zhì)。 簡(jiǎn)單蛋白 又稱(chēng)為單純蛋白質(zhì)；這類(lèi)蛋白質(zhì)只由氨基酸組成的又稱(chēng)為單純蛋白質(zhì)；這類(lèi)蛋白質(zhì)只由氨基酸組成的 肽鏈，不含其它成分。肽鏈，不含其它成分。 清蛋白和球蛋白：清蛋白和球蛋白：albumin and globulin廣泛存在廣泛存在 于動(dòng)物組織中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，于動(dòng)物組織中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水， 易溶于稀酸中。易溶于稀酸中。 谷蛋白谷蛋白( (glutelin) )和和醇溶谷蛋白醇溶谷蛋白( (prolamin) )：植物蛋：植物蛋 白，不溶于水，易溶于稀酸、稀堿中，后者可溶于白，不溶于水，易溶于稀酸、稀堿中，后者可溶于 70708

43、080乙醇中。乙醇中。 精蛋白和組蛋白：精蛋白和組蛋白：堿性蛋白質(zhì)，存在于細(xì)胞核中。堿性蛋白質(zhì)，存在于細(xì)胞核中。 硬蛋白：硬蛋白：存在于各種軟骨、腱、毛、發(fā)、絲等組織存在于各種軟骨、腱、毛、發(fā)、絲等組織 中，分為角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和絲蛋白。中，分為角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和絲蛋白。 結(jié)合蛋白 由簡(jiǎn)單蛋白與其它非蛋白成分結(jié)合而由簡(jiǎn)單蛋白與其它非蛋白成分結(jié)合而 成。成。 色蛋白色蛋白：由簡(jiǎn)單蛋白與色素物質(zhì)結(jié)合而成。由簡(jiǎn)單蛋白與色素物質(zhì)結(jié)合而成。 如血紅蛋白、葉綠蛋白和細(xì)胞色素等。如血紅蛋白、葉綠蛋白和細(xì)胞色素等。 糖蛋白糖蛋白：由簡(jiǎn)單蛋白與糖類(lèi)物質(zhì)組成。如由簡(jiǎn)單蛋白與糖類(lèi)物質(zhì)組成。如 細(xì)

44、胞膜中的糖蛋白等。細(xì)胞膜中的糖蛋白等。 脂蛋白脂蛋白：由簡(jiǎn)單蛋白與脂類(lèi)結(jié)合而成。由簡(jiǎn)單蛋白與脂類(lèi)結(jié)合而成。 如如 血清血清 - -， - -脂蛋白等。脂蛋白等。 結(jié)合蛋白 核蛋白核蛋白：由簡(jiǎn)單蛋白與核酸結(jié)合而成。由簡(jiǎn)單蛋白與核酸結(jié)合而成。 如細(xì)胞核中的核糖核蛋白等。如細(xì)胞核中的核糖核蛋白等。 黃素蛋白：黃素蛋白：由簡(jiǎn)單蛋白與黃素核苷酸由簡(jiǎn)單蛋白與黃素核苷酸 結(jié)合而成。如琥珀酸脫氫酶、結(jié)合而成。如琥珀酸脫氫酶、D-D-氨基氨基 酸氧化酶酸氧化酶 金屬蛋白：金屬蛋白：由簡(jiǎn)單蛋白與金屬結(jié)合而由簡(jiǎn)單蛋白與金屬結(jié)合而 成。如鐵蛋白、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶成。如鐵蛋白、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 （硒）、乙醇氧化酶（

45、硒）、乙醇氧化酶 （鋅）（鋅） 蛋白質(zhì)的外形分類(lèi) 依據(jù)蛋白質(zhì)的外形分類(lèi)依據(jù)蛋白質(zhì)的外形分類(lèi) 按照蛋白質(zhì)的外形可分為球狀蛋白質(zhì)和纖按照蛋白質(zhì)的外形可分為球狀蛋白質(zhì)和纖 維狀蛋白質(zhì)。維狀蛋白質(zhì)。 球狀蛋白質(zhì)：球狀蛋白質(zhì)：globular protein globular protein 外形接近外形接近 球形或橢圓形，溶解性較好，能形成結(jié)晶，球形或橢圓形，溶解性較好，能形成結(jié)晶， 大多數(shù)蛋白質(zhì)屬于這一類(lèi)。大多數(shù)蛋白質(zhì)屬于這一類(lèi)。 纖維狀蛋白質(zhì)：纖維狀蛋白質(zhì)：fibrous proteinfibrous protein分子類(lèi)似分子類(lèi)似 纖維或細(xì)棒。它又可分為纖維或細(xì)棒。它又可分為可溶性纖維狀蛋可溶性

46、纖維狀蛋 白質(zhì)和不溶性纖維狀蛋白質(zhì)白質(zhì)和不溶性纖維狀蛋白質(zhì)。 七、蛋白質(zhì)的分離純化七、蛋白質(zhì)的分離純化 分離分離pr的各種方法主要根據(jù)的各種方法主要根據(jù)pr的如下性質(zhì)的如下性質(zhì): 1、分子大小、分子大小 2、溶解度；、溶解度； 3、電荷；、電荷； 4、吸附性質(zhì)；、吸附性質(zhì)； 5、對(duì)其他分子（配基）的生物學(xué)親和力。、對(duì)其他分子（配基）的生物學(xué)親和力。 （一）分離純化的意義（一）分離純化的意義 從生物材料中分離制備蛋白質(zhì)，研究其結(jié)構(gòu)從生物材料中分離制備蛋白質(zhì)，研究其結(jié)構(gòu) 與功能，對(duì)于了解生命活動(dòng)的規(guī)律，闡明生與功能，對(duì)于了解生命活動(dòng)的規(guī)律，闡明生 命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。

47、工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革 等工業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑。如用等工業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑。如用 淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿 等。等。 醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病。醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病。 基因工程的需要基因工程的需要 （二）分離純化的要求（二）分離純化的要求 1 1、純度：、純度：主要取決于研究的目的和應(yīng)用上的要求。主要取決于研究的目的和應(yīng)用上的要求。 如作為研究蛋白和一級(jí)結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)，一級(jí)結(jié)如作為研究蛋白和一級(jí)結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)，一級(jí)結(jié) 構(gòu)與功能的關(guān)系的蛋白質(zhì)制劑、

48、工具酶和標(biāo)準(zhǔn)蛋構(gòu)與功能的關(guān)系的蛋白質(zhì)制劑、工具酶和標(biāo)準(zhǔn)蛋 白、酶法分析的酶制劑，都要求均一；工業(yè)、醫(yī)白、酶法分析的酶制劑，都要求均一；工業(yè)、醫(yī) 藥方面應(yīng)用的酶和蛋白質(zhì)制劑，達(dá)到一定純度即藥方面應(yīng)用的酶和蛋白質(zhì)制劑，達(dá)到一定純度即 可，不要求均一。可，不要求均一。 2 2、活性：、活性：要求大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài)，有高度的要求大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài)，有高度的 生物活性。生物活性。 3 3、收率：、收率：希望收率越高越好，但在分離純化過(guò)程中希望收率越高越好，但在分離純化過(guò)程中 總有不少損失。而且提純步驟越多，損失越大?？傆胁簧贀p失。而且提純步驟越多，損失越大。 三、分離純化的一般程序三、分離純化的

49、一般程序 生物大分子的分離純化一般可分為以下生物大分子的分離純化一般可分為以下 幾個(gè)階段：幾個(gè)階段： 材料的選擇和預(yù)處理材料的選擇和預(yù)處理 破碎細(xì)胞及提取（有時(shí)還需要進(jìn)行破碎細(xì)胞及提?。ㄓ袝r(shí)還需要進(jìn)行 細(xì)胞器的分離）細(xì)胞器的分離） 分離純化：包括粗分級(jí)分離和細(xì)分分離純化：包括粗分級(jí)分離和細(xì)分 級(jí)分離級(jí)分離 其中前兩個(gè)階段為生物大分子分離純化其中前兩個(gè)階段為生物大分子分離純化 的前處理。的前處理。 蛋白質(zhì)分離純化的前處理蛋白質(zhì)分離純化的前處理 一、材料的選擇與預(yù)處理一、材料的選擇與預(yù)處理 選擇材料主要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。選擇材料主要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。工業(yè)生產(chǎn)上注工業(yè)生產(chǎn)上注 意選擇含量高、來(lái)源豐富

50、、易獲得、制備工藝簡(jiǎn)意選擇含量高、來(lái)源豐富、易獲得、制備工藝簡(jiǎn) 單、成本低的動(dòng)植物組織或微生物做原料?？蒲袉?、成本低的動(dòng)植物組織或微生物做原料?？蒲?選材則無(wú)需考慮上述問(wèn)題，只要能達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x材則無(wú)需考慮上述問(wèn)題，只要能達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康?即可。即可。 實(shí)驗(yàn)材料選定后，常常需要進(jìn)行預(yù)處理實(shí)驗(yàn)材料選定后，常常需要進(jìn)行預(yù)處理.如動(dòng)物如動(dòng)物 材料需要除去一些與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的結(jié)締組織、脂肪材料需要除去一些與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的結(jié)締組織、脂肪 組織；植物種子需要除殼；微生物需要將菌體與組織；植物種子需要除殼；微生物需要將菌體與 發(fā)酵液分開(kāi)。另外，必須盡可能保持材料的新鮮，發(fā)酵液分開(kāi)。另外，必須盡可能保持材料的新鮮， 盡快

51、加工處理。若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或加工，應(yīng)冷盡快加工處理。若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或加工，應(yīng)冷 凍保存。凍保存。 二、細(xì)胞的破碎二、細(xì)胞的破碎 分離提取某一生物大分子，首先要求生物分離提取某一生物大分子，首先要求生物 大分子從原來(lái)的組織或細(xì)胞中以溶解的狀大分子從原來(lái)的組織或細(xì)胞中以溶解的狀 態(tài)釋放出來(lái)，并保持原來(lái)的天然狀態(tài)，不態(tài)釋放出來(lái)，并保持原來(lái)的天然狀態(tài)，不 丟生物活性。因此應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M丟生物活性。因此應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M 織和細(xì)胞破碎。但若材料是體液（如血）織和細(xì)胞破碎。但若材料是體液（如血） 或生物體分泌到體外的分泌物，則不必進(jìn)或生物體分泌到體外的分泌物，則不必進(jìn) 行組織細(xì)胞的破碎。行組織細(xì)

52、胞的破碎。 組織細(xì)胞的破碎方法很多，不同的實(shí)驗(yàn)規(guī)模，組織細(xì)胞的破碎方法很多，不同的實(shí)驗(yàn)規(guī)模， 不同的實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)要求，使用的破碎方法不同的實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)要求，使用的破碎方法 和條件也不同。和條件也不同。 v一般動(dòng)物組織和細(xì)胞可用電動(dòng)搗碎機(jī)或勻漿一般動(dòng)物組織和細(xì)胞可用電動(dòng)搗碎機(jī)或勻漿 器破碎或用超聲波處理破碎。器破碎或用超聲波處理破碎。 v植物組織和細(xì)胞由于具有纖維素、半纖維素植物組織和細(xì)胞由于具有纖維素、半纖維素 和果膠等物質(zhì)組成的細(xì)胞壁，一般常用與石和果膠等物質(zhì)組成的細(xì)胞壁，一般常用與石 英砂和適當(dāng)?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ㄆ扑榛蛴⑸昂瓦m當(dāng)?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ㄆ扑榛?用纖維素酶處理也能達(dá)到目

53、的。用纖維素酶處理也能達(dá)到目的。 v細(xì)菌細(xì)胞的破碎比較困難，因?yàn)檎麄€(gè)細(xì)菌細(xì)細(xì)菌細(xì)胞的破碎比較困難，因?yàn)檎麄€(gè)細(xì)菌細(xì) 胞壁的骨架實(shí)際上是一借共價(jià)鍵連接而成的胞壁的骨架實(shí)際上是一借共價(jià)鍵連接而成的 肽聚糖囊狀大分子，非常堅(jiān)韌。破碎的方法肽聚糖囊狀大分子，非常堅(jiān)韌。破碎的方法 常有超聲波震蕩、與石英砂研磨、高壓擠壓常有超聲波震蕩、與石英砂研磨、高壓擠壓 或溶菌酶處理（以分解肽聚糖）。或溶菌酶處理（以分解肽聚糖）。 細(xì)胞器的分離細(xì)胞器的分離 細(xì)胞器包括細(xì)胞核、線(xiàn)粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞器包括細(xì)胞核、線(xiàn)粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)， 植物細(xì)胞還有葉綠體。植物細(xì)胞還有葉綠體。 如果要分離制備分布在這些細(xì)胞器中的生

54、物大分如果要分離制備分布在這些細(xì)胞器中的生物大分 子，為了防止其他細(xì)胞組分中的物質(zhì)對(duì)制備物的子，為了防止其他細(xì)胞組分中的物質(zhì)對(duì)制備物的 干擾或污染，還需先將細(xì)胞器分離出來(lái)，然后在干擾或污染，還需先將細(xì)胞器分離出來(lái)，然后在 某一細(xì)胞器中分離某一物質(zhì)。某一細(xì)胞器中分離某一物質(zhì)。 細(xì)胞器的分離一般采用差速離心法，即將破碎后細(xì)胞器的分離一般采用差速離心法，即將破碎后 的細(xì)胞在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中進(jìn)行離心，常用的介質(zhì)有的細(xì)胞在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中進(jìn)行離心，常用的介質(zhì)有 蔗糖、甘露醇、檸檬酸、聚乙二醇等。各種細(xì)胞蔗糖、甘露醇、檸檬酸、聚乙二醇等。各種細(xì)胞 組分按質(zhì)量大小的不同，經(jīng)過(guò)不同速度的離心后，組分按質(zhì)量大小的不同，

55、經(jīng)過(guò)不同速度的離心后， 沉降于離心管的不同部位，經(jīng)多次分步離心后，沉降于離心管的不同部位，經(jīng)多次分步離心后， 即可獲得所需組分。即可獲得所需組分。 四、提取四、提取 組織細(xì)胞破碎過(guò)程中，大量的胞內(nèi)酶組織細(xì)胞破碎過(guò)程中，大量的胞內(nèi)酶 及細(xì)胞內(nèi)含物被釋放出來(lái)，必須立即及細(xì)胞內(nèi)含物被釋放出來(lái)，必須立即 將其置于一定條件下和溶劑中，讓制將其置于一定條件下和溶劑中，讓制 備物充分溶解，并盡可能保持原來(lái)的備物充分溶解，并盡可能保持原來(lái)的 天然狀態(tài)，避免因長(zhǎng)久放置造成制備天然狀態(tài)，避免因長(zhǎng)久放置造成制備 物的分解破壞，這就是提取。物的分解破壞，這就是提取。 蛋白質(zhì)（酶）的提取蛋白質(zhì)（酶）的提取 大多數(shù)蛋白質(zhì)

56、均能溶于水、稀鹽、稀堿或稀大多數(shù)蛋白質(zhì)均能溶于水、稀鹽、稀堿或稀 酸溶液中，故蛋白質(zhì)的提取一般以水溶液提酸溶液中，故蛋白質(zhì)的提取一般以水溶液提 取為主。通常采用取為主。通常采用類(lèi)似生理?xiàng)l件類(lèi)似生理?xiàng)l件下的緩沖液，下的緩沖液， 如如20-50m mol/L20-50m mol/L的磷酸鹽緩沖液（的磷酸鹽緩沖液（pH7.0-pH7.0- 7.57.5）或）或0.1mol/L Tris-HCl0.1mol/L Tris-HCl（pH7.5-8.0pH7.5-8.0） 緩沖液作提取液。緩沖液作提取液。 對(duì)于一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極對(duì)于一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極 性較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽、稀性較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽、稀 堿、稀酸，常在提取液中加入適量的有機(jī)溶堿、稀酸，常在提取液中加入適量的有機(jī)溶 劑，如乙醇、丙酮、異丙醇、正丁醇等。劑，如乙醇、丙酮、異丙醇、正丁醇等。 分離純化分離純化 從細(xì)胞中提取得到的生物大分子往往是從細(xì)胞中提取得到的生物大分子往往是 不純凈的，含有大量雜質(zhì)，必須進(jìn)一步不純凈的，含有大量雜質(zhì)，必須進(jìn)一步 分離純化，這一階段可分為粗分級(jí)分離分離純化，這一階段可分為粗分級(jí)分離 和細(xì)分級(jí)分離兩步進(jìn)行。和細(xì)分級(jí)分離兩步進(jìn)行。 蛋白質(zhì)（酶）的分離純化蛋白質(zhì)（酶）的分離純化 蛋白質(zhì)分離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋白分子