免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課：五年制實(shí)驗(yàn)課 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

1、 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA(ELISA直接法直接法) ) 一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( (ELISA) ELISA) 直接法直接法- -測(cè)酶標(biāo)抗體的效價(jià)測(cè)酶標(biāo)抗體的效價(jià) 二、免疫標(biāo)記技術(shù)的基本原理、類(lèi)型二、免疫標(biāo)記技術(shù)的基本原理、類(lèi)型 及應(yīng)用及應(yīng)用 掌握掌握ELISAELISA直接法的操作過(guò)程。直接法的操作過(guò)程。 l 掌握免疫標(biāo)記技術(shù)的分類(lèi)、原理及應(yīng)用。掌握免疫標(biāo)記技術(shù)的分類(lèi)、原理及應(yīng)用。 包被抗原包被抗原 1.1.包被：包被：用用0.050.05M PH9.M PH9.6 6碳酸鹽包被緩沖液將抗原碳酸鹽包被緩沖液將抗原( (正常兔血清正常兔血清) )稀釋至

2、蛋白質(zhì)含稀釋至蛋白質(zhì)含 量為量為1010 g gmlml。100 100 l/welll/well加入聚苯乙烯板酶標(biāo)板中加入聚苯乙烯板酶標(biāo)板中，4 over night4 over night。次。次 日，棄去孔內(nèi)溶液。日，棄去孔內(nèi)溶液。 2.2.封閉：封閉：150 150 l/welll/well封閉液封閉液, 43 40min, 43 40min，棄去封閉液。，棄去封閉液。 3.3.加樣：加樣：加倍比稀釋的酶標(biāo)抗體加倍比稀釋的酶標(biāo)抗體 ( (羊抗兔羊抗兔IgG)IgG)，100100 l/well l/well 分別加到對(duì)應(yīng)的板分別加到對(duì)應(yīng)的板 孔內(nèi)，置孔內(nèi)，置4343孵育孵育40mins

3、40mins。洗板三次，每次。洗板三次，每次3 3分鐘。分鐘。稀釋方法與加板方法見(jiàn)后稀釋方法與加板方法見(jiàn)后 4.4.加底物液顯色：加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入新鮮配制的于各反應(yīng)孔中加入新鮮配制的OPDOPD底物溶液底物溶液100 100 l/welll/well，室室 溫下避光顯色。溫下避光顯色。 5.5.終止反應(yīng)：終止反應(yīng)：加加50 50 l/welll/well2N 2N 硫酸硫酸( (終止液終止液) )。( (改變改變PHPH值值) ) 6.6.結(jié)果判定：結(jié)果判定：與陰性對(duì)照孔相比有明顯呈色反應(yīng)的為陽(yáng)性孔，相對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)抗與陰性對(duì)照孔相比有明顯呈色反應(yīng)的為陽(yáng)性孔，相對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)抗 體的稀釋

4、度為該抗體的效價(jià)。體的稀釋度為該抗體的效價(jià)。 500 l 樣品稀釋液樣品稀釋液 女 女 500 l E-Ab 第第8列：陰性對(duì)照（列：陰性對(duì)照（Ag+/Ab-）第第9列：陰性對(duì)照（列：陰性對(duì)照（Ag-/Ab+） 第第10列：空白對(duì)照列：空白對(duì)照（Ag-/Ab-） 1.準(zhǔn)備6個(gè)稀釋管，做好標(biāo)記。 2.先在每個(gè)稀釋管中加入稀釋液 500ul。 3.取500ul抗體加入第一管，混 勻后，取出500ul加入第二管， 依此類(lèi)推至最后管。 PBS 1:1 1:21:41:81:161:32 1:64 1:1 抗體起始濃度抗體起始濃度 1:1000 Coating Blocking EE E After blo