離子通道課件

1、植物細(xì)胞離子通道 植物根系不僅從土壤中吸收水分，還要吸收各種礦質(zhì) 元素，以維持正常的生命活動(dòng)，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育目 的獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì) 如：小麥、水稻、玉米、煙草、蔬菜 、水果等 植物吸收礦質(zhì)元素首先細(xì)胞從環(huán)境中吸收，這個(gè)環(huán)境可 以是植物的生存外部環(huán)境，如土壤，也以是植物本身的 內(nèi)部環(huán)境 肥料離子吸附交換細(xì)胞 被動(dòng)吸收：外液濃度細(xì)胞濃度 吸收 主動(dòng)吸收：外液濃度細(xì)胞濃度 吸收 積累離子 被動(dòng)吸收： 擴(kuò)散作用：指分子或離子沿著化學(xué)勢(shì)梯度或電化學(xué)勢(shì) 梯度轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象 楞思特方程式： 協(xié)助擴(kuò)散：指小分子物資經(jīng)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白順濃度梯度或電化學(xué)勢(shì)梯 度的轉(zhuǎn)運(yùn) 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：膜上具有轉(zhuǎn)運(yùn)功能的蛋白質(zhì)又稱(chēng)傳遞蛋白 分為二

2、類(lèi)：載體蛋白 通道蛋白 載體蛋白：是一類(lèi)內(nèi)部蛋白，由載體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的物質(zhì)首先與載體 蛋白的活性部位結(jié)合，結(jié)合后載體蛋白發(fā)生構(gòu)象變化，被轉(zhuǎn)運(yùn)的物質(zhì) 釋放到細(xì)胞內(nèi)。 載體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)具有飽和現(xiàn)象。 通道蛋白：由細(xì)胞膜中一類(lèi)內(nèi)部蛋白構(gòu)成的孔道，或有的稱(chēng)膜中 由大分子組成的孔道 又叫離子通道?？杀换瘜W(xué)方式或電化學(xué)方式激活，控制離子順勢(shì)流 過(guò)細(xì)胞膜，在形成維持跨膜離子梯度和信號(hào)傳導(dǎo)等生理過(guò)程起重要作 用。 檢測(cè)：膜片鉗技術(shù) 取幾平方微米細(xì)胞膜或者全細(xì)胞膜，測(cè)定跨膜離子電流的大小，即 在保持跨膜電壓恒定的條件下，測(cè)定通過(guò)膜上離子通道的離子流大小 。 其原理，歐姆定律 ： 分析膜上的離子通道，細(xì)胞間的離子運(yùn)輸

3、，氣孔運(yùn)動(dòng)，光受體， 激素受體，及信號(hào)傳導(dǎo)，廣泛應(yīng)用。 細(xì)胞壁 液泡 葉綠體 植物細(xì)胞膜系統(tǒng) 質(zhì)膜 葉綠體、線(xiàn)粒體 等其他細(xì)胞器膜 液泡膜 植物吸收離子涉及到質(zhì)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為 兩類(lèi)： 載體蛋白也稱(chēng)載體或轉(zhuǎn)運(yùn)體。它與特定的離子結(jié)合，發(fā) 生構(gòu)象變化，把離子轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)膜。 通道蛋白也稱(chēng)離子通道是由膜中大分子組成的孔道或是 由膜中一類(lèi)內(nèi)在蛋白組成的孔道。當(dāng)這些通道打開(kāi)時(shí)，準(zhǔn) 許特定的離子跨膜通過(guò)。 植物離子通道的概念植物離子通道的概念 1. 離子轉(zhuǎn)運(yùn)的被動(dòng)性 2. 離子的選擇性和導(dǎo)度(離子導(dǎo)度：離子跨暯的能力，電阻的 倒數(shù)，反應(yīng)通過(guò)離子通道通過(guò)離子多少。 ) 3. 通道門(mén)控特性 4. 離子

4、轉(zhuǎn)運(yùn)的高效性 5. 飽和現(xiàn)象 （離子跨膜運(yùn)輸可 分 為被動(dòng)運(yùn)輸和主動(dòng)運(yùn)輸 兩類(lèi)。由 擴(kuò)散作用或物理 過(guò)程所決定的運(yùn)輸屬于被動(dòng)運(yùn) 輸；逆濃度梯度或電位梯度 運(yùn)輸 ，需要消耗能量屬于主 動(dòng)運(yùn)輸。離子通道 與載體蛋白都能準(zhǔn)許離子沿濃度梯度或 電勢(shì)梯度擴(kuò)散，但二者的轉(zhuǎn)運(yùn)離子的速度有明顯差異。載 體蛋白每秒可轉(zhuǎn)運(yùn)104-105個(gè)離子，轉(zhuǎn)運(yùn)效率低，而離子通 道秒可轉(zhuǎn)運(yùn)106-107個(gè)離子，高出1001000倍，轉(zhuǎn)運(yùn)效率 高。原因：經(jīng)載體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)離子需要與特定的離子結(jié)合， 結(jié)合的部位數(shù)量有限，具有飽和現(xiàn)象，而離子通道則沒(méi) 有。） 植物離子通道的特點(diǎn)植物離子通道的特點(diǎn) 根據(jù)影響離子通道開(kāi)放的條件可將離子通道分

5、為三大類(lèi): ( 1) 電壓依賴(lài)性: 這種離子通道的開(kāi)啟和關(guān)閉狀態(tài)取決于膜電位的電 壓。細(xì)胞內(nèi)鈉、鉀、鈣、氯通道都屬于電壓依賴(lài)性通道。 ( 2) 配體門(mén)控性: 這種離子通道的開(kāi)啟和關(guān)閉取決于各種遞質(zhì)與通 道上受體的結(jié)合狀態(tài)。例如神經(jīng)細(xì)胞膜上的乙酰膽堿受體通道, 該 通道的遞質(zhì)為乙酰膽堿, 其與特異性受體結(jié)合時(shí)則通道開(kāi)放, 解離時(shí) 則關(guān)閉。 ( 3) 機(jī)械敏感性: 由細(xì)胞膜表面的應(yīng)力變化控制通道的開(kāi)放與關(guān)閉 狀態(tài)。 其中以電壓依賴(lài)性通道最常見(jiàn) 根據(jù)生物學(xué)功能的特性將離子通道分為三類(lèi): ( 1) 電壓門(mén)控的離子通道,包括Na+、K+、Ca2+ 通道等; ( 2) 受體激活的離子通道, 包括神經(jīng)遞質(zhì)、

6、激素等外源 性化學(xué)物質(zhì)以及機(jī)械和滲透壓力刺激所激活的離子通 道; ( 3) 第二信使激活的離子通道, 包括由細(xì)胞內(nèi)Ca2+、 IP3、G 蛋白及蛋白激酶激活的離子通道。 自從在蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)植物離子通道以來(lái)，人們對(duì)植物細(xì) 胞乃至作為細(xì)胞器的液泡膜上離子通道的認(rèn)識(shí)迅速深入,到目前為 止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)植物細(xì)胞及其內(nèi)膜上存在多種離子通道。 陰離子通道 陽(yáng)離子通道 植物細(xì)胞離子通道 質(zhì)膜上的離子通道 其他細(xì)胞器膜上的離子通道 液泡膜上的離子通道 陰離子通道 K+通道 內(nèi)向整流通道通道 : K+in 外向整流通道通道 ：K+out Ca2+通道道 Cl- , NO3- 1.慢流動(dòng)型通道(SV型) 對(duì)陽(yáng)

7、離子具有選擇性,許多一價(jià)陽(yáng)離子( K+ , Na+ , Cs+ ) 和二價(jià)陽(yáng)離子(Ca2 + , Mg2 + , Ba2+ ) 都可通過(guò)此通道，而且Cl - 也能極少 量的通過(guò)。 2.快流動(dòng)型通道(FV型) 具有電壓依賴(lài)性,對(duì)陽(yáng)離子具有選擇性。 3.鉀離子通道(VK) 與FV型通道類(lèi)似,VK通道是一種不連續(xù)的瞬 間激活的通道。它不具有電壓依賴(lài)性,這是 該通道與FV 通道的最大區(qū)別。 5. 陰離子通道 電壓激活的液泡鈣(VVCa) 通道 肌醇1 ,4 ,5-三磷酸( IP3) 門(mén)控的鈣通道 cADPR 門(mén)控的液泡通道 4. 鈣離子(VCa) 通道 蘋(píng)果酸(VMAL) 通道 氯離子(VCl) 通道

8、 內(nèi)向型K+通道AKT1結(jié)構(gòu)模型示意圖 具有6個(gè)保守的跨膜結(jié)構(gòu)域，其中S4結(jié)構(gòu)域具有電壓 感應(yīng)作用，S5與S6之間有一個(gè)形狀如發(fā)卡的疏水區(qū)域，這 個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域構(gòu)成離子通道的孔道部分，具有結(jié)合離子的位 點(diǎn)。 鈣離子通道調(diào)節(jié)細(xì)胞生理活動(dòng)的模型 1.離子的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn) 研究K離子吸收有二 種途徑： 高親和性 K離子吸收途徑,一般濃度為1200molL-1范 圍內(nèi)起作用 低親和性K離子吸收途，一般濃度為110molL-1范圍 內(nèi) 起作用徑 2.滲透和代謝調(diào)節(jié), 例如，氣孔運(yùn)動(dòng) 3.信號(hào)傳導(dǎo)， 例如，鈣離子是細(xì)胞中重要的第二信使之一 4.調(diào)節(jié)膜電位，例如，植物細(xì)胞的動(dòng)作電位 5.決定細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)方向，鈣

9、離子通道能調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和 生長(zhǎng)。植物體內(nèi)的離子通道參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育衰老死亡的全過(guò)程。 保衛(wèi)細(xì)胞離子通道參與了ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程 離子通道分子水平的研究概況離子通道分子水平的研究概況 KATI：從擬南芥中鑒定出來(lái)的鉀離子運(yùn)輸?shù)鞍祝请妷阂蕾?lài)型內(nèi)向性通道， 在擬南芥保衛(wèi)細(xì)胞和莖根的維管組織中表達(dá)，參與氣孔開(kāi)發(fā)，并向維管組織中 轉(zhuǎn)運(yùn)鉀離子，不能從土壤中吸收鉀離子。擬南芥中的KATI可編碼667個(gè)AA, 分子 量為79KD. AKTI：從效母突變體中采用互補(bǔ)法篩選出來(lái)。在根組織中表達(dá)，能從土壤 中吸收鉀離子，可編碼856個(gè)AA, 分子量為97KD. 這兩個(gè)基因已導(dǎo)入水稻和煙草,具有較強(qiáng)吸收鉀離子能力

10、. KCOI：從擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出來(lái)的外向型鉀離子通道，轉(zhuǎn)運(yùn)鉀離子時(shí)依賴(lài) 胞質(zhì)中鈣離子，在植物各個(gè)部位均有表達(dá)，在亞細(xì)胞水平上在液泡暯上。 LKTI：從西紅柿根毛特化的cDNA 庫(kù)克隆出來(lái)，LKTI 的 m RNA 在 根中表達(dá)。 ZMK1 和 ZMK2：從玉米胚芽鞘中分離的鉀離子通道基因，ZMK1在外部酸性 化時(shí)激活 Kin通道，ZMK2電壓依賴(lài)型。 TaAKTI：從小麥根中分離的，具有與擬南芥KATI氨基酸順序76%， 屬于Kin通道。 AtKUPI： 該基因是通過(guò)校母突變體 互補(bǔ)性分析得到的，呈現(xiàn) “兩 相” 形式，從高親和相Km 為44M性到低親合相Km值為11mM 性的轉(zhuǎn)變范圍在1

11、00200M外界鉀離子濃度.高低和 親系統(tǒng)受到 5mM 和更高濃度的抑制.也受到鉀離子通道阻斷劑的抑制,在根中表達(dá), 不同鉀含量的土壤中吸收鉀. 木質(zhì)部壁細(xì)胞含有3個(gè)陽(yáng)離子通道： KORC： 為外向型鉀離子通道, 調(diào)節(jié)鉀從木質(zhì)部壁細(xì)胞釋放到導(dǎo)管 中. KIRC：為內(nèi)向型鉀離子通道,調(diào)節(jié)鉀從木質(zhì)部轉(zhuǎn)移到周?chē)诩?xì)胞重 新吸收 NORC： 非選擇性外向整流陽(yáng)離子通道，能把鹽分釋放到木質(zhì)部的 導(dǎo)管，還負(fù)責(zé)電信號(hào)和水力學(xué)信號(hào)的傳導(dǎo)。 離子通道問(wèn)題和展望離子通道問(wèn)題和展望 生理作用 調(diào)控的分子機(jī)理 基因的轉(zhuǎn)化和應(yīng)用 電壓鉗技術(shù)示意圖 電壓鉗技術(shù)是通過(guò)向細(xì)胞內(nèi)注射一定的電流, 抵消離子通道開(kāi)放時(shí)所產(chǎn)生 的離

12、子流, 從而使細(xì)胞膜電位固定在某一數(shù)值. 由于注射的電流與離子流大小相 等、方向相反, 因此它可以反映離子流的大小和方向. 電壓鉗技術(shù)是一種研究可 興奮細(xì)胞電生理特征的基本手段和方法, 但在應(yīng)用上具有其局限性: 1) 雙微電極鉗位法只適用于巨大的神經(jīng)軸突、肌肉纖維和卵母細(xì)胞等較大 的細(xì)胞, 對(duì)于直徑小于10 微米的細(xì)胞, 胞內(nèi)插入兩根電極就很困難, 雖然此時(shí)可 用單根吸附電極進(jìn)行電壓鉗位, 但是對(duì)細(xì)胞膜的損傷也不可避免; 2) 只能采用全細(xì)胞記錄模式, 記錄到的是整個(gè)細(xì)胞膜上所有開(kāi)放通道的電 流總和, 無(wú)法了解單通道電流的情況; 3) 由于電壓鉗微電極尖端很細(xì)( 電阻大) , 會(huì)影響記錄電流的

13、能力。 膜片鉗技術(shù)是用微玻管電極膜片電極或膜片吸管接觸細(xì)胞膜, 以千兆 歐姆以上的阻抗使之封接, 使與電極尖開(kāi)口處相接的細(xì)胞膜的小區(qū)域膜片 與其周?chē)陔妼W(xué)上分隔, 在此基礎(chǔ)上固定電位, 對(duì)此膜片上的離子通道的 離子電流（pA級(jí)）進(jìn)行監(jiān)測(cè)記錄的方法. 單通道記錄法（Single channel mode）:細(xì)胞吸附式(Cell-attached mode)、膜內(nèi)面向外 Inside - out）、膜外面向外(Outside-out)、開(kāi)放的細(xì)胞吸附式膜內(nèi)面向外(Open cell-attached inside-out mode)和穿孔囊泡膜外面向外（Perforated-vesicle out

14、side-out mode）; 全細(xì)胞模式記錄法（Whole-cell mode）:孔細(xì)胞模式(Hole cell mode)、穿孔膜片模式 (Perforated patch mode)或制真菌素膜片模(Nystatin patch mode)，也稱(chēng)緩慢全細(xì)胞模式（Slow whole-cell mode ）。 全細(xì) 胞鉀 離子 通道 電流 單通 道記 錄鈣 離子 通道 電流 拋光儀拉制儀 顯微鏡操作系統(tǒng)及可見(jiàn)光源 膜片鉗放大器、操作系統(tǒng) 冷光源 低溫水浴搖床 要根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)栽培材料。 根細(xì)胞：通常根長(zhǎng)度在2厘米左右，但突變體要 根據(jù)該基因起作用的發(fā)育階段來(lái)確定； 保衛(wèi)細(xì)胞：通常在土

15、壤中生長(zhǎng)4-6周，但絕不能 抽苔；葉肉細(xì)胞對(duì)光照要求較高，因?yàn)楣庹罩?接影響葉綠體的活動(dòng)。 蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞鉀通道實(shí)驗(yàn)溶液蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞鉀通道實(shí)驗(yàn)溶液 （1）基本緩沖液：KCl 50mmol/L、Mes 10mmol/L、pH6.1(KOH) （2）基本介質(zhì)：甘露醇0.45mol/L、CaCl2 0.5mmol/L、MgCl2 0.5mmol/L、抗壞血酸 0.5mmol/L、KH2PO4 10mol/L、Mes 10mmol/L、pH5.5(KOH)。 （3）第一酶液：Cellulysin 0.7%、PVP-40 0.1%、牛血清白蛋白 （BSA）0.25%，溶于45%的基本介質(zhì)中。 （4）第二酶

16、液：Cellulase RS 1.2%、Pectolyase Y-23 0.01%、BSA 0.25%、抗壞血酸 0.5mmol/L，溶于45%的基本介質(zhì)中。 （5）細(xì)胞外液：谷氨酸鉀 10mmol/L、MgCl2 2mmol/L、CaCl2 1mmol/L、KOH 1mmol/L、Mes 10mmol/L、pH5.5(KOH)，用甘 露醇調(diào)節(jié)滲透壓為460mOmol/Kg。 （6）電極溶液：谷氨酸鉀 100mmol/L、MgCl2 2mmol/L、KOH 4mmol/L、MgATP 1.1mmol/L、CaCl2 0.1mmol/L、Hepes 10mmol/L、pH7.2 (KOH), 用

17、甘露醇調(diào)節(jié)滲透壓為510mOmol/Kg 。 （1）在28、60轉(zhuǎn)/分的搖床上用酶解液解離0.5-2小 時(shí)左右，根據(jù)不同消化時(shí)間的細(xì)胞狀態(tài)判斷消化程度， 在顯微鏡下清晰地看到游離 細(xì)胞。 （2）用200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，基本介質(zhì)沖洗后60g離心7- 10分鐘，棄去上清液，再用50基本介質(zhì)洗滌2-3次， 最后將原生質(zhì)懸浮于溶液中，04靜置恢復(fù)。 原生質(zhì)體的制備 （1）玻璃微電極使用硬質(zhì)有芯玻璃毛細(xì)管在拉制儀 （PC-10,Narishige）上拉制，實(shí)驗(yàn)前用拋光儀（MF- 900，Narishige）進(jìn)行拋光。 （2）通過(guò)顯微操作系統(tǒng)將電極在加正壓情況下輕微壓在 細(xì)胞上，再加以負(fù)壓使電極尖端與細(xì)胞膜

18、形成高阻封接。 一般情況下，高阻封接在1-3G之間，刺激電壓從- 190mV逐級(jí)去極化到+110mV，每級(jí)為+20mV，維持時(shí) 間3秒，頻率為0.2Hz。全細(xì)胞封接形成10分鐘后采集數(shù) 據(jù)。 膜片鉗實(shí)驗(yàn) 0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.5 -200 -160 -120 -80 -40 0 40 80 120 +90mV -170mV -190mV A Voltage(mV) Time(min) 0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.5 -1000 -800 -600 -400 -200 0 200 400 600 B Current(pA) Time(min) 0.00.51.01.52.02.53.03.54.0 -1200 -1000 -800 -600 -400 -200 0 200 400 B Current(pA) Time(min) 膜電流：膜電流：指流過(guò)細(xì)胞膜上所有活動(dòng)性離子通道的復(fù)合電流。 濃度梯度：濃度梯度：膜兩側(cè)離子的濃度差，即化學(xué)勢(shì)梯度。 電位差：電位差：即電勢(shì)差，跨過(guò)膜的電位差。 平衡電位：平衡電位：離子跨膜